一种具有抗血栓活性的生物复合物及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，特别是涉及一种具有抗血栓活性的生物复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、血栓性疾病是由遗传与环境因素相互作用影响的具有多因素变化的疾病，具有发病率高、发病年轻化、症状重、易复发及家族遗传性等临床特点。其中，脑卒中，又称“脑中风”，是因脑血管或血流异常引发脑损伤的血栓性疾病，其致残率和致死率较高，预后不良。临床上表现为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中患者约占脑卒中患者总数的87%，且呈急速递增趋势，已成为威胁全球人类生命健康的第二大疾病。目前临床治疗脑卒中的主要途径是恢复患者缺血部位供血能力、减轻脑损伤程度、促进机能恢复及改善长期预后，但因患者机体溶血和凝血系统的动态平衡及个体差异性，易引发脑出血和脑血管再栓塞等并发症。作为至今唯一被fda批准用于治疗急性缺血性脑卒中的纤溶酶原激活剂，阿替普酶因其治疗时间窗窄（3 h内有效）和严格禁忌证，导致患者的临床治疗率仅为5%左右，即使患者溶栓后仍将面临严重或致命的脑出血和再栓塞风险。因此，研发以凝血过程中特定凝血因子或凝血环节为特异性靶点的新型抗凝溶栓药是目前治疗脑卒中的新策略。

2、随着现代医学对脑卒中血栓形成机制及发病前状态的相关指标变化的深入研究，中药在抗血栓领域发挥了独特优势，为临床治疗提供了新的治疗思路。同时智能纳米递药系统的发展为脑卒中的治疗带来新契机，因此开发脑血栓靶向、定位释药，多位点协同，降低脑血栓出血和再栓塞的风险，可开辟当前新药研发的新路径。

3、根据《本草纲目》记载，传统中药动物药—蝮蛇具有祛风、通络、止痹、镇痛攻毒之功效。蛇毒同样具有重要的医疗价值，可应用于抗凝血、抗血栓、止血、镇痛及抗肿瘤等方面。1767年fontana首次报道了蛇毒的凝血和抗凝作用，1967年esnouf首先在马来西亚红口蝮蛇蛇毒中分离纯化了具有抗凝抗栓作用的类凝血酶，即ancrod。作为类凝血酶代表，江浙蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶（arginine，arg；药品名：蝮蛇抗栓酶）具有以下特点：①纤维蛋白降解活性，抑制血栓形成；②诱发组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂的释放，减弱纤维蛋白溶解酶原激活剂的抑制因子的活性，促使纤维蛋白溶解；③降低血液黏度，增加血液流动性，延长凝血酶原时间和凝血时间；④降低血管阻力，改善微循环；⑤对其他凝血因子及血小板数量无明显影响。尽管蝮蛇抗栓酶的临床抗栓疗效显著，但作为传统中药动物药，天然蛇毒来源有限，其中的抗栓精氨酸酯酶含量较低，而且分离提纯成本高，难度大，使临床应用受限。因此有必要开发新的递药系统以实现arg的定位表达、凝集释药、示踪监测，从而提高靶区药物浓度，最终实现多位点协同作用，减少出血风险，增加疗效。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种具有抗血栓活性的生物复合物及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的生物复合物整体实现了精准靶向、高效溶栓、安全可控的多重技术效果，揭示了天然蛇毒等中药动物药可实现被开发可持续利用，具有极大的开发和应用前景。

2、本发明利用传统动中药动物药—蝮蛇蛇毒的精氨酸酯酶（arg），串联基因重组技术和智能纳米靶向技术，构建双重阶梯血栓靶向递药系统——一种具有抗血栓活性的生物复合物，实现arg重组基因在血栓部位的定位表达、凝集释药、示踪监测，提高靶区药物浓度，最终实现多位点协同作用，减少出血风险，增加疗效。本发明开发的双重靶向递药系统的构建思路如下：

3、本发明的靶向递药系统以rgd序列为核心靶向介质。rgd是纤维蛋白原的核心活性序列，可与血栓部位活化血小板膜上的gp iib/iiia受体特异性结合，且仅作用于病灶活化血小板，对正常循环血小板无影响。将rgd作为靶头修饰纳米载体，可精准靶向血栓部位，竞争性抑制血小板异常聚集，从源头减少血栓形成，大幅提升药物靶向性，降低溶栓治疗的出血并发症风险。

4、在基因靶向递药层面，本发明依托成熟的dna重组技术，可实现不同基因片段融合表达，制备多功能融合蛋白，为天然蛇毒这类稀缺动物药的开发利用提供新路径。本发明将具备血栓靶向性的rgd序列与蛇毒arg基因融合，同时引入特异性连接肽优化融合蛋白空间结构，保障蛋白生物活性。所选ile-glu-gly-arg序列可被血栓部位高活性、高富集的凝血因子活性形式xa (fxa)特异性识别切割，实现融合蛋白在血栓病灶的定点解离与药效释放，同时竞争性抑制凝血酶原激活，进一步阻断凝血瀑布反应。

5、为实现药物体内动态监测，本发明将标记蛋白（如egfp）编码基因接入重组基因序列，可实时追踪融合蛋白在体内外的转运、分布情况，精准验证药物靶向效果。

6、载体选择上，本发明摒弃了存在免疫原性、安全性隐患的病毒载体，选用peg化修饰的pamam聚酰胺-胺树状大分子作为非病毒纳米基因载体。该载体结构规整、粒径可控、官能团丰富，可有效包载arg重组质粒，避免dna被核酶降解，同时具备转染效率高、细胞毒性低的优势。通过在pamam载体表面接枝rgd肽，最终构建出兼具脑血栓靶向、病灶定位释药、实时示踪功能的双重阶梯靶向纳米基因递送系统，实现了蛇毒精氨酸酯酶精准、安全、高效的抗血栓治疗效果。

7、基于此，本发明提供了如下方案：

8、本发明提供一种具有抗血栓活性的生物复合物的制备方法，包括将表达融合蛋白的重组质粒与纳米载体rgd-mpeg-pamam进行混合反应，制备得到所述生物复合物的步骤；

9、所述融合蛋白依次包括rgd三肽、第一fxa识别位点、蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶和第二fxa识别位点。

10、进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

11、进一步地，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

12、进一步地，所述融合蛋白还包括标记蛋白。

13、进一步地，所述标记蛋白为荧光蛋白。

14、进一步地，所述荧光蛋白为egfp蛋白；所述egfp蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

15、进一步地，所述纳米载体rgd-mpeg-pamam的构建方法包括以下步骤：

16、将rgd三肽和mal-peg-nhs偶联，再接枝pamam，之后再用meo-peg-nhs进行进一步偶联反应，得到所述纳米载体rgd-mpeg-pamam。

17、本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的生物复合物。

18、本发明还提供上述的生物复合物在制备抗血栓药物中的应用。

19、本发明还提供一种抗血栓药物，活性成分包括上述的生物复合物

20、本发明公开了以下技术效果：

21、本发明构建的具有抗血栓活性的生物复合物，有效解决了传统溶栓药物靶向性弱、疗效有限、出血风险高的行业痛点。该生物复合物依托双重靶向机制，可精准富集于血栓病灶部位，大幅提升血栓区域药物有效浓度与利用效率，摆脱传统药物依赖提高用药剂量提升疗效的弊端。同时，依托血栓微环境特异性切割释药特性，药物仅在病灶部位发挥溶栓、抑凝双重作用，可有效阻断凝血瀑布反应，抑制血栓复发，显著提升抗栓治疗效果。该递药系统生物安全性优异，规避了病毒载体的免疫隐患，大幅降低全身性出血、过敏等并发症风险。此外，搭载的标记蛋白示踪模块可实现药物体内分布与靶向过程的动态可视化监测。本发明开发的生物复合物整体实现了精准靶向、高效溶栓、安全可控的多重技术效果，揭示了天然蛇毒等中药动物药可实现被开发可持续利用，具有极大的开发和应用前景。