一种耐受肽免疫调节剂纳米疫苗及其制备方法与应用

本发明属于生物医药技术，涉及一种耐受疫苗，具体涉及一种耐受肽免疫调节剂纳米疫苗及其制备方法与应用。

背景技术：

1、类风湿关节炎（ra）是一种系统性自身免疫疾病，目前ra仍然无法根治，患者通过长期服用非甾体抗炎药、糖皮质激素和疾病改善型抗风湿药物（dmards）三类药物，缓解疾病。类风湿性关节炎本质上是由于免疫系统将自身抗原识别为过敏源，产生自身抗体攻击自身组织的一类自身免疫性疾病。因此，诱导建立持久、抗原特异性的免疫耐受，对于治疗ra等自身免疫性疾病至关重要。类风湿关节炎的免疫耐受疗法已经引起人们广泛关注。研究人员提出了多种策略，包括通过移植造血干细胞消除自身反应性免疫细胞的过继免疫疗法[参见：treatment of severe autoimmune disease by stem-cell transplantation]，以及使用各种免疫调节细胞来重建自身免疫耐受[参见：cell therapy for autoimmunediseases]。尽管细胞疗法展现出良好的治疗效果，但复杂的治疗模式，冗长的治疗周期以及昂贵的治疗费用限制了其在临床中的广泛应用；基于耐受肽的疫苗是一种很有前景的自免疾病疗法，其抑制抗原特异性效应t细胞和促进调节性t细胞（regulatory t cells，treg）增殖。

2、免疫耐受诱导面临的一个重要挑战在于，单纯使用自身抗原进行免疫易加剧促炎性免疫反应[参见：induction of immune tolerance in the treatment of rheumatoidarthritis]。近年研究表明，将自身抗原与免疫调节剂共递送或可解决这一难题。现有技术以赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸为小分子抗炎肽，将小分子抗炎肽与免疫调节剂/自噬诱导剂雷帕霉素通过疏水作用力、氢键等分子间作用力相连接，通过纳米沉淀法制得kpv-rapa纳米药物。现有技术公开了一种用于装载雷帕霉素的多肽纳米材料，采用的多肽纳米材料具有特定结构，且多肽纳米材料能够自组装形成纳米颗粒，可实现雷帕霉素的包封。现有通过多肽装载免疫调节剂的方法带来输送过程中容易泄露以及治疗效果偏差等问题。现有技术将生物相容性高分子基质材料和自身抗原溶解于纯水中，再加入免疫调节剂搅拌得到混悬液，混悬液加入模具中形成针尖，干燥后浇筑背衬层溶液，最后脱模得到微针贴片；微针的质控一直是该领域的难题，也是限制其批量生产的重要原因，目前针对微针机械强度的主流检测手段仅能对整个微针贴片粗略评估，无法完成对每一个针尖单元质控。现有技术用脂肪乳(iles)作为内核，用于将疏水的雷帕霉素包载于油相中，接着在iles表面修饰聚乙二醇并在peg化的iles表面装饰微量的氢氧化铁以提高制剂对citp (ra中一类重要的自身抗原，表示为citp)的包封率；该方法过程复杂，质量控制不易，尤其是纳米粒过大，达到130nm。因此，需要研发新的纳米疫苗，希望简便有效的共递送自身抗原与免疫调节剂显著缓解炎症，保护软骨组织。

技术实现思路

1、本发明采用新的方法制备例包载耐受肽以及免疫调节剂的纳米疫苗，粒径为60nm左右，成功降低bmdc细胞成熟度和抗原提呈能力，降低促炎因子il-6的表达，提高抑制因子il-10的表达，并提高脾脏细胞中treg细胞比例。

2、本发明采用如下技术方案。

3、一种耐受肽免疫调节剂纳米疫苗，包括免疫调节剂封装聚合物囊泡以及耐受肽。

4、优选的，耐受肽与免疫调节剂封装聚合物囊泡通过化学键连接。

5、进一步优选的，免疫调节剂封装聚合物囊泡表面修饰耐受肽。

6、本发明中，耐受肽包括源自ii 型胶原蛋白、丝聚蛋白、纤维蛋白原、波形蛋白、类风湿因子、瓜氨酸化蛋白和热休克蛋白（hsps）的一种或几种肽段。其中，热休克蛋白包括大分子热休克蛋白hsp110、hsp90、hsp70、hsp60以及小分子热休克蛋白，大分子热休克蛋白是atp 依赖性分子伴侣，小分子热休克蛋白以不依赖atp的方式起作用。

7、本发明中，免疫调节剂包括地塞米松、环孢素、他克莫司、雷帕霉素及其衍生物中的一种或多种。

8、本发明中，耐受肽免疫调节剂纳米疫苗可使抗原呈递细胞产生成熟抗性并赋予其耐受特性，通过抑制抗原呈递细胞的mtor通路，下调cd40、cd80及cd86等表面成熟标志物的表达，同时使处理后的抗原呈递细胞仍保留刺激并激活促进调节性t细胞（treg）的能力，共递送自身抗原与免疫调节剂显著缓解小鼠炎症，保护软骨组织。

9、本发明中，聚合物囊泡包括亲水链段、疏水链段，由聚合物组装形成囊泡，亲水链段接耐受肽，实现免疫调节剂封装聚合物囊泡表面修饰耐受肽，即耐受肽与免疫调节剂封装聚合物囊泡通过化学键连接。

10、本发明中，组装成聚合物囊泡的聚合物包括两亲性嵌段聚合物，该两亲性嵌段聚合物包括亲水链段、疏水链段，进一步的，亲水链段接耐受肽，从而组装成的聚合物囊泡表面修饰耐受肽。

11、优选的，疏水链段包括dtc（二硫戊环三亚甲基碳酸脂）单体重复单元；进一步优选的，疏水链段包括dtc单体重复单元与酯单体重复单元，表示为p(脂单体单元-dtc)。

12、优选的，亲水链段、疏水链段构成的聚合物为亲水链段-p(脂单体单元-dtc)，为现有聚合物。

13、其中：p(脂单体单元-dtc)为疏水链段，为酯单体、dtc单体聚合链段。优选亲水链段为聚乙二醇链段（peg）；亲水链段的分子量为1000～15000 da，疏水链段的分子量为亲水链段分子量的1～20倍；pdtc链段分子量为疏水链段总分子量的5%～50%。

14、优选的，peg的分子量为2000～12000 da，进一步优选的，peg的分子量为3000～10000 da，再优选的，peg的分子量为4000～9000 da。

15、优选的，疏水链段的分子量为peg分子量的2～15倍，优选的，疏水链段的分子量为peg分子量的2～10倍，进一步优选的，疏水链段的分子量为peg分子量的2～8倍，比如为3倍、4倍、5倍或者范围内的任意倍数；pdtc的分子量为疏水链段分子量的8%～40%，优选的，pdtc的分子量为疏水链段分子量的10%～30%，比如为11%、12%、15%、20%、25%或者范围内的任意比例。

16、本发明公开了上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤，将接耐受肽的两亲性嵌段聚合物、免疫调节剂混合，组装，制备耐受肽免疫调节剂纳米疫苗。

17、进一步的，将接耐受肽的两亲性嵌段聚合物、免疫调节剂以溶液形式混合，组装，制备耐受肽免疫调节剂纳米疫苗。

18、进一步的，将接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液、免疫调节剂溶液混合，组装，制备耐受肽免疫调节剂纳米疫苗。

19、进一步的，将接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液、免疫调节剂溶液混合，在缓冲液中组装，制备耐受肽免疫调节剂纳米疫苗。

20、本发明中，组装包括自组装。

21、本发明中，耐受肽与官能团化两亲性嵌段聚合物反应制备接耐受肽的两亲性嵌段聚合物。

22、本发明中，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液中，溶剂包括二甲基亚砜（dmso）；接耐受肽的两亲性嵌段聚合物的浓度为1～1000 mg/ml，优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物的浓度为10～800 mg/ml，再优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物的浓度为30～600mg/ml，进一步优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物的浓度为50～500 mg/ml，更优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物的浓度为70～400 mg/ml，最优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物的浓度为80～300 mg/ml，比如90 mg/ml、100 mg/ml、150 mg/ml、200 mg/ml、250mg/ml或者范围内的任意数据。

23、本发明中，免疫调节剂溶液中，溶剂包括dmso；免疫调节剂的浓度为10～1000 mg/ml，优选的，免疫调节剂的浓度为20～800 mg/ml，再优选的，免疫调节剂的浓度为30～500mg/ml，进一步优选的，免疫调节剂的浓度为40～300 mg/ml，最优选的，免疫调节剂的浓度为50～100 mg/ml，比如60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml或者范围内的任意数据。

24、本发明中，缓冲液的选择为现有产品。

25、本发明中，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液、免疫调节剂溶液的体积比例为（1～100）∶ 1，优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液、免疫调节剂溶液的体积比例为（3～50）∶ 1，再优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液、免疫调节剂溶液的体积比例为（5～30）∶ 1，进一步优选的，接耐受肽的两亲性嵌段聚合物溶液、免疫调节剂溶液的体积比例为（7～20）∶ 1，比如8∶1、9∶1、10∶1或者范围内的任意比例。

26、本发明公开了一种可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统，包括上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗以及水凝胶。

27、本发明可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统中，hrv在zia小鼠模型上取得积极疗效，缓解了关节肿胀，诱导关节toldc、淋巴结treg，成功建立关节局部耐受和外周耐受；进一步的，基于ha的二苯并环辛炔（-dbco）与叠氮（-n3）功能化可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统（hrv@gel）能持续释放hrv，使hrv在lns中长效富集，建立了局部和外周免疫耐受，缓解cia小鼠关节肿胀，保护了软骨和骨骼的完整性。

28、本发明中，水凝胶包括透明质酸水凝胶。

29、优选的，水凝胶包括基于透明质酸的二苯并环辛炔（-dbco）与叠氮（-n3）功能化水凝胶。

30、本发明公开了可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统的制备方法，包括以下步骤，将水凝胶前体、上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗混合，形成可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统。

31、进一步的，将水凝胶前体溶液、上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗溶液混合，形成可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统。

32、本发明中，水凝胶前体包括功能化透明质酸，进一步的，水凝胶前体包括二苯并环辛炔功能化透明质酸（ha-dbco）与叠氮功能化透明质酸（ha-n3）。

33、优选的，二苯并环辛炔功能化透明质酸中，二苯并环辛炔的取代度为5～50%，优选为10～30%；dbco取代度是指透明质酸中羧基被dbco替代的比例，为理论取代度。

34、优选的，叠氮功能化透明质酸中，叠氮的取代度为5～50%，优选为10～30%；n3取代度是指透明质酸中羧基被n3替代的比例，为理论取代度。

35、本发明中，水凝胶前体溶液的浓度为1～50 mg/ml，优选的，水凝胶前体溶液的浓度为5～30 mg/ml，比如10 mg/ml、15mg/ml、20 mg/ml、25 mg/ml或者范围内的任意浓度。

36、优选的，二苯并环辛炔功能化透明质酸（ha-dbco）与叠氮功能化透明质酸（ha-n3）的重量比为1 ∶（0.5～2），比如1∶1。

37、本发明公开了上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗或可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统在制备抗炎药物中的应用。

38、本发明公开了上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗或可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统在制备体内炎症和/或体外炎症治疗药物中的应用。

39、本发明公开了上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗或可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统在制备防治关节炎的药物中的应用。

40、本发明公开了上述耐受肽免疫调节剂纳米疫苗或可注射耐受肽纳米囊泡水凝胶系统在制备缓解关节肿胀的药物中的应用。

41、ra是一种以慢性滑膜炎为主要特征的自身免疫性疾病，其病理改变主要集中于关节部位：关节滑膜异常增生至10-20层、关节肿胀、畸形。本发明开发了一种耐受性纳米疫苗，即热休克蛋白抗原肽表面修饰的雷帕霉素封装聚合物囊泡（hrv）。基于peg-p(tmc-dtc)的还原敏感二硫键交联聚合物囊泡被用作展示这些抗原并呈递给dcs的平台。该平台不仅具备表面修饰和装载多种抑制炎症的治疗药物（如雷帕霉素）的灵活性，还作为佐剂促进免疫耐受的建立。针对ra的病理特点，本发明基于水凝胶递送实现的局部靶向治疗策略显示出独特优势，免疫耐受的建立需要维持长期低浓度的抗原肽，局部给药系统可以持续释放药物，在给药部位长期维持有效浓度，从而调节免疫反应并抑制疾病进展。本发明中，水凝胶作为一种新型药物递送系统，具有良好的生物相容性和可调控的降解特性；水凝胶的三维网络结构具有多方面的优势：高效负载药物；直接注射到病变组织周围，最大限度地减少脱靶效应；延长药物的体内驻留时间；通过调节交联度来控制药物释放速率，从而实现持续、稳定的药物释放。透明质酸（ha）水凝胶具有生物相容性和可注射性，通过迈克尔加成和点击化学等快速化学反应得到的原位交联ha水凝胶，可在生理条件下持续释放药物。