一种负载PDRN的多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用

本发明属于生物医用材料，具体涉及一种负载pdrn的多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用，尤其涉及负载pdrn（多聚脱氧核糖核苷酸）的多肽自组装水凝胶在组织修复、药物缓释和医美领域的应用。

背景技术：

1、多肽自组装水凝胶是由多肽分子通过氢键、π-π堆积等非共价键自组装形成的具有三维网络结构的凝胶材料，因其良好的生物相容性、生物可降解性以及结构可调控性，在生物医学领域具有广阔的应用前景，可作为药物载体、细胞培养支架、组织修复材料等。

2、近年来，pdrn（多聚脱氧核糖核苷酸）作为一种从鱼类生殖细胞中提取的脱氧核苷酸混合物，因其与人类dna碱基相似度高达98%，具有良好的生物相容性和极低的免疫原性，在组织修复和再生医学领域受到广泛关注。研究表明，pdrn通过激活腺苷a2a受体促进血管内皮生长因子（vegf）表达、抑制炎症因子（如tnf-α和il-6），同时通过补救通路为受损细胞提供dna合成所必需的核苷酸前体，在皮肤创面修复、抗衰老及骨损伤修复等方面展现出良好的应用潜力。

3、尽管pdrn具有显著的促组织再生活性，但其临床应用仍面临若干技术瓶颈。首先，pdrn作为低分子量核酸片段，在生理环境中易被核酸酶快速降解，导致体内半衰期短、生物利用度低。其次，pdrn的局部给药缺乏有效的控释载体，难以在创面或损伤部位实现持续、稳定的释放。现有研究中，pdrn多采用溶液形式直接注射或将其负载于普通凝胶基质中外用，其疗效受到给药方式和药物稳定性的显著限制。而常规的凝胶基质本身往往不具备主动促进组织修复的生物活性，仅作为惰性载体使用；且缺乏对细胞微环境的主动调控能力，难以实现材料与生物活性分子的协同增效。

4、因此，有必要开发一种负载pdrn的多肽自组装水凝胶作为实现pdrn局部持续缓释的载体材料，以期实现pdrn的长期缓释与水凝胶湿性愈合微环境的协同增效。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种负载pdrn的多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用。

2、本发明将多肽与pdrn通过自组装技术构建复合水凝胶，旨在开发一种兼具仿生支架功能与主动促修复活性的新型生物材料。该体系利用多肽自组装形成的三维纳米纤维网络，模拟天然细胞外基质的微观结构，为细胞黏附、增殖与分化提供适宜的微环境；同时，借助多肽与pdrn之间的分子间非共价相互作用，实现pdrn的高效负载与缓释，从而有效克服其易降解、体内半衰期短的局限性。该复合水凝胶将多肽支架的结构支撑作用与pdrn的促血管生成、促胶原沉积及抗炎等多重生物学功能有机结合，二者协同增效，有望显著提升组织修复与再生效率，为创面愈合、软组织缺损修复等领域提供一种具有转化应用前景的新型复合材料。本发明提供的负载pdrn的多肽自组装水凝胶适用于药物递送、组织工程支架等生物医学相关应用场景。

3、技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、本发明提供了一种负载pdrn的多肽自组装水凝胶，所述水凝胶由多肽自组装形成的三维网络结构以及分散于其中的pdrn组成；所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示：

5、seq id no.1：fmoc-phe-arg-gly-asp-arg（fmoc-苯丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸），即fmoc-frgdr。

6、所述水凝胶中多肽分子自组装过程中发生二级结构转变，从无规卷曲转变为β-折叠结构，且多肽分子间通过氢键形成有序三维网络结构。

7、优选地，以水凝胶总体积计，所述pdrn的终浓度为0.05~2mg/ml。pdrn的终浓度在此范围内均可被成功负载，形成稳定均一的多肽水凝胶。

8、本发明一个具体的实施例中，优选所述pdrn的终浓度为2mg/ml。

9、优选地，所述水凝胶中多肽的浓度为0.9~2.0% w/v。

10、进一步优选地，所述水凝胶中多肽的浓度（质量体积分数）为1.3~2.0%。当多肽浓度为1.3%~1.4%时，凝胶强度明显增加，可形成初步稳定的自支撑结构。当多肽浓度达到1.5%~2.0%时，均可形成稳定、透明、均一的自支撑水凝胶，倒置后凝胶无任何流动或变形，且随着浓度增加，成胶时间缩短。

11、综合考虑成胶时间、凝胶稳定性及后续药物负载需求，更进一步优选地，所述水凝胶中多肽的浓度为1.4% w/v。

12、本发明所述pdrn的分子量为50kda~1500kda。所述pdrn来源于鲑鱼精巢提取物、其他鱼类生殖细胞提取物、微生物发酵来源或植物来源中的一种或多种，优选为鲑鱼精巢提取pdrn。

13、优选地，所述pdrn的分子量为650kda。

14、本发明还提供了上述负载pdrn的多肽自组装水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

15、（1）将pdrn用pbs溶解，配制pdrn储备液，4~10℃避光保存；

16、（2）采用ph诱导自组装法形成多肽水凝胶：

17、将多肽粉末在50~58℃下完全溶解于na2co3溶液中，hcl调节ph至7.0~8.0后，加入步骤（1）制得的pdrn储备液，于50~58℃恒温诱导成胶，制备得到所述负载pdrn的多肽自组装水凝胶。

18、本发明对于pdrn储备液的浓度并无特殊限定要求，只要满足pdrn在水凝胶中的终浓度为0.05~2mg/ml即可。优选地，步骤（1）中，所述pdrn储备液的浓度为0.35~14mg/ml。

19、本发明一个具体的实施例中，进一步优选所述pdrn储备液的浓度为14mg/ml。

20、本发明一个优选地实施方式是，步骤（2）中，将多肽粉末加入0.1m na2co3溶液和0.5m na2co3溶液中，超声助溶，50~58℃下使其完全溶解，用0.1m hcl调节ph至7.0~8.0后，加入步骤（1）制得的pdrn储备液，于50~58℃恒温条件下使其溶解，同时利用超声诱导成胶，制备得到所述水凝胶。

21、优选地，步骤（2）中，所述恒温诱导成胶的条件为：53℃下超声诱导成胶时间1~10min，成胶后静置1min得稳定水凝胶。

22、优选地，步骤（2）中，所述多肽通过固相合成法制备得到，所述多肽纯度≥90%。

23、本发明还提供了上述负载pdrn的多肽自组装水凝胶在制备医用敷料或组织工程支架中的应用，所述医用敷料或组织工程支架用于促进皮肤创面愈合、减少瘢痕形成或治疗糖尿病足溃疡。

24、本发明体内动物实验证实，负载pdrn的多肽自组装水凝胶能够显著加速全层皮肤缺损创面的愈合，其给药效果优于游离pdrn给药效果。其作用机制包括：促进肉芽组织增生、加速再上皮化、增加胶原沉积和新生血管形成，同时抑制过度炎症反应。本发明所述水凝胶为慢性创面、难愈性创面及术后修复提供了新的治疗策略。

25、本发明还提供了一种用于制备上述负载pdrn的多肽自组装水凝胶的自组装多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示：

26、seq id no.1：fmoc-phe-arg-gly-asp-arg，即fmoc-frgdr。

27、本发明设计了目标自组装多肽fmoc-frgdr，其氨基酸序列为fmoc-苯丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸，所述多肽采用fmoc保护策略，其中精氨酸（arg）采用pbf保护基，天冬氨酸（asp）采用otbu保护基，确保氨基酸连接过程的特异性和准确性，提升多肽合成纯度。

28、本发明多肽采用固相合成法，以fmoc保护氨基酸为原料，依次连接苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸残基，构建具有自组装能力的阳离子多肽。合成过程包括树脂活化、氨基酸连接、保护基脱除、树脂切割与纯化等步骤，最终获得高纯度多肽粉末。

29、本发明还提供了一种上述多肽的具体的优选地制备方法，包括以下步骤：

30、（1）树脂溶胀：称取0.2mmol 2-氯三苯甲基树脂与5ml二氯甲烷混合，置于摇床上摇摆活化30min，抽滤去除二氯甲烷后，用二氯甲烷洗涤树脂5次，每次洗涤2min；

31、（2）第一个氨基酸连接：称取0.3mmol fmoc-arg(pbf)-oh溶于5ml二氯甲烷，加入0.3mmol n,n-二异丙基乙胺，摇床上摇摆反应4-5h，抽滤去除反应液，用二氯甲烷洗涤树脂5次，每次洗涤2min；

32、（3）树脂封闭：配制体积比为80:15:5的二氯甲烷-甲醇-n,n-二异丙基乙胺封闭液，分两次加入固相合成管，每次5ml，摇床摇摆反应10min后抽滤；

33、（4）fmoc保护基团脱除：用5ml n,n-二甲基甲酰胺洗涤树脂5次，每次2min；加入5ml 20%哌啶/n,n-二甲基甲酰胺（v/v），摇床反应5min后抽滤，再加入5ml上述脱保护液继续反应25min，抽滤后用n,n-二甲基甲酰胺洗涤树脂5次，每次2min；

34、（5）后续氨基酸连接与脱保护：fmoc-frgdr多肽依次连接天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸；每次连接时，对应fmoc保护氨基酸、n,n-二异丙基乙胺、tbtu、hobt的用量均为0.6mmol，溶于5ml n,n-二甲基甲酰胺，摇床反应4-5h，反应结束后用n,n-二甲基甲酰胺洗涤5次，每次2min，再重复步骤（4）的脱保护操作；

35、（6）树脂切割：依次用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷各洗涤树脂5次，每次2min，抽滤后将树脂转移至圆底烧瓶，加入10ml三氟乙酸，搅拌反应5h；

36、（7）后处理：抽滤收集滤液，转移至梨形瓶中，50℃水浴真空旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚析出白色沉淀，沉淀用乙醚洗涤3次，离心后挥干剩余乙醚，得到多肽粗产物；

37、（8）纯化：将多肽粗产物加水冻干，得到多肽纯品。

38、有益效果：

39、（1） 协同增效：本发明负载pdrn的多肽自组装水凝胶提供的三维湿性愈合微环境与pdrn的促组织修复活性相互协同，在创面愈合、组织再生等方面的效果优于单独使用水凝胶或游离pdrn。

40、（2） 工艺兼容性好：pdrn的引入不影响多肽的自组装能力，本发明水凝胶的成胶浓度范围、成胶时间、微观结构等关键性能指标保持稳定。

41、（3）生物活性保持：本发明水凝胶制备中负载过程不破坏pdrn的生物活性，释放出的pdrn仍能有效激活a2a受体通路和补救通路，促进成纤维细胞增殖和血管新生。

42、（4）操作简便、成本可控，易于产业化：本发明负载pdrn的多肽自组装水凝胶制备工艺简单，无需复杂设备，反应条件温和，生产成本低，且水凝胶具有良好的生物相容性和稳定性，可广泛应用于药物递送、组织工程支架等生物医学领域，具有较高的实用价值和产业化前景。

43、（5）多肽设计科学合理，合成纯度高：本发明使用的fmoc-frgdr多肽，采用特定氨基酸序列和fmoc保护策略，结合优化的固相合成工艺，有效解决了现有多肽合成中氨基酸连接不充分、保护基团脱除不彻底、粗产物纯化效果差等问题，多肽纯度可达95%以上，为水凝胶的稳定自组装提供了坚实基础。

44、（6）制备工艺优化，成胶性能优异：本发明优化了ph诱导自组装制备工艺，调节ph至7~8（ 如ph 7.4），结合53℃静置1min的条件，实现多肽快速、稳定自组装；同时设置12个浓度梯度，明确成胶浓度范围，可根据实际应用需求选择合适浓度，扩大了水凝胶的应用范围。

45、（7）表征方法系统全面，保障产品质量：本发明采用成胶性能、水凝胶微观结构、多肽纯度（hplc、质谱、核磁共振）多维度表征方法，全面反映水凝胶的性能特点、微观结构及多肽自组装机制，为水凝胶的质量控制和应用推广提供了科学依据。