一种基于响应面-神经网络的西兰花异硫氰酸酯提取工艺优化方法

本发明涉及天然活性成分提取优化，更具体的说是涉及一种基于响应面-神经网络的西兰花异硫氰酸酯提取工艺优化方法。

背景技术：

1、畜禽养殖过程中，热应激、高精料日粮及病原体感染等因素极易打破动物机体氧化还原平衡，诱导氧化应激发生，进而干扰营养物质消化吸收、降低饲料利用率，影响畜产品品质。开发来源安全、作用机制清晰的天然抗氧化剂已成为当前畜牧业领域的重要研究方向。

2、西兰花（brassicaoleraceal.var.italicaplenck）中的异硫氰酸酯（isothiocyanates，itcs），是硫代葡萄糖苷（glucosinolates，gsls）经黑芥子酶水解后生成的天然抗氧化物质，是一类多功能天然活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗微生物等多种功效。优化适用性强、效率高的西兰花itcs提取工艺，对于天然抗氧化饲料添加剂的开发具有重要意义。

3、工艺优化通常依赖于先进的建模方法，揭示变量间的复杂关系。最常用的两种建模方法是响应面模型（rsm）和人工神经网络（ann）。响应面法（response surfacemethodology，rsm）为多参数优化的经典统计方法，能够通过建立数学模型分析各因素之间的交互作用，从而获得最佳工艺参数。然而，响应面法为多参数优化经典统计方法，可构建二次回归方程解析因素主效应与交互作用，但该方法对复杂非线性映射关系拟合能力存在显著局限；人工神经网络无需预设函数形式，非线性拟合精度高，但模型可解释性差，单独使用易陷入局部最优，缺少统计学支撑。现有单一优化模型存在预测误差大、寻优精度不足的缺陷，难以兼顾工艺规律解析与最优参数精准预测双重需求。

4、在西兰花itcs的提取过程中，目标产物itcs的释放与转化面临双重制约：一方面，其前体物质gsls化学稳定性较差，极易受热、光照及金属离子等环境因素影响而发生降解；另一方面，催化gsls水解的黑芥子酶活性受ph、温度及内源抑制剂等多重因素显著调控，导致酶解效率波动较大，加之该内源酶在冻干预处理过程中部分失活，进一步限制了itcs的高效转化。上述实验层面的瓶颈对工艺优化方法提出了更高要求，然而现有研究在方法学上存在明显局限：rsm优化多局限于单一提取阶段（如仅优化乙醇浓度或仅优化酶解时间），未能建立酶解与提取的耦合过程模型，难以反映多因素交互作用下itcs生成的真实规律；ann优化则普遍直接套用通用网络架构与训练参数，未针对boxbehnken设计等小样本实验数据进行网络深度、激活函数及训练策略的适配性筛选，导致模型过拟合风险显著升高、泛化能力不足。因此，如何构建一种融合响应面与神经网络优势的西兰花itcs提取工艺耦合优化方法，已成为提升itcs得率与工艺稳健性亟待解决的关键科学问题。如何提供一种基于响应面-神经网络的西兰花异硫氰酸酯提取工艺优化方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于响应面-神经网络的西兰花异硫氰酸酯提取工艺优化方法，旨在解决上述技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种基于响应面-神经网络的西兰花异硫氰酸酯提取工艺优化方法，包括以下步骤：

4、s1、将西兰花冷冻干燥后粉碎过筛得到西兰花粉；以白芥籽为原料制备外源黑芥子酶粗酶液，并测定黑芥子酶活性；

5、s2、称取西兰花粉，加入磷酸缓冲液与外源黑芥子酶溶液，在30~50℃水浴酶解1~3h，再加入75%乙醇溶液振荡提取，离心后取上清液经滤膜过滤，得到异硫氰酸酯粗提液；

6、s3、配制异硫氰酸酯标准溶液并绘制标准曲线，采用239nm、249nm、259nm三波长校正法计算校正吸光度，结合标准曲线测定粗提液中异硫氰酸酯浓度，计算得到异硫氰酸酯提取量；

7、s4、确定最优料液比，筛选出外源酶添加量、酶解温度、酶解时间三个核心优化因素；

8、s5、以box-behnken设计构建二次回归模型，因素水平为：外源酶添加量6~10ml、酶解温度30~50℃、酶解时间1.5~2.5h，分析各因素的主效应与交互作用，得到响应面模型预测的理论最优工艺参数；

9、s6、基于box-behnken响应面试验数据，构建输入层3个神经元、隐含层7~12个神经元、输出层1个神经元的三层前馈bp神经网络，将试验数据划分为训练集、验证集与测试集完成网络训练，得到异硫氰酸酯提取量的神经网络预测模型；

10、s7、以最大化异硫氰酸酯提取量为目标，将bp神经网络预测值作为遗传算法适应度函数进行全局寻优，得到最优提取工艺参数；

11、s8、对寻优得到的最优提取工艺进行多批次平行验证试验，同时测定所得异硫氰酸酯提取物的体外抗氧化活性。

12、进一步的，所述s1中外源黑芥子酶溶液的制备与酶活测定具体为：

13、取新鲜白芥籽粉碎过筛，称取5g芥籽粉加入250ml预冷的0.1mol/l、ph6.5磷酸缓冲液，冰浴条件下超声处理15min，5000r/min离心10min，收集上清液得到外源黑芥子酶溶液；

14、黑芥子酶活性测定方法为：取1g冷冻芥籽粉末，加入6ml预冷的0.1mol/l、ph6.5磷酸盐缓冲液研磨匀浆，4℃、12000r/min离心15min得到粗酶液；取250μl粗酶液与等体积2mmol/l黑芥子硫苷酸钾溶液混合，37℃水浴反应15min，沸水浴加热5min终止反应，采用葡萄糖检测试剂盒于510nm处测定吸光度；酶活力单位u定义为每分钟催化生成1μmol葡萄糖所需的酶量；

15、制备得到的外源黑芥子酶活性为0.984u/gfw，最适ph为6.5，最适温度为40℃，40℃以下可保持较高活性，超过70℃时酶活迅速丧失。

16、进一步的，所述s2具体为：准确称取0.5g西兰花粉置于烧杯中，加入2ml 0.1mol/l、ph6.5的磷酸缓冲液与定量外源黑芥子酶溶液，水浴酶解后，按照1:20的料液比加入75%乙醇溶液，振荡提取30min，5000r/min离心10min，取上层清液过0.45μm滤膜，得到异硫氰酸酯粗提液。

17、进一步的，所述s3具体为：

18、精密称取异硫氰酸酯标准品，用无水乙醇溶解配制1mg/ml的母液，梯度稀释得到5、10、20、40、80μg/ml的系列标准工作液；于249nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=0.0097x+0.2178，决定系数r²=0.9991；

19、校正吸光度计算公式为：

20、，

21、异硫氰酸酯提取量计算公式为：

22、，

23、式中，c为异硫氰酸酯粗提液的浓度，单位为μg/ml；v为异硫氰酸酯滤液体积，单位为ml；m为西兰花粉的质量，单位为g。

24、进一步的，所述s4中单因素试验的因素水平设置为：料液比设置为1:8、1:12、1:16、1:20、1:24、1:28 g/ml；外源酶添加量设置为2、4、6、8、10、12ml；酶解温度设置为20、30、40、50、60、70℃；酶解时间设置为0.5、1、1.5、2、2.5、3h；经试验确定最优料液比为1:20 g/ml，筛选出外源酶添加量、酶解温度、酶解时间作为后续优化的三个核心因素。

25、进一步的，所述s5具体为：

26、设置box-behnken试验的因素与水平：外源酶添加量a，-1水平为6ml、0水平为8ml、1水平为10ml；酶解温度b，-1水平为30℃、0水平为40℃、1水平为50℃；酶解时间c，-1水平为1.5h、0水平为2h、1水平为2.5h；共设计17组试验，以异硫氰酸酯提取量y为响应值；

27、拟合得到二次回归方程：

28、y=11.432+2.037a+0.178b+7.172c0.004ab0.123ac+0.026bc0.100a²0.002b²1.743c²，

29、模型决定系数r²为0.9758，调整后决定系数adjr²为0.9446，adeq precision为16.9486。

30、进一步的，所述s6具体为：

31、构建的bp神经网络为三层前馈网络结构，输入层包含3个神经元，分别对应外源酶添加量、酶解温度、酶解时间；输出层包含1个神经元，对应异硫氰酸酯提取量；经试错法筛选确定隐含层节点数为10，网络结构为3-10-1；

32、网络训练采用levenberg–marquardt算法，激活函数选用sigmoid函数；将17组试验数据划分为训练集、验证集、测试集。

33、进一步的，所述s7中遗传算法的参数设置为：种群规模30~100，交叉概率0.6~0.9，变异概率0.05~0.2，最大迭代次数100~500，以最大化异硫氰酸酯提取量为寻优目标。

34、进一步的，所述s8中工艺验证具体为：分别采用响应面模型最优工艺与神经网络-遗传算法最优工艺进行3次平行提取试验；响应面模型最优工艺的实测提取量为7.73±0.12mg/g，相对误差为3.65%；神经网络-遗传算法最优工艺的实测提取量为7.84±0.11mg/g，相对误差为2.49%。

35、进一步的，所述s8中体外抗氧化活性测定包括dpph自由基清除能力测定与总抗氧化能力测定：

36、dpph自由基清除能力测定：配制质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml的异硫氰酸酯溶液，以同浓度维生素c为阳性对照；配制0.04g/l的dpph无水乙醇储备液；反应体系包含1ml样品溶液、1ml dpph储备液与1ml无水乙醇，避光恒温反应30min后于517nm处测定吸光度，计算自由基清除率；

37、总抗氧化能力测定：采用frap法试剂盒测定不同质量浓度异硫氰酸酯溶液的总抗氧化能力，总抗氧化能力随浓度升高呈上升趋势，质量浓度为0.6mg/ml时总抗氧化能力达到0.76mmol/l。

38、相较于现有技术，本发明进行了单因子实验以识别影响itcs的提取关键变量，随后采用box-behnken设计，以建模和优化包括料液比、黑芥子酶添加量、酶解时间和酶解温度等关键参数。同时，基于相同实验数据构建并训练了一个ann模型，以比较rsm的预测准确性和优化性能。最终验证了itcs的提取工艺并评估了抗氧化特性。本发明为优化西兰花中itcs的提取工艺提供了一套集成建模方法，为绿色天然抗氧化饲料添加剂的研发提供理论支持。