一种中药复方抗过敏性鼻炎有效部位及其筛选方法和应用与流程

本发明属于中药，具体涉及一种基于双靶点生物传感的玉屏风散有效部位筛选方法、有效部位、双靶点生物传感器及其应用。

背景技术：

1、中药复方作为中医辨证论治理论精髓的具体体现和临床应用核心，其配伍规律的现代阐释及药效物质基础与质量评价研究，是中医药现代化在更高层次上揭示复方科学内涵的关键。随着现代化学分离检测技术的发展，中药饮片层次的研究已不能满足中医药现代化发展的需求。将具有多成分、多靶点、多途径特点的复方研究，采用化学提取分离技术，从中药复方中提取分离得到有效组分、无效组分及其它组分，降低服用剂量，精制药物，使中药饮片的配伍简化为中药复方有效组分之间的配伍，进而为阐释中药复方的物质基础、作用机制和配伍理论提供了新的思路方法。中药有效组分包括有效成分和有效部位，是复方发挥疗效的物质基础及安全有效质量控制的关键。因此，中药复方有效组分的辨识是中药现代化研究亟待解决的关键问题之一。

2、目前，中药有效部位活性评价方法集中于化学表征和生物药效模型。化学表征以多糖类、黄酮类、生物碱类等已有文献研究的复方药效成分含量作为筛选指标。生物药效模型以中药复方所对应功效或药效疾病模型的细胞表型、动物生理功能体内外实验为主要活性评价方法筛选有效部位。另外，亦有将指纹图谱的化学信息和体内外药效进行相关性分析，基于“谱-效“关系筛选中药有效部位。药物的药效学效应本质上源于其与特定生物靶点发生高亲和力、高选择性的相互作用，进而通过级联放大机制激活或抑制下游信号转导通路，最终产生预期的生理功能或治疗反应。通过研究中药复方有效组分与关键靶点蛋白的相互作用数据信息，可在分子层面辨识并富集贡献疗效的有效部位，为复方精简、质控及后续开发提供高价值筛选依据。

3、玉屏风散是治疗鼻炎的经典名方，三味中药补散结合、标本兼治、升降相因的巧妙配伍体现了中医药的配伍精髓，其药味有效部位的辨识精制将为过敏性鼻炎的治疗提供更好的疗效及精准的质量控制。生物传感技术是一种利用生物材料（如酶、蛋白、细胞或组织）作为“识别元件”，与目标分子发生特异性相互作用后，通过换能器将生物信号转化为电、光、磁等信号，从而实现快速、灵敏、实时检测的一类跨学科前沿技术。

4、目前，现有技术未公开d101大孔树脂梯度分离结合mif/il-1β双靶点电化学生物传感联用的玉屏风散有效部位筛选方法，本发明填补该技术空白。

技术实现思路

1、在现有背景技术基础上，基于药物与靶点的相互作用的药效学本质，为了获得更丰富的反映中药复方有效部位的活性评价数据信息，本发明的首要目的在于克服现有玉屏风散有效部位筛选不准确、效率低、无分子靶点关联的问题，提供一种精准、稳定、可标准化推广的基于双靶点生物传感的玉屏风散有效部位筛选方法。

2、本发明首先提供一种玉屏风散复方不同极性部位制备方法，不同极性部位制备方法具体步骤如下：

3、（1）玉屏风散药味黄芪、防风、炒白术的提取

4、为充分对玉屏风散复方成分进行分离获取以对其进行全面的有效部位筛选，根据玉屏风散复方的药味组成，称取黄芪、防风、炒白术饮片各1份粉碎，首先采用无水乙醇对上述饮片分别进行浸泡、回流提取后过滤获得乙醇提取液；接着，将剩余药渣加纯化水进行浸泡、回流提取后过滤离心获得水提取液；最后，获得玉屏风散复方黄芪、防风、炒白术饮片无水乙醇和水提取液，共6份。经浓缩、干燥称重记录质量后，置于干燥阴凉处保存备用。

5、（2）基于大孔树脂技术的不同极性部位的分离

6、d101大孔树脂是一种苯乙烯型非极性共聚体，适用于分离化合物类型广泛，如皂苷、黄酮、香豆素、萜类和弱极性生物碱。因此，对上述获得的提取物加溶剂溶解后，采用d101型大孔树脂进行分离，并用30%乙醇和70%乙醇两种梯度洗脱液，进行不同极性部位的分离，每份提取液共得到2个不同部位的提取物。最终，玉屏风散复方6份提取液共计得到12个不同极性部位（见表1）。经浓缩、干燥称重记录质量后，置于干燥阴凉处保存备用。

7、表1 玉屏风散复方药味不同极性部位

8、

9、本发明进一步提供了一种基于丝网印刷电极电化学生物传感的不同极性部位与过敏性鼻炎关键靶点的相互作用检测方法。

10、（1）mif/il-1β-spge生物传感器的构建

11、以丝网印刷金电极（screen printed gold electrode，spge）为生物芯片载体，在spge工作电极范围加入40 μl 3-巯基丙酸溶液（3-mpa），在室温下浸泡17-24 h，在spge生物传感芯片表面生成au-s键，形成自组装单层。

12、待自组装单层形成后，用去离子水洗去残余3-mpa试剂，加入浓度为20 mm碳酰二亚胺盐酸盐（edc）和50 mm羟基丁二酰亚胺（nhs）的等体积混合溶液，于室温下反应15-30min，生成稳定的胺类活化产物，用于活化羧基。

13、活化后，用去离子水清洗残余试剂，分别加入mif和il-1β重组蛋白溶液，于4℃下反应2-4h，即分别得到mif、il-1β功能化修饰的spge生物传感器。

14、使用chi660e电化学工作站对mif - spge生物传感器、il-1β - spge生物传感器的电信号进行采集，得到安培-时间曲线（i-t）后，进行数据处理分析。

15、（2）不同部位样品溶液的制备

16、分别称取上述12个玉屏风散方不同极性部位适量溶解后，制成1 mg/ml的母液，按十倍浓度梯度依次稀释十次，即得到每个不同极性部位的11个不同浓度的样品溶液。

17、（3）有效部位筛选

18、将制备好的mif和il-1β - spge生物传感器作为反应器件，以去离子水为空白溶液，按浓度由低到高（1×10-10mg/ml~1mg/ml）的顺序，依次向mif和il-1β - spge生物传感器上加入上述不同极性部位的11个不同浓度的样品溶液，反应5min，以chi660e电化学工作站对每个样品进行扫描，记录安培-时间曲线（i-t）的电化学信号值。

19、以被检测样品溶液浓度的对数（lg[c]）为横坐标，以电流变化相对值（i-i0）/i0为纵坐标，进行线性拟合，确定所述生物传感器的线性检测范围。进一步以样品质量浓度c为横坐标，以c/δi为纵坐标进行拟合，根据式（1）～（3）计算玉屏风散复方不同极性部位样品与mif或il-1β蛋白相互作用的表观解离常数kd。

20、（1）

21、（2）

22、（3）

23、其中，c为玉屏风散复方不同极性部位样品的质量浓度；δi为电流变化值；δimax为最大电流变化值；k为线性拟合方程的斜率；b为线性拟合方程的截距；kd为在所述检测条件下样品与固定化蛋白相互作用的表观解离常数。

24、本发明的有益效果是：

25、本发明从药物与特定生物靶点的高亲和力、高选择性的相互作用的药效学效应本质机理出发，提供了一种大孔树脂分离结合靶点生物传感器用于治疗过敏性鼻炎的经典名方玉屏风散有效部位的辨识方法，直接靶向过敏性鼻炎核心靶点mif/il-1β，筛选结果与分子作用机制高度匹配；检测快速、参数明确、可重复；方法可推广至其他中药复方有效部位的筛选与开发，支撑中药现代化研究。