Treg外泌体硒钨纳米递送系统及其制备方法与应用

本技术涉及生物医学，尤其是涉及treg外泌体硒钨纳米递送系统及其制备方法与应用。

背景技术：

1、溃疡性结肠炎（uc）是一种以结肠黏膜持续性炎症损伤为主要特征的慢性复发性炎症性肠病，其发生发展涉及肠道氧化应激失衡、免疫稳态破坏以及肠道菌群紊乱等多种病理过程。目前，临床上主要采用氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、生物制剂以及免疫抑制剂等方式进行治疗。

2、然而，由于uc具有复杂的病理机制、多因素驱动以及高复发特征，现有治疗策略难以实现对炎症微环境、免疫异常以及菌群失衡的综合调控，长期治疗过程中仍存在疗效有限、免疫抑制相关感染风险增加以及疾病复发等问题。

3、另外，肠道氧化应激水平升高是uc发生发展的重要病理因素之一。炎症刺激诱导活性氧（reactive oxygen species，ros）大量产生，可进一步造成肠上皮屏障损伤，并促进炎症级联反应。同时，肠道菌群稳态维持依赖于复杂的代谢调控网络，其中部分细菌的生长和代谢过程依赖钼辅因子相关酶系统。

4、因此，开发能够增强免疫治疗效果的同时，还能调节炎症微环境、恢复免疫稳态并维持肠道菌群平衡的新型产品具有重要意义。

技术实现思路

1、为了实现在增强免疫治疗效果的同时，还能调节炎症微环境、恢复免疫稳态并维持肠道菌群平衡，本技术提供treg外泌体硒钨纳米递送系统及其制备方法与应用。

2、第一方面，本技术提供一种treg外泌体硒钨纳米递送系统，采用如下技术方案：

3、一种treg外泌体硒钨纳米递送系统，包括treg来源外泌体、壳聚糖、硒纳米颗粒、六价钨和海藻酸钠；

4、壳聚糖与treg来源外泌体结合形成复合载体；硒纳米颗粒和所述六价钨独立共负载于复合载体上，其中硒纳米颗粒中的硒经原位还原形成，负载的钨以六价形式存在；

5、海藻酸钠包覆于负载有硒纳米颗粒和六价钨的复合载体外层，形成口服递送体系。

6、通过采用上述技术方案，首先，treg来源外泌体作为天然免疫调节载体，富含多种抗炎因子和免疫抑制信号分子，能够通过抑制促炎信号通路、促进巨噬细胞m2型极化和恢复treg/th17细胞平衡等方式发挥抗炎和免疫调节作用。其次，硒纳米颗粒具有优异的抗氧化性能，可通过参与硒蛋白gpx2和txnrd1的合成，高效清除炎症微环境中过量的活性氧（ros），缓解氧化应激损伤。钨则通过竞争性替代钼辅因子中的钼，选择性抑制肠杆菌科细菌依赖的钼酶活性，从而抑制机会性致病菌在炎症期间的异常扩增。海藻酸钠外层包覆赋予该系统口服递送能力，可利用海藻酸钠在胃酸中不溶解、在肠道中溶解的特性，实现结肠靶向递送。由此，本技术通过“免疫调节-ros清除-菌群调控-口服靶向”四重功能的有机整合，实现了对溃疡性结肠炎复杂病理机制的多层次协同干预，克服了单一治疗策略难以兼顾免疫异常、氧化应激和菌群失衡的综合调控难题。

7、进一步的，所述硒纳米颗粒中的硒与六价钨的摩尔比为1：（0.5-2）。

8、通过采用上述技术方案，通过优化硒与钨的计量比，确保两种功能组分在复合载体上实现最佳的协同效应。硒需要足够的剂量以发挥其ros清除和抗氧化功能，而钨则需要适当的剂量以有效抑制肠杆菌科细菌的钼酶活性。当硒钨摩尔比在此范围内时，既能保证硒纳米颗粒对炎症部位过量ros的高效清除，又能确保钨对机会性致病菌代谢通路的充分抑制，同时避免任一组分过量可能带来的潜在毒性或功能干扰，从而实现抗氧化与菌群调控功能的最佳平衡。

9、进一步的，所述硒纳米颗粒中的硒与六价钨的摩尔比为1：1。

10、进一步的，所述壳聚糖与treg来源外泌体的质量比为1：（1-3）。

11、通过采用上述技术方案，壳聚糖作为阳离子聚合物，可通过静电相互作用与带负电的外泌体膜结合，形成稳定的复合载体结构。当外泌体与壳聚糖的质量比在此范围内时，既保证足量的壳聚糖能够有效包裹和保护外泌体，防止其在胃肠道环境中降解失活，又避免过量壳聚糖导致复合载体粒径过大而影响递送效率和黏膜穿透能力。适宜的壳聚糖比例还能为后续硒和钨离子的配位负载提供充足的结合位点，确保金属功能组分的高效负载。

12、进一步的，所述treg来源外泌体来源于诱导型调节性t细胞或自然调节性t细胞。

13、第二方面，本技术提供一种treg外泌体硒钨纳米递送系统的制备方法，采用如下技术方案：

14、一种treg外泌体硒钨纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：

15、s1.外泌体-壳聚糖复合载体的制备：将壳聚糖溶于乙酸当中得到壳聚糖溶液，加入treg来源外泌体混合，调节ph，使壳聚糖与外泌体结合形成外泌体-壳聚糖复合载体。

16、s2.se与w混合金属离子的负载和还原：在s1所得复合载体体系中引入亚硒酸盐和钨酸盐进行配位负载，随后加入抗坏血酸进行原位还原，使亚硒酸盐被原位还原为硒纳米颗粒并负载于复合载体上，钨以六价形式独立负载于复合载体上，得到负载硒纳米颗粒和六价钨的复合载体；

17、s3.口服金属纳米颗粒递送体系的制备：将海藻酸钠溶液与s2所得体系混合，使海藻酸钠包覆于所述复合载体外层，得到所述口服递送体系。

18、通过采用上述技术方案，首先，s1步骤通过调节ph使壳聚糖与外泌体结合，利用壳聚糖的阳离子特性与外泌体表面的负电荷形成稳定的复合载体，操作条件温和，不破坏外泌体的天然结构和生物活性。其次，s2步骤采用“先配位负载、后原位还原”的策略：亚硒酸盐和钨酸盐先通过配位作用负载于复合载体上，再加入抗坏血酸进行原位还原，使亚硒酸盐被还原为单质硒纳米颗粒并牢固负载于载体上，将钨酸盐中的钨还原为六价钨。

19、原位还原是指：在已形成的外泌体-壳聚糖复合载体存在条件下，直接加入亚硒酸盐和钨酸盐，再以抗坏血酸为还原剂，使亚硒酸盐在载体原位被还原为硒纳米颗粒并就地负载于复合载体上。这种原位还原方法避免了预合成纳米颗粒再负载的复杂操作，确保了硒纳米颗粒在载体上的均匀分布和稳定负载。最后，s3步骤通过海藻酸钠包覆形成口服递送体系，利用海藻酸钠的结肠靶向特性实现口服给药。整个制备方法工艺简单、条件温和、重现性好，适合规模化生产。

20、进一步的，s1中壳聚糖溶液的浓度为5-10mg/ml。

21、通过采用上述技术方案，适宜的壳聚糖浓度能够确保其在乙酸中充分溶解并形成均匀的溶液体系，为后续与外泌体的有效结合提供良好的反应环境。当壳聚糖浓度在此范围内时，溶液黏度适中，既有利于壳聚糖分子链的舒展和与外泌体表面的充分接触，又不会因浓度过高导致体系黏度过大而影响混合均匀性和复合载体的形成效率。这一浓度范围还与后续步骤中金属离子的负载和还原反应条件相匹配，有助于保证整个制备过程的稳定性和批次间一致性。

22、进一步的，s2中亚硒酸盐为亚硒酸钠其浓度为0.5mm；所述钨酸盐为钨酸钠，其浓度为0.5mm；所述抗坏血酸的浓度为30mm。

23、通过采用上述技术方案，亚硒酸钠和钨酸钠是常见且成本低廉的金属盐前体，在水中具有良好的溶解性和稳定性，便于精确控制投料比例。0.5mm的浓度设置与前述1:1的硒钨摩尔比相匹配，确保了两种功能组分在复合载体上的均衡负载。30mm的抗坏血酸作为温和的还原剂，抗坏血酸在温和条件下将亚硒酸盐还原为硒纳米颗粒、将钨酸盐中的钨还原为六价钨，且不影响外泌体生物活性。这一还原体系避免了使用强还原剂可能带来的毒性和副反应，保证了递送系统的生物安全性。

24、进一步的，s2中原位还原的温度为30-40℃，配位负载的孵育时间为1-3h，原位还原的孵育时间为1-3h。

25、第三方面，本技术提供一种treg外泌体硒钨纳米递送系统在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

26、综上所述，本技术具有以下有益效果：

27、1.本技术利用treg外泌体作为天然免疫调节载体，提高了递送系统的生物相容性和免疫调控能力，可有效缓解uc局部炎症反应；

28、2.本技术通过引入se纳米颗粒，实现对炎症微环境中过量ros的高效清除，降低氧化应激介导的肠上皮损伤；

29、3.本技术通过引入w元素调节细菌代谢过程，在增强免疫治疗效果的同时抑制机会性病原菌异常增殖，降低免疫抑制治疗导致菌群紊乱的风险；

30、4.本技术建立了“清除ros-调控菌群-重塑免疫”的多功能协同治疗策略，为溃疡性结肠炎纳米免疫治疗提供了一种新的技术方案。