用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗的制备

本发明涉及用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗的制备，属于生物医药。

背景技术：

1、疟疾是严重威胁人类生命健康的热带病，根据世界卫生组织的全球疟疾报告，2024年全球疟疾新发病例达2.82亿，造成61万名患者死亡。值得注意的是，约75%的死亡患者为小于5岁以下的儿童及婴幼儿，其中因孕妇罹患胎盘疟疾（placental malaria，pm）并通过胎盘传播导致胎儿感染的先天性疟疾是患儿死亡的主要原因之一。胎盘疟疾可引发孕妇贫血、高血压、产后出血等风险，更严重的可导致胎儿低出生体重、发育不良、早产、流产，甚至导致新生儿罹患先天性疟疾。然而，目前临床上仅有的两款疟疾疫苗rts,s和r21被推荐使用，但对患儿的保护效果欠佳而且都无法在胎儿期产生有效保护。

2、临床上观察到，初次怀孕的女性，在感染疟原虫后更易发展成严重的胎盘疟疾，而高流行地区连续怀孕后胎盘疟疾的发病率急剧降低，此现象表明，宿主可获得天然免疫保护性，也提示研究者，研发针对胎盘疟疾、而不是疟原虫感染的疫苗，可保护孕妇免受胎盘疟疾引起的严重临床表现。目前，在胎盘上鉴定出恶性疟原虫pfemp1家族成员var2csa，被认为是介导受感染红细胞与胎盘上硫酸软骨素（csa）相互作用的寄生虫来源配体。进一步研究表明，抗var2csa抗体的存在与pm的保护具有相关性。经过一系列努力基于var2csa的胎盘疟疾疫苗进入临床试验，显示出良好的安全性，疫苗可诱导高滴度特异性抗体，且这些抗体在体外可抑制感染红细胞与胎盘受体csa结合。然而，基于var2csa抗原的胎盘疟疾疫苗仍然面临结构极其复杂、抗体衰减快、变异体逃逸风险等挑战。基于此，迫切需要需进一步筛查并鉴定具备疟疾候选疫苗潜力的关键抗原分子，并寻求能增强保护力的新型疫苗载体，研发针对胎盘疟疾的新型防治策略。

3、由于无法直接在孕妇人体试验初期做攻毒，小鼠是标准的临床前概念验证平台。疟原虫表面相关抗原（surface-related antigen，sra）具有良好免疫学活性，参与对宿主的免疫调节，其核酸序列展现出高度保守性，其特异性抗体具备良好的阻断能力。小鼠实验证明，相比较var2csa蛋白而言（分子量约为350kda），疟原虫sra蛋白存在两点优势：①以单基因表达，且分子量较小（分子量约为100kda），序列高度保守；②pbsraf2蛋白具有良好的抗原性及免疫原性，其抗体在胎盘疟疾中尤其对子代具有良好保护力。

4、与此同时，疟疾疫苗开发过程中常出现抗体有效期短，免疫保护力不持久的问题。传统疫苗常面临免疫原性弱、稳定性差、递送效率低、体液与细胞免疫不平衡等问题。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明要解决的技术问题是现有用于胎盘疟疾的疫苗免疫频次高、保护力持久性差、体内防护效果不佳。

3、技术方案

4、本发明提供一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，具有安全高效、可实现长效免疫保护的特点，可用于防控啮齿动物胎盘疟疾。

5、所述用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，是伯氏疟原虫pbsraf2蛋白作为抗原，以细胞膜囊泡包载所述伯氏疟原虫pbsraf2蛋白，从而形成纳米囊泡疫苗。所得纳米囊泡疫苗可显著提升抗原稳定性与免疫原性，单次/低频次免疫即可诱导持久保护性免疫，有效降低胎盘疟疾小鼠模型孕鼠的寄生虫血症原虫载量、提高单窝活胎鼠数量和胎鼠存活率。

6、所述伯氏疟原虫pbsraf2蛋白的氨基酸序列如seq id no. 1所示。

7、所述细胞膜囊泡是将细胞利用超声破碎再结合密度梯度离心，以裂解细胞并剔除未裂解的完整细胞、细胞核、大块细胞碎片、微小细胞碎片、杂散细胞器与残留核酸等得到的。所述细胞采用293t细胞。

8、在本发明的一些实施方式中，所述细胞膜囊泡上定位表达抗dec205抗体。所述抗dec205抗体能够靶向结合抗原提呈细胞表面的dec205蛋白分子，以增强抗原提呈效率。

9、在本发明的一些实施方式中，所述细胞膜囊泡与伯氏疟原虫pbsraf2蛋白的质量比为1：1。

10、在本发明的一些实施方式中，所述纳米囊泡疫苗还含有药用级免疫佐剂。

11、本发明提供所述纳米囊泡疫苗的制备方法，包括以下步骤：

12、（1）合成编码所述伯氏疟原虫pbsraf2蛋白的基因片段，所述伯氏疟原虫pbsraf2蛋白的氨基酸序列为：

13、tnsyqglnktnestkndenanivkfiektkykqsknkhynfnilepfekkkqitqfstnnysflfeknkksekivykrlkininkyeeylknklnkcdisndgmitvyiklllqivkdkndiyvdiskksivnskevnkynntktqkqtnnqndyyatddndndsdsdsdsesdsdndefygynkkksnnysylemlnlmenknnmnnnpnitqfsksdkkklstnseskqdknktsnlmpnykiiknitkynfyqerltddldgdsmgnyykskngffkslfs，

14、将基因片段连接到原核表达载体，转化至表达宿主细胞内表达，收集纯化伯氏疟原虫pbsra-f2蛋白；

15、（2）将编码抗dec205抗体的基因转染至293t细胞中，培养293t细胞，获得在细胞膜表面表达抗dec205抗体的293t细胞；

16、（3）收集在细胞膜表面表达抗dec205抗体的293t细胞，通过超声破碎联合密度梯度离心实现细胞裂解和细胞膜囊泡纯化，得到细胞膜囊泡；

17、（4）将伯氏疟原虫pbsra-f2蛋白与所述细胞膜囊泡一起超声处理，形成包载伯氏疟原虫pbsra-f2蛋白的纳米囊泡疫苗（nvs@pbsra-f2）。

18、有益效果

19、本发明针对胎盘疟疾这个疾病，而不是疟原虫感染，将pbsra-f2蛋白包载至表面表达抗dec205抗体的纳米囊泡载体中制备得到一种纳米囊泡疫苗。该纳米囊泡疫苗具有粒径均一、抗原保护好、靶向性强、可缓释、安全可降解等优势，能显著提升抗原呈递效率、延长免疫持续时间、增强黏膜与系统性免疫应答。低频次免疫即可诱导持久保护，可有效清除胎盘疟原虫、修复胎盘损伤，提升胎鼠存活率，为胎盘疟疾防控提供新方案。

20、与其他病毒载体疫苗相比，本发明的纳米囊泡疫苗具备优异的生物相容性与稳定的微观结构，能够在表面稳定表达可发挥靶向作用的分子，颗粒形态易于被免疫细胞识别摄取，可高效激活机体体液免疫及细胞免疫应答；同时该载体可有效保护抗原免受酶解与酸碱破坏，延长抗原体内滞留释放时间，且纳米粒径利于富集于淋巴免疫组织，靶向提升免疫激活效率，该载体生物毒性低、无致病性，适配孕妇等特殊易感人群，此外其制备工艺简便可控，可为疟疾多价疫苗研发提供通用制备平台。

1.一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，其特征在于，以细胞膜囊泡包载伯氏疟原虫pbsraf2蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，其特征在于，所述伯氏疟原虫pbsra-f2蛋白的氨基酸序列如seq id no. 1所示。

3.根据权利要求1所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，其特征在于，所述细胞膜囊泡是将细胞利用超声破碎再结合密度梯度离心，以裂解细胞并剔除未裂解的完整细胞、细胞核、大块细胞碎片、微小细胞碎片、杂散细胞器与残留核酸等得到的。

4.根据权利要求3所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，其特征在于，所述细胞膜囊泡上定位表达抗dec205抗体。

5.根据权利要求1所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，其特征在于，所述细胞膜囊泡与伯氏疟原虫pbsraf2蛋白的质量比为1：1。

6.根据权利要求1-5任一项所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗，其特征在于，所述纳米囊泡疫苗还含有药用级免疫佐剂。

7.制备权利要求1-5任一项所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.权利要求1-6任一项所述的一种用于保护小鼠胎盘疟疾的纳米囊泡疫苗在制备预防胎盘疟疾的疫苗中的用途。