用于RNA局部施用的递送系统的制作方法

本发明涉及一种可用于rna局部施用的组合物，其中所述组合物包含(i)含有rna的水相和(ii)油相，在一个实施方案中所述水相和油相与两种特定表面活性剂混合。特别地，本发明涉及编码目标抗原性蛋白的mrna的制剂。更特别地，提供了一种用于穿越皮肤屏障的微乳剂，其允许用于mrna疫苗应用的替代途径。所述微乳剂可局部施用，并可通过毛囊途径穿过皮肤。由此实现了一种递送系统，其允许(1)避免在疫苗接种中使用针头，以及(2)更特异性地靶向免疫的粘膜组分。背景信息rna疫苗和治疗剂是疫苗学和基因治疗中日益受关注的领域。使用核酸编码抗原作为疫苗平台的基础具有众多优点：纯化相对简化，且rna构建体可使用dna合成技术随后进行rna转录和加帽在数天内构建。这使得能够对新出现的病原体威胁做出快速反应，转变生产以适应新流行毒株，或为多种疾病个性化治疗干预。病毒感染仍然是动物中重要的健康问题，具有不利的经济后果。例如，存在多种病毒病原体在经济上重要的家畜动物(如猪)中引起疾病。感染猪的病毒包括例如猪甲型流感病毒(siav)。猪流感是由正粘病毒科的甲型流感病毒(iav)引起的急性呼吸道病毒性疾病，会降低猪的健康和福利。猪流感的临床症状可表现出不同的严重程度，但通常表现为轻度呼吸道疾病，具有高发病率和快速恢复，罕见死亡病例。然而，该疾病具有相当大的经济负担，因为它导致体重减轻、增重减少，并且在某些情况下，由于高烧导致母猪繁殖失败。猪甲型流感病毒(siav)是猪最重要的呼吸道病原体之一，其在全球猪群中的高流行率与该疾病的经济影响直接相关。在欧洲，目前在养殖猪群中传播并造成经济损失的主要甲型流感病毒亚型有四种，如brown所述(vet microbiol. 74(1-2):29-46 (2000))，该文献及本文引用的以下出版物均通过引用整体并入本文。自1980年代以来，h1n1(“禽”亚型)和h3n2猪流感病毒已在主要养猪国家地方性流行。h1n2病毒约二十年前引入欧洲猪群(brown等，vetrec. 13:328-329 (1995))，而h1n1“大流行”亚型(h1pdmn1)在2009年人类h1n1大流行期间通过从人传播给猪而引入猪群，并已在全球猪群中持续传播，估计在欧洲所有猪流感病毒感染中的平均流行率为8%(watson等，j virol. 89(19):9920-9931 (2015))。此外，猪流感对人类健康也有影响，因为iva以其人畜共患病潜力而闻名(thacker&janke，j infectdis. 15:197 suppl 1:s19-24 (2008))。针对siav的传统疫苗方法(肌内注射灭活病毒)提供持久保护，但在母源免疫背景下未能诱导保护性免疫。流感病毒的若干特征被认为与严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)高度相似，包括(i)其在上呼吸道粘膜中有效复制的能力，(ii)存在许多产生传染性病毒的无症状和少症状感染动物，以及(iii)其短潜伏期。如所知，已有针对sars-cov-2的mrna疫苗可用。信使rna(mrna)是dna和蛋白质之间的瞬时中间体，由rna组成，其包括侧翼为非编码区的蛋白质编码区。mrna中有三个主要功能区：5'非翻译区(5'-utr)、编码区(也称为编码序列(cds)或orf区)以及最后的3'非翻译区(3'-utr)。两个非翻译区(utr区)通常含有用于表达或rna加工的信号。特别地，mrna通常还含有5'帽和3'聚(a)尾，其允许mrna高效翻译为蛋白质。mrna的编码区所携带的信息由一系列密码子组成，即连续的三联体核苷酸，每个密码子编码相应蛋白质的一个氨基酸残基。在1980年代，mrna被体外转录并作为治疗用途的候选物出现，包括免疫疗法、病毒疫苗、基因组编辑和细胞重编程。mrna原则上可以满足编码和表达各种蛋白质的所有遗传信息需求。疫苗效率可通过修饰mrna序列来优化，这与其他种类的疫苗修饰相比是更便捷的方式(xu等，int j mol sci. 21:6582 (2020))。此外，尽管编码不同抗原，大多数mrna疫苗的生产和纯化过程相当相似。借助该技术可开发潜在的标准化生产工艺，而不是为每个新疫苗靶标专门开发特定的生产工艺。此外，mrna具有自佐剂特性，其通过rig-i/mda5、tlr3、tlr7和tlr8受体激活(a)先天免疫(verbeke等，immunity. 55(11):1993-2005 (2022))，并通过免疫细胞分泌肿瘤坏死因子α(tnfα)、干扰素α(ifnα)和其他细胞因子诱导(b)强烈且持久的适应性免疫应答，而多肽和蛋白质疫苗通常需要额外佐剂才能达到类似目的(iavarone等，expert revvaccines. 16(9):871-881 (2017))。只有mrna分子到达靶细胞、在正确的区室中并产生足够的蛋白质抗原以诱导保护性免疫，才能实现使用mrna作为抗原来源的期望免疫效果。寻求开发基于mrna的药物或疫苗，以便在宿主细胞中表达目标蛋白质。一旦进入宿主细胞的细胞质，mrna被核糖体读取并翻译成具有期望治疗活性的蛋白质。所用的递送系统包括脂质纳米颗粒(lnp)或脂质体，其通过将mrna包封在纳米颗粒或脂质囊泡内来保护mrna。综述文章guevara等(front chem. 8:589959 (2020))报道了使用其中包封mrna的lnp作为mrna递送载体及其用于癌症治疗。最近的sars-cov-2大流行加速了对快速疫苗解决方案的研究。与传统方法相比，mrna疫苗技术具有许多优势，例如在大流行情况下快速开发和大规模部署的潜力。rna治疗剂的开发应考虑若干缺点，例如(1)外源rna被环境和组织中普遍存在的rnase快速降解，(2)带负电荷的rna跨越疏水性细胞质膜的递送，以及(3)外源rna的强免疫原性可能导致细胞毒性并损害向治疗性蛋白质的翻译(damase等，front bioengbiotechnol. 9:628137 (2021))。已经开发了多种mrna递送方法以保护mrna免受核糖核酸酶降解，并中和或逆转其负电荷以增加细胞摄取，从而增加目标蛋白质的产生。迄今为止，脂质和聚合物基材料是主要的非病毒mrna递送系统。通常，阳离子脂质和聚合物用于通过与带负电荷的mrna的静电和疏水相互作用形成复合物。这些颗粒充当屏蔽物以防止mrna被酶降解，并反转极性以提高转染效率(chaudhary等，nat rev drug discov. 20(11):817-838 (2021))。脂质纳米颗粒递送mrna的实用性已在covid-19疫苗中得到成功证明，例如mrna-1273和bnt162b。在所有临床试验的mrna疫苗中，只有采用lnp-mrna制剂通过肌内途径注射的mrna-1273和bnt162b迄今被批准用于人类(wilson&geetha，j drug deliv scitechnol. 74:103553 (2022))。尽管考虑了静脉内、皮下、皮内和结内注射，但肌内给药途径仍被保留用于mrna疫苗给药(nikita等，2022)。肌内途径已用于疫苗给药数十年，且与皮下注射相比易于操作。该途径包括能够注射相对大量的疫苗以及与皮下注射相比疼痛和局部刺激减少。但肌内途径也可能引起不良事件，如经皮损伤，并且在皮肤屏障破坏后是炎症或污染的来源。此外，虽然若干报告评估了免疫个体血清中疫苗诱导的igg中和抗体的产生，但关于特异性粘膜免疫激活的数据很少。呼吸道和口腔粘膜是流感病毒的主要入侵途径，因此在这些组织中诱导特异性免疫应答的抗siav疫苗可能成为增强疫苗免疫应答和克服母源免疫的关键工具。在猪中，与其他哺乳动物(如小鼠)相比，共同粘膜免疫系统的概念直到最近才被重视。根据这一概念，使用一种粘膜途径免疫或接种，会局部和远程地触发粘膜位点的免疫系统(wilson&obradovic，mol immunol. 66:22-34 (2015))。这一现象可用于从皮肤触发到肺部(流感病毒的主要靶标)的粘膜免疫。皮肤含有免疫系统的重要早期预警组分，包括强大的抗原呈递细胞(apc)，如朗格汉斯细胞和树突状细胞，以及具有免疫活性的角质形成细胞(levin等，hum vaccimmunother. 11(4):991-997 (2015))。然而，抗原性化合物(通常为高分子量的生物大分子)穿越角质层到达基底表皮和真皮(其中存在免疫细胞)的能力非常低，这是一个主要障碍。已描述了用甘露糖化-壳聚糖修饰的负载mrna的醇质体进行经皮免疫以转染树突状细胞(dc)并诱导其成熟：将负载mrna疫苗或sirna的透皮贴剂，以及通过电喷雾将含有mrna或sirna的微球喷射到丝素蛋白基质表面(条件为：电压18 kv，挤出速率1 ml/h，接收距离15 cm，温度40℃，湿度8%)，允许在黑色素瘤同系小鼠模型中将核酸分子递送至皮肤深层(wang等，composites part b: engineering. 233:109648 (2022))。为此，将负载mrna疫苗的透皮贴剂贴附在小鼠裸露腹部皮肤上并用医用胶带固定3天，在第7天和第14天重复以加强免疫。然而，对于非侵入性mrna递送，需要一种易于生产的组合物，其施用可以简单进行，特别是在需要短时间内对大量动物进行疫苗接种的养殖环境中。wo2023144352a1公开了一种水包油纳米乳剂，其具有含有活性药物成分(api)的油相(所述api包含rna或疏水性药物)和水相。该水包油纳米乳剂除了api外，还包含高油酸食用油、植物蛋白、表面活性剂和水。然后将该水包油乳剂与变性植物蛋白和钙盐螯合剂的悬浮液组合以形成微粒。此类微粒可口服施用于对象，例如以片剂形式，据称其随后通过胃到达回肠，在那里蛋白质基质分解以释放含有api的油滴，然后被吸收。然而，由于通常在实践中向动物递送片剂是困难的，因此期望一种易于操作的非侵入性施用系统来向动物递送rna，例如通过局部施用。与口服施用后被吸附到血流中相比，局部施用还具有以下优点：其允许将rna递送至身体的特定位置。

背景技术：

技术实现思路

1、上述技术问题的解决方案通过说明书和权利要求书中表征的实施方案实现。

2、因此，本发明在其不同方面根据权利要求书来实施。

3、本发明基于以下令人惊讶的发现：向猪局部施用包含含有分别编码酶或免疫原的mrna的水相和油相的组合物，允许所述mrna的细胞摄取和翻译，从而分别在所述猪中产生特异性酶活性或诱导免疫。

4、在第一方面，本发明因此涉及一种组合物，其包含

5、- 含有核糖核酸(rna)的水相，和

6、- 油相，

7、并且其中所述组合物在下文中也称为“本发明组合物”。

8、所述含有rna的水相，在下文中也称为“本发明水相”，优选不含固体纳米颗粒，或分别地，特别是不含脂质纳米颗粒(lnp)和/或脂质样纳米颗粒(lln)。所述水相中含有的所述rna在下文中也称为“本发明rna”。

9、所述油相，在下文中也称为“本发明油相”，在室温下优选为液体或分别为液体。

10、术语“水相”特别指油包水乳剂的水性部分。术语“油相”特别指油包水乳剂的油性部分。更特别地，本文所用术语“水相”意指包含水且可额外包含亲水性共溶剂和水溶性物质的液相，并且其与油相不混溶。特别应理解，所述包含水的液相是rna可溶的相。本文所用术语“油相”更特别地意指与水不混溶的液相。

11、本文所用术语“所述水相中含有的rna”特别意指rna与所述包含水的液相接触。

12、本文所用术语“液相”特别指在室温(25℃)和大气压(760 mmhg)下为液体的相。

13、本文所用术语“水相”特别应理解为等同于“水溶液”。本文所用术语“油相”特别应理解为等同于“油”。

14、本文所用术语“核糖核酸”或“rna”分别特别意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子，并包括单链rna、双链rna、分离的rna、部分纯化的、纯的或合成的rna、重组产生的rna，以及经改变的rna或天然存在的rna的类似物，例如通过添加、缺失、替换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在rna的经改变rna。“核糖核苷酸”意指在β-d-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。本公开的rna分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。

15、特别应理解，本文所用术语“一种核糖核酸”或“一种rna”分别也包括复数指代，因此也涵盖多种核糖核酸或多种rna，或分别涵盖“一种或多种核糖核酸”或“一种或多种rna”。术语“核糖核酸”和“rna”分别特别应理解为等同于“核糖核酸分子”和“rna分子”。

16、优选地，水相中含有的rna溶解于所述水相中。根据此方面，含有rna的水相因而是其中溶解有rna的水相。在此上下文中，“溶解”特别应理解为“自由溶解”，即未结合至胶体或颗粒。因此，特别地，本发明rna在水相内可自由移动和/或不与纳米颗粒(如脂质纳米颗粒(lnp)和/或脂质样纳米颗粒(lln))结合。

17、根据一个优选方面，本发明组合物包含一种或多种表面活性剂。

18、优选地，所述一种或多种表面活性剂选自下文提及的第一表面活性剂或第二表面活性剂中的任一种，或是这些的混合物。

19、本文所用术语“表面活性剂”特别意指含有亲脂性链段和亲水性链段的化合物，其当加入水或溶剂时降低体系的表面张力。

20、特别地，本发明组合物包含两种表面活性剂，在本文中也称为“第一表面活性剂”和“第二表面活性剂”，其中所述第一和所述第二表面活性剂彼此不同。因此，本文提及的第二表面活性剂不同于本文提及的第一表面活性剂。

21、因此，本发明组合物特别包含或由以下组成：

22、- 含有rna的水相，

23、- 油相，

24、- 第一表面活性剂，和

25、- 第二表面活性剂。

26、优选地，所述第一表面活性剂是非离子型表面活性剂，或所述第二表面活性剂是非离子型表面活性剂。特别地，所述第一表面活性剂是非离子型表面活性剂，且所述第二表面活性剂是非离子型表面活性剂。

27、本文提及的“非离子型表面活性剂”特别指不带电荷的表面活性剂。因此特别应理解，非离子型表面活性剂不与溶液中的离子反应，且不在水中电离。

28、根据一个优选方面，所述第一表面活性剂是水溶性表面活性剂。

29、本文提及的术语“水溶性表面活性剂”特别指亲水亲油平衡(hlb)值大于10的表面活性剂。

30、本文所用术语“hlb值”是指griffin于1949年制定的亲水亲油平衡(hlb)标度(griffin, w.c. (1949) classification of surface-active agents by “hlb”.journal of cosmetic science, 1, 311-326)，其为0-20(20为亲水性)的标度，用于表征分子(如表面活性剂)的性质。

31、分子的hlb计算如下：

32、hlb=20*

mh/m

33、其中mh是分子亲水部分的分子质量，m是整个分子的分子质量，结果在0至20的标度上。hlb值为0对应于完全亲脂/疏水分子，值为20对应于完全亲水/疏脂分子。参见griffin, w. c. calculation of hlb values of nonionic surfactants, j. soc.cosmet. chem. 1954, 5, 249-256。常用表面活性剂的hlb值可从文献中容易获得(例如，mccutcheon's emulsifiers and detergents, mc publishing co., 2004中的hlb索引)。

34、根据一个优选方面，所述第一表面活性剂的hlb值大于10。

35、所述第二表面活性剂优选为辅表面活性剂。

36、本文提及的术语“辅表面活性剂”特别应理解为除第一表面活性剂之外还起作用以进一步降低液体表面张力的表面活性剂。

37、优选地，所述第二表面活性剂是水不溶性表面活性剂。

38、本文提及的术语“水不溶性表面活性剂”特别指hlb值小于10的表面活性剂。

39、所述第二表面活性剂优选具有小于10的hlb值。

40、根据另一个优选方面，本发明水相包含选自水和与水任意混合的其他水混溶性溶剂的混合物的溶剂。

41、本文提及的“水混溶性溶剂”特别指除水以外的溶剂(包括溶剂化合物的混合物)，其在室温下为液体，并且可按任意比例与水混合以形成均匀溶液。水混溶性溶剂的实例包括乙醇、乙二醇和/或甘油。

42、优选地，本发明水相包含水。

43、根据另一个优选方面，本发明油相选自矿物油和植物油。

44、本文所用术语“矿物油”特别指可从矿脂通过蒸馏获得的液体烃的混合物。矿物油可合成制备或从石油产品中纯化。本文所用术语“植物油”指可从蔬菜加工得到的任何油。

45、优选地，本发明油相是矿物油。

46、根据一个特别优选的方面，本发明组合物包含或由以下组成：

47、- 含有rna的水相，其中所述水相包含水；

48、- 油相，其中所述油相是矿物油；

49、- hlb值大于10的第一表面活性剂；和

50、- hlb值小于10的第二表面活性剂。

51、根据另一个优选方面，所述第一表面活性剂选自聚乙二醇衍生物、聚乙二醇、基于甘油的表面活性剂和聚乙二醇(peg)酯。

52、优选地，所述第一表面活性剂的hlb值为11至16。

53、根据另一个优选方面，所述第一表面活性剂包含peg-8辛酸/癸酸甘油酯或peg-6辛酸/癸酸甘油酯。

54、在又一个优选方面，所述第一表面活性剂的hlb值为11至13。

55、优选地，所述第一表面活性剂包含peg-8辛酸/癸酸甘油酯。

56、在另一个优选方面，所述第一表面活性剂包含单甘油酯、二甘油酯和/或三甘油酯。

57、在又一个优选方面，所述第一表面活性剂主要由peg-8辛酸/癸酸甘油酯组成。

58、最优选地，所述第一表面活性剂包含或由以下组成：

59、- 平均相对分子量在200至400之间的聚乙二醇的单酯和二酯，和

60、- 甘油单酯、二酯和三酯。

61、在一个优选方面，本文提及的第一表面活性剂包含或由以下组成：

62、- 辛酸(c8)和癸酸(c10)的peg-8(mw 400)单酯和二酯，和

63、- 单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。

64、在另一个优选方面，本文提及的第一表面活性剂由少量单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯以及主要为辛酸(c8)和癸酸(c10)的peg-8(mw 400)单酯和二酯组成。

65、在一个实例中，市售产品labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)用作所述第一表面活性剂，但其他表面活性剂也适用。因此，在一个优选实例中，所述第一表面活性剂是labrasol®，或分别地，所述第一表面活性剂是labrasol®中所含组分的混合物。

66、所述第二表面活性剂优选为聚甘油脂肪酸酯。

67、根据一个优选方面，所述第二表面活性剂的hlb值为约3至约8。

68、在另一个优选方面，所述第二表面活性剂选自聚甘油-3二油酸酯和聚甘油-6二油酸酯。

69、根据又一个优选方面，所述第二表面活性剂的hlb值为约3至约6。根据一个优选实例，所述第二表面活性剂的hlb值为约3。根据另一个优选实例，所述第二表面活性剂的hlb值为约6。

70、优选地，所述第二表面活性剂是聚甘油3二油酸酯。

71、在一个实例中，市售产品聚甘油3二油酸酯plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france)用作所述第二表面活性剂，但其他表面活性剂也适用。

72、因此，在一个优选实例中，所述第二表面活性剂是plurol® oleique cc 497，或分别地，所述第二表面活性剂是plurol® oleique cc 497中所含组分的混合物。

73、在一个优选方面，本发明水相选自：

74、- 含有rna的水性缓冲溶液，

75、- 含有rna的水，和

76、- 以下物质的混合物：

77、• 水

78、或

79、• 水性缓冲溶液

80、与任何其他水混溶性溶剂，

81、其中所述混合物含有rna。

82、优选地，所述水相包含或由水性缓冲溶液组成。

83、根据一个特别优选的方面，本发明水相是含有rna的水性缓冲溶液。

84、本发明油相优选为矿物油，选自液体石蜡，以及由源自石油的饱和烃(如十六烷或油酸甲酯或油酸乙酯)组成的油性液体。

85、优选地，所述油相是液体石蜡。

86、在一个优选方面，本发明组合物包含或由以下组成：

87、- 含有rna的水相，其中所述含有rna的水相是含有rna的水性缓冲溶液；

88、- 油相，其中所述油相是液体石蜡；

89、- 第一表面活性剂，其中所述第一表面活性剂包含或主要由peg-8辛酸/癸酸甘油酯组成；和

90、- 第二表面活性剂，其中所述第二表面活性剂是聚甘油-3二油酸酯。

91、特别地，优选本发明油相是液体饱和烃的纯化混合物。优选地，所述油相通过催化加氢纯化从石油获得。

92、优选地，本发明油相包含

93、约67%至约68%的链烷烃碳，和/或

94、约32%至约33%的环烷烃碳。

95、根据另一个优选方面，本发明油相在20℃下的动态粘度不超过约100 mpa·s，优选不超过约50 mpa·s，更优选不超过约30 mpa·s，最优选不超过约20 mpa·s。在一个特别优选的方面，本发明油相在20℃下的动态粘度为约10 mpa·s至约100 mpa·s，优选约10mpa·s至约50 mpa·s，更优选约10 mpa·s至约30 mpa·s，最优选约10 mpa·s至约20mpa·s。根据一个优选实例，本发明油相在20℃下的动态粘度为约12 mpa·s。

96、在一个实例中，市售矿物油marcol® 52(exxon，美国)用作本发明油相，但其他油也适用。

97、因此，在一个优选实例中，本发明油相是marcol® 52，或分别地，本发明油相是marcol® 52中所含组分的混合物。

98、优选地，本文提及的水性缓冲溶液选自柠檬酸盐缓冲液、pbs缓冲液和tris缓冲液。

99、在一个特别优选的方面，本发明水相是含有rna的柠檬酸盐缓冲液。

100、本文所用术语“柠檬酸盐缓冲液”特别指含有柠檬酸根离子的缓冲液(即当加入酸或碱性组分时能抵抗ph变化的溶液)。在此，柠檬酸盐缓冲液的具体实施方案可选自柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸钾缓冲液、柠檬酸钙缓冲液和柠檬酸镁缓冲液中的任一种，但不限于此。

101、优选地，所述柠檬酸盐缓冲液的ph值为5.0至6.8，最优选ph值为6.4 ± 0.2。

102、优选地，本发明组合物是乳剂。

103、本文所用术语“乳剂”特别指两种或更多种通常不混溶(不可混合或不能共混)的液体的混合物。在乳剂中，一种液体(分散相)分散在另一种液体(连续相)中。乳剂的实例包括油醋汁、均质牛奶、蛋黄酱等。

104、在一个优选方面，本发明组合物是其中水相分散在油相中的乳剂。因此，优选地，本发明水相是分散相，本发明油相是连续相。

105、本发明组合物优选为油包水乳剂。

106、本文提及的“油包水乳剂”特别指油包水混合物，其中油形成连续相，水呈不连续液滴。油包水乳剂可通过电乳剂测试仪与水包油乳剂区分。水包油乳剂由于水形成其外部或连续相而具有相对较低的电阻导电，而油包水乳剂不导电或导电性很差。

107、在一个优选方面，本发明组合物是微乳剂。

108、本文所用术语“微乳剂”具有本领域的普通含义，指一种不混溶液体在另一种液体中的分散体，呈液滴形式，直径大约在约1至约1000 nm范围内，最优选低于约350 nm。本发明微乳剂优选涉及本发明水相在本发明油相中的分散体，呈液滴形式，直径大约在约1至约500 nm，或约1至约350 nm，或约5至约500 nm，或约5至约350 nm，或最优选约5至约200 nm范围内。所述范围在本文中也称为“液滴尺寸分布”。优选地，所述微乳剂是均匀的热力学稳定体系。

109、优选地，本发明水相以平均直径在5至95 nm、更优选10至90 nm、甚至更优选15至85 nm、仍更优选20至80 nm、最优选25至75 nm范围内的液滴形式分散在本发明油相中。所述平均直径在本文中也称为“平均液滴尺寸”。

110、液滴尺寸分布或平均液滴尺寸可由本领域技术人员使用实施例4中所述的动态光散射(dls)技术确定。在有争议结果和任何疑问的情况下，本文提及的液滴尺寸分布和平均液滴尺寸是指可通过实施例4中所述的dls技术估计的那些。

111、在一个优选方面，本发明组合物是乳剂，特别是微乳剂，其中所述乳剂是热力学稳定的。

112、在另一个优选方面，本发明组合物是乳剂，特别是微乳剂，其中所述乳剂是各向同性的。

113、在又一个优选方面，本发明组合物是乳剂，特别是微乳剂，其中所述乳剂是光学透明的。

114、在再一个优选方面，本发明组合物是乳剂，特别是微乳剂，其中所述乳剂是乳光的。

115、最优选地，本发明组合物是热力学稳定的、光学透明的和各向同性的液体混合物。特别地，本发明组合物是油包水微乳剂。

116、在一个优选方面，在本发明组合物中，本发明水相的终浓度约为5%至30% v/v(体积/体积)。

117、最优选地，在本发明组合物中，本发明水相的终浓度约为14.3%至24.3% v/v。

118、根据另一个优选方面，在本发明组合物中，本发明油相的终浓度约为5%至30% v/v。

119、最优选地，在本发明组合物中，本发明油相的终浓度约为8.5%至18.5% v/v。

120、在另一个优选方面，在本发明组合物中，所述第一表面活性剂的终浓度约为30.7%至70.7% v/v。

121、最优选地，在本发明组合物中，所述第一表面活性剂的终浓度约为31.9%至41.9%v/v。

122、根据另一个优选方面，在本发明组合物中，所述第二表面活性剂的终浓度约为17.5%至57.5% v/v。

123、最优选地，在本发明组合物中，所述第二表面活性剂的终浓度约为25.2%至35.2%v/v。

124、根据一个特别优选的方面，在本发明组合物中：

125、- 本发明水相的终浓度约为19% v/v，

126、- 本发明油相的终浓度约为14% v/v，

127、- 所述第一表面活性剂的终浓度约为37% v/v，且

128、- 所述第二表面活性剂的终浓度约为30% v/v。

129、根据另一个优选方面，本发明rna在本发明组合物中的终浓度约为0.1至500 µg/ml(µg/ml)，其中应理解在所述浓度(µg/ml)中，所述质量(µg)涉及本发明rna，所述体积(ml)涉及本发明组合物。

130、优选地，本发明rna在本发明组合物中的终浓度至少约为1 µg/ml。

131、根据另一个优选方面，本发明rna在本发明组合物中的终浓度至少约为30 µg/ml。

132、特别地，本发明rna在本发明组合物中的终浓度优选约为1至500 µg/ml，特别是约30至500 µg/ml。

133、根据另一个优选方面，本发明rna在本发明组合物中的终浓度约为1至400 µg/ml，最优选约30至300 µg/ml。

134、更特别地，优选在本发明组合物中，本发明rna的终浓度约为200 µg/ml。

135、本发明rna优选选自信使rna(mrna)、小干扰rna(sirna)和微小rna(mirna)。

136、本文所用术语“信使rna”(mrna)特别指任何多核苷酸，其可以是合成的，其编码多肽(例如免疫原性蛋白)，并且能够在体外、体内、原位或离体翻译以产生所编码的多肽。本文所用术语“小干扰rna”(sirna)特别指参与rnai的低分子量(通常19-27个碱基对)双链rna。本文所用术语“rnai”意指rna干扰。本文提及的术语“微小rna”(mirna)特别指长约22个核苷酸的非编码rna分子，其通过与mrna的3'非翻译区(utr)形成碱基对而在基因表达的转录后调控中发挥作用。

137、最优选地，本发明rna是mrna，并且所述mrna在下文中也称为“本发明mrna”。

138、特别地，本发明mrna包含5´-utr、编码多肽的编码区和3´-utr。本文所用术语“编码区”特别指mrna中可以翻译成氨基酸链(即通过肽键连接的两个或更多个氨基酸)的部分或区域。更特别地，所述编码区侧翼为所述5´-utr和所述3´-utr。根据一个优选方面，本发明mrna包含聚(a)尾，其中所述聚(a)尾优选位于所述3´-utr之后沿3´方向。优选地，所述3´-utr侧翼为聚(a)尾。最优选地，本发明mrna包含编码多肽的编码区，其中所述编码区侧翼为5´-utr和3´-utr，并且其中所述3´-utr侧翼为聚(a)尾。特别应理解，本文提及的编码区还包含至少一个终止密码子，特别是在编码区的3´端。优选地，所述3´-utr位于所述终止密码子之后，并且特别地在3´方向侧翼连接所述终止密码子。

139、最优选地，本发明mrna包含(从5´至3´方向)5´-utr、编码区、3´-utr和聚(a)尾。

140、本文所用术语“非翻译区”或“utr”涉及mrna中起始密码子上游和终止密码子下游不被翻译的区段，因此分别称为5'非翻译区(5' utr)和3'非翻译区(3' utr)。这些区域与编码区一起被转录，因此由于它们存在于成熟mrna中而是外显子的。

141、在本发明中，3'非翻译区(3'-utr)涉及信使rna(mrna)中紧接翻译终止密码子之后的区段。3' utr可包含3'-非翻译区内的调控区域，已知这些区域影响mrna的多聚腺苷酸化和稳定性。许多3'-utr还含有au富含元件(are)。此外，3'-utr优选可含有序列aauaaa，其指导将称为聚(a)尾的数百个腺嘌呤残基添加到mrna转录物的末端。5'非翻译区(5'-utr)(也称为前导序列或前导rna)是mrna中紧接起始密码子上游的区域。5' utr从转录起始位点开始，并在编码区起始密码子(通常在mrna中为aug)之前一个核苷酸(nt)处结束。在真核生物中，5'-utr的长度通常为100至数千个核苷酸长，但有时在真核生物中也出现较短的utr。

142、本文所用术语“聚(a)尾”或“聚(a)序列”指腺苷酸残基的不间断或间断序列，其通常位于mrna分子的3'末端。聚(a)尾或聚(a)序列是本领域技术人员已知的，并且可位于本文所述rna(特别是mrna)中的3'-utr之后。不间断聚(a)尾的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断聚(a)尾是典型的。本文公开的rna(特别是mrna)可在转录后通过不依赖于模板的rna聚合酶在rna的游离3'末端连接聚(a)尾，或者聚(a)尾可由dna编码并由依赖于模板的rna聚合酶转录。

143、已证明约120个a核苷酸的聚(a)尾对转染真核细胞中mrna的水平以及从存在于聚(a)尾上游(5´)的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(holtkamp等，blood, 108:4009-4017 (2006))。

144、聚(a)尾可为任何长度。在一些实施方案中，聚(a)尾包含、基本由或由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个a核苷酸组成，特别是约120个a核苷酸。在此上下文中，“基本由……组成”意指聚(a)尾中的大多数核苷酸，通常按聚(a)尾中核苷酸数目计至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%是a核苷酸，但允许其余核苷酸是a核苷酸以外的核苷酸，例如u核苷酸(尿苷酸)、g核苷酸(鸟苷酸)或c核苷酸(胞苷酸)。在此上下文中，“由……组成”意指聚(a)尾中的所有核苷酸，即按聚(a)尾中核苷酸数目计100%是a核苷酸。术语“a核苷酸”或“a”指腺苷酸。

145、在一些实施方案中，聚(a)尾在rna转录期间(例如在体外转录rna的制备期间)基于包含编码链互补链中重复dt核苷酸(脱氧胸苷酸)的dna模板连接。编码聚(a)尾(编码链)的dna序列称为聚(a) cassette。

146、根据一个优选方面，本发明mrna包含kozak序列。本文提及的“kozak序列”特别指mrna中包含的共有序列，其被核糖体识别以起始多肽翻译。

147、本文提及的kozak序列特别具有rna序列(从5´至3´方向)rccaug，优选rccaugg，其中aug是编码区的起始密码子，r选自a和g。在一个优选实例中，本发明mrna包含kozak序列accaugg。

148、在一个非限制性实例中，本发明mrna包含(从5´至3´方向)5´-utr、编码区、3´-utr和聚(a)尾，并且包含kozak序列，其是seq id no:3的mrna，其中：

149、- seq id no:3的核苷酸第1至359位对应于5´-utr，

150、- seq id no:3的核苷酸第360至1070位对应于编码区，

151、- seq id no:3的核苷酸第357至363位对应于kozak序列，

152、- seq id no:3的核苷酸第1071至1332位对应于3´-utr，

153、- seq id no:3的核苷酸第1333至1452位对应于聚(a)尾。

154、根据另一个方面，本发明mrna优选含有一个或多个修饰，例如为了增加其稳定性和/或增加翻译效率和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，为了增加mrna的表达，可在编码区内(即编码所表达肽或多肽的序列内)对其进行修饰，优选不改变所表达肽或多肽的序列。

155、此类修饰例如描述于wo2007/036366、wo2019/175356或wo2023/147352中，并包括以下：5'-帽结构；天然存在的聚(a)尾的延伸或截短；5'-和/或3'-非翻译区(utr)的改变，例如引入与所述rna的编码区不相关的utr；将一个或多个天然存在的核苷酸替换为合成核苷酸；以及密码子优化(例如改变、优选增加rna的gc含量)。

156、根据一个特别优选的方面，本发明mrna包含5'-帽结构。在一些实施方案中，本发明mrna不具有未加帽的5'-三磷酸。在一些实施方案中，本发明mrna可包含常规5'-帽和/或5'-帽类似物。本文所用术语“5'-帽结构”特别应理解为涵盖“常规5'-帽”以及“5'-帽类似物”。最优选地，本发明mrna包含常规5'-帽。

157、术语“常规5'-帽”指在mrna分子的5'末端发现的帽结构，通常由鸟苷5'-三磷酸(gppp)组成，其通过其三磷酸部分连接到mrna的下一个核苷酸的5'末端(即鸟苷通过5'至5'三磷酸键连接到mrna的其余部分)。鸟苷可在n7位甲基化(产生帽结构m7gppp)。在本技术上下文中，术语“cap0”或“cap0结构”分别意指结构“m7gpppn”，其中n是在2'位带有oh部分的任何核苷。根据本技术，术语“cap1”或“cap1结构”分别意指结构“m7gpppnm”，其中nm是在2'位带有och3部分的任何核苷。根据本技术，术语“cap2”或“cap2结构”分别意指结构“m7gpppnmnm”，其中每个nm独立地是在2'位带有och3部分的任何核苷。

158、根据一个优选实例，本发明mrna包含cap1结构，特别是结构m7gpppnm。因此，本发明mrna优选包含具有cap1结构m7gpppnm的5´-帽，其中“m7gppp”代表其中鸟苷在n7位甲基化的鸟苷5'-三磷酸，“nm”代表在2'位带有och3部分的任何核苷，并且其中m7gppp通过其三磷酸部分连接到nm的5'末端。

159、根据一个特别优选的方面，本发明mrna包含具有cap1结构m7gpppam的5´-帽，其中am是在2´位带有och3部分的腺苷。因此，最优选本发明mrna包含m7gpppam帽。具有所述帽的mrna的生产可例如通过使用cleancap® ag试剂(trilink biotechnologies, san diego(ca), usa, 产品号n-7113)按照制造商说明进行。

160、因此，本发明mrna优选包含具有cap1结构m7gpppam的5´-帽，其中“m7gppp”代表其中鸟苷在n7位甲基化的鸟苷5'-三磷酸，“am”代表在2'位带有och3部分的腺苷，并且其中m7gppp通过其三磷酸部分连接到am的5'末端。

161、术语“5'-帽类似物”意指常规5'-帽的结构衍生物。例如，在结构m7gppp中，在n7位甲基化的鸟苷可包含在c-3´位的羟基上的氢被甲基取代(产生帽结构m7(3´ome)gppp)。因此，本文提及的结构m7(3´ome)gppp特别意指结构m7gppp，但其中在n7位甲基化的鸟苷在3'位带有och3部分。5'-帽类似物的实例例如描述于wo2023/147352或wo2019/175356中。

162、在本技术上下文中，术语“cap0类似物”或“cap0类似物结构”分别意指结构“m7gpppn”的结构衍生物，并且其中所述结构衍生物优选为结构“m7(3´ome)gppp”。根据本技术，术语“cap1类似物”或“cap1类似物结构”分别意指结构“m7gpppnm”的结构衍生物，并且其中所述结构衍生物优选为结构“m7g(3´ome)pppnm”。根据本技术，术语“cap2类似物”或“cap2类似物结构”分别意指结构“m7gpppnmnm”的结构衍生物，并且其中所述结构衍生物优选为结构“m7g(3´ome)pppnmnm”。

163、根据一个优选实例，本发明mrna包含cap1类似物结构，特别是结构m7g(3´ome)pppnm。

164、例如，本发明mrna可包含具有cap1类似物结构m7g(3´ome)pppam的5´-帽类似物，其中am是在2´位带有och3部分的腺苷。具有所述帽的mrna的生产可例如通过使用cleancap® ag 3´ome试剂(trilink biotechnologies, san diego (ca), usa, 产品号n-7413)按照制造商说明进行。

165、提供具有5'-帽结构的mrna可通过在存在相应5'-帽化合物的情况下对dna模板进行体外转录来实现，其中所述5'-帽结构共转录地整合到产生的mrna链中，或者mrna可例如通过体外转录产生，并且5'-帽结构可在转录后使用加帽酶(例如牛痘病毒的加帽酶)连接到mrna上。向mrna提供5'-帽结构的方法是本领域技术人员已知的，并且例如总结在综述文章muttach等，beilstein j org chem. 13:2819-2832 (2017)和ramanathan等，nucleicacids res. 44(16):7511-7526 (2016)中。

166、优选地，本发明mrna编码选自抗原、功能性蛋白和报告蛋白的肽或多肽。

167、根据一个优选方面，本发明rna是编码抗原或功能性蛋白的mrna。

168、在本发明mrna的上下文中，措辞“编码的mrna”或“mrna编码”分别等同于“包含编码……的编码区的mrna”或“mrna包含编码……的编码区”。

169、本文提及的术语“抗原”通常指一种物质，例如多肽或肽，其如果施用于宿主，可在宿主中引发免疫应答。本文所用术语“抗原”可与术语“免疫原”互换。在一个实例中，本文提及的抗原可以是免疫原性蛋白或免疫原性蛋白结构域。本文所用术语“免疫原性”意指“能够在宿主中引发体液和/或细胞免疫应答”。

170、本文所用术语“功能性蛋白”意指当与其接触时能够影响产物的结构和/或外观的多肽，例如起到作用于底物的酶的功能。

171、本文所用术语“多肽”特别指通过肽键连接在一起的任何氨基酸残基链，并且不指特定长度的产物。例如，“多肽”可指长链氨基酸残基，例如长度为150至600个氨基酸残基或更长。术语“多肽”特别包括通过一种或多种共翻译和/或翻译后修饰而被改变的多肽，其中此类修饰包括例如糖基化、磷酸化、脂化(例如肉豆蔻酰化等)、乙酰化、泛素化、硫酸化、adp核糖基化、羟基化、cys/met氧化、羧化、甲基化等。术语“多肽”和“蛋白质”在本发明上下文中可互换使用。

172、本文所用“编码的mrna”特别意指如果存在于适当环境中(优选在细胞内)，所述mrna能够被表达以产生其编码的蛋白质或肽。

173、最优选地，本发明rna是编码抗原的mrna。

174、根据一个优选方面，本发明rna是编码抗原性肽或抗原性多肽的mrna。

175、本文提及的“抗原性肽或抗原性多肽”特别指能够在宿主(特别是动物)中引发、产生或生成免疫应答的肽或多肽。在本发明上下文中应理解，术语“抗原性”等同于“免疫原性”。

176、根据另一个优选方面，本发明rna是编码报告蛋白的mrna。本文所用术语“报告蛋白”特别指由报告基因编码的蛋白质。术语“报告基因”指任何表达可检测基因产物的基因，特别是其表达可被测量的任何基因，例如可检测荧光蛋白或酶的表达。在此方面的一个实施方案中，本发明rna是编码荧光蛋白的mrna，特别选自mcherry、gfp(绿色荧光蛋白)及所述蛋白质的衍生物。示例性地，本发明rna是编码mcherry衍生物的mrna，其中所述mcherry衍生物包含或由与seq id no:1的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%序列相同性的氨基酸序列组成。seq id no:1的序列可在genbank登录号ay678264.1下找到。所述编码mcherry衍生物的mrna优选包含与seq id no:2的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列。

177、根据一个特别优选的方面，本发明rna是编码酶的mrna。术语“酶”指具有催化活性的蛋白质。例如，催化活性包括去磷酸化活性。在一个实例中，本发明rna是编码水解酶(如碱性磷酸酶)的mrna。

178、在此方面的一个实施方案中，本发明rna是编码人碱性磷酸酶的mrna。示例性地，本发明rna是编码分泌型胚胎人碱性磷酸酶(seap)的mrna，即人胎盘碱性磷酸酶(plap)的c端截短变体。优选地，本发明rna是编码seap的mrna，所述seap包含或由与seq id no:4的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%序列相同性的氨基酸序列组成。seq id no:4的序列可在genbank登录号aab64400.1下找到。所述编码seap的mrna优选包含与seq id no:5的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列。

179、应理解，本文所用措辞“由氨基酸序列组成”或“由氨基酸序列组成”分别特别还涉及表达所述蛋白质或蛋白质结构域的细胞所影响的所述氨基酸序列的任何共翻译和/或翻译后修饰。因此，本文所述措辞“由氨基酸序列组成”或“由氨基酸序列组成”分别还针对(除非另有明确提及)具有由表达所述蛋白质或蛋白质结构域的细胞所影响的一种或多种修饰的氨基酸序列，特别是蛋白质生物合成和/或蛋白质加工中影响的氨基酸残基修饰，优选选自糖基化、磷酸化和乙酰化。

180、关于本发明上下文中提及的术语“至少90%”，应理解所述术语优选涉及“至少91%”，更优选涉及“至少92%”，仍更优选涉及“至少93%”或特别是“至少94%”。

181、关于本发明上下文中提及的术语“至少95%”，应理解所述术语优选涉及“至少96%”，更优选涉及“至少97%”，仍更优选涉及“至少98%”或特别是“至少99%”。

182、关于本发明上下文中提及的术语“至少99%”，应理解所述术语优选涉及“至少99.2%”，更优选涉及“至少99.4%”，仍更优选涉及“至少99.6%”或特别是“至少99.8%”。

183、本文所用术语“具有100%序列相同性”应理解为等同于术语“是相同的”。

184、百分比序列相同性具有本领域公认的含义，并且有多种方法测量两个多肽或多核苷酸序列之间的相同性。参见例如lesk, ed., computational molecular biology,oxford university press, new york, (1988); smith, ed., biocomputing:informatics and genome projects, academic press, new york, (1993); griffin&griffin, eds., computer analysis of sequence data, part i, humana press, newjersey, (1994); von heinje, sequence analysis in molecular biology, academicpress, (1987); and gribskov&devereux, eds., sequence analysis primer, mstockton press, new york, (1991)。用于比对多核苷酸或多肽的方法编码在计算机程序中，包括gcg程序包(devereux等，nuc. acids res. 12:387 (1984))、blastp、blastn、fasta(atschul等，j. molec. biol. 215:403 (1990))和bestfit程序(wisconsinsequence analysis package, version 8 for unix, genetics computer group,university research park, 575 science drive, madison, wis. 53711)，其使用smith和waterman的局部同源性算法(adv. app. math., 2:482-489 (1981))。例如，可采用使用fasta算法的计算机程序align，使用仿射空位搜索，空位开放罚分为-12，空位延伸罚分为-2。为本发明目的，核苷酸序列使用dnastar inc.的megalign软件版本11.1.0 (59), 419中的clustal w方法，使用程序中设置的默认多比对参数(空位罚分=15.0，空位长度罚分=6.66，延迟发散序列(%)=30%，dna转换权重=0.50，dna权重矩阵=iub)进行比对，以及分别地，蛋白质/氨基酸序列使用dnastar inc.的megalign软件版本11.1.0 (59), 419中的clustal w方法，使用程序中设置的默认多比对参数(gonnet系列蛋白质权重矩阵，空位罚分=10.0，空位长度罚分=0.2，延迟发散序列(%)=30%)进行比对。

185、本文所用，特别应理解术语“与seq id no:x的序列的序列相同性”等同于术语“与seq id no:x的序列在seq id no:x的全长上的序列相同性”或等同于术语“与seq id no:x的序列在seq id no:x的整个长度上的序列相同性”。在此上下文中，“x”是选自1至7的任意整数，因此“seq id no:x”代表本文提及的任何seq id no。

186、根据一个优选方面，本发明rna是编码病原体抗原的mrna。本文提及的“病原体抗原”特别指由病原体基因组编码或源自其的抗原。本文所用术语“病原体”指在宿主中引起疾病状态(例如感染、脓毒症等)的生物剂。“病原体”包括但不限于病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。

187、优选地，本发明rna是编码选自病毒抗原、细菌抗原和源自寄生虫的抗原的mrna。

188、在一个特别优选的方面，本发明rna是编码病毒抗原的mrna。

189、本文所用术语“病毒抗原”特别意指源自病毒或其组分或两者的抗原，所述病毒抗原能够诱导免疫应答。因此，所述病毒抗原特别是病毒蛋白或其免疫原性片段。术语“病毒蛋白”涵盖源自病毒的任何蛋白质。具体实例包括病毒糖蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒外壳蛋白、病毒包膜蛋白和病毒核心蛋白。

190、优选地，所述病毒抗原是rna病毒抗原。术语“rna病毒”指其基因组包含rna的病毒。特别地，所述病毒是单链(ss)rna病毒，因此所述病毒抗原优选是ss rna病毒抗原。

191、在一个特定方面，本发明rna是编码病毒糖蛋白或病毒衣壳蛋白的mrna。

192、优选地，本发明rna是编码病毒糖蛋白的mrna。

193、术语“糖蛋白”在本文中以其正常科学含义使用，特别指经修饰以包含共价结合至蛋白质的一个或多个单糖或寡糖链(“聚糖”)的蛋白质。聚糖可连接到蛋白质上的羟基(o-连接聚糖)，例如连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基，或连接到蛋白质上的酰胺官能团(n-糖蛋白)，例如天冬酰胺或精氨酸，或连接到蛋白质上的碳(c-糖蛋白)，例如色氨酸。糖蛋白可包含多于一个聚糖，可包含一个或多个单糖和一个或多个寡糖聚糖的组合，并可包含n-连接、o-连接和c-连接聚糖的组合。本文提及的“病毒糖蛋白”特别意指由病毒基因组编码或源自其的糖蛋白。

194、在一个优选实例中，本文提及的病毒是流感病毒。因此，在本发明上下文中，本文提及的病毒抗原示例性地是流感病毒抗原，本文提及的病毒糖蛋白优选是流感病毒糖蛋白。

195、具体地，本文提及的病毒优选是甲型流感病毒。术语“甲型流感病毒”应理解为特别等同于“a型流感病毒”或“流感病毒a”，如流感病毒上下文中常用，“a”表示病毒的抗原型别(基于核蛋白的抗原特异性)。因此，在本发明上下文中，本文提及的病毒抗原示例性地是甲型流感病毒抗原，本文提及的病毒糖蛋白优选是甲型流感病毒糖蛋白。

196、更具体地，本文提及的病毒优选是猪流感病毒。因此，在本发明上下文中，本文提及的病毒抗原示例性地是猪流感病毒抗原，本文提及的病毒糖蛋白优选是猪流感病毒糖蛋白。

197、仍更具体地，本文提及的病毒优选是猪甲型流感病毒。因此，在本发明上下文中，本文提及的病毒抗原示例性地是猪甲型流感病毒(siav)抗原，本文提及的病毒糖蛋白优选是siav糖蛋白。本文所用术语“猪甲型流感病毒”和“siav”分别应理解为可与“猪流感病毒a”和“猪a型流感病毒”互换，其中“a”表示流感病毒的抗原型别。

198、例如，术语“猪甲型流感病毒抗原”或“siav抗原”分别特别意指源自猪甲型流感病毒(siav)或其组分或两者的肽或多肽，所述肽或多肽能够诱导免疫应答。因此，在一个实例中，本发明rna是编码siav抗原的mrna。或者更特别地，本发明rna是编码例如猪甲型流感病毒(siav)糖蛋白或其免疫原性片段的mrna。因此，在一个实例中，所述mrna编码siav糖蛋白。

199、甚至更具体地，本文提及的病毒优选是猪甲型流感病毒h3n2亚型。因此，在本发明上下文中，本文提及的病毒抗原示例性地是猪甲型流感病毒a亚型h3n2抗原，本文提及的病毒糖蛋白优选是猪甲型流感病毒a亚型h3n2糖蛋白。

200、本文所用流感病毒的抗原型别(例如“a”，如术语“甲型流感病毒”和“a型流感病毒”中所表达)、亚型(例如“h3n2”)和血凝素的抗原特征(例如“h3”)特别涉及世界卫生组织公报，58(4):585-591 (1980)中公布的国际公认的流感病毒命名体系。

201、根据一个优选实例，本发明rna是编码血凝素或其免疫原性片段的mrna。在一个实例中，所述mrna编码血凝素。

202、特别地，本发明rna是编码血凝素3(h3)的mrna。根据另一个优选方面，本发明rna是编码其免疫原性片段(即h3的免疫原性片段)的mrna。本文所用术语“血凝素3”和“h3”分别应理解为等同于“血凝素3蛋白”和“h3蛋白”。

203、最优选地，本发明rna是编码siav的h3或其免疫原性片段的mrna。在一个实例中，所述rna编码siav的h3。

204、本文提及的术语“免疫原性片段”特别应理解为指蛋白质的片段，其至少部分保留其所源自的蛋白质的免疫原性。因此，例如“siav的h3的免疫原性片段”特别应理解为指siav的h3的片段，其至少部分保留全长h3蛋白的免疫原性。

205、根据一个优选方面，本发明rna是编码血凝素的mrna，所述血凝素包含或由与seqid no:6的序列具有至少95%、优选至少98%、更优选至少99%或特别是100%序列相同性的氨基酸序列组成。

206、所述编码血凝素的mrna优选包含与seq id no:7的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列。

207、根据本发明的另一个优选方面，本文提及的mrna是合成mrna。

208、“合成mrna”意指在细胞外产生的mrna，或使用生物工程在细胞内产生的mrna，通过非限制性实例，在体外转录反应中产生的mrna、通过直接化学合成产生的mrna或在基因工程大肠杆菌细胞中产生的mrna。

209、根据本发明的另一个特别优选的方面，本文提及的mrna是核苷修饰的mrna。

210、术语“核苷修饰的rna”指含有一种或多种核苷相对于等效rna核苷通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的mrna。在一个优选实施方案中，所述修饰的核苷包含修饰的糖部分。在一个实例中，核苷修饰的mrna是其中至少一个尿苷被假尿苷替换的mrna。

211、根据另一个优选方面，本发明mrna的长度至少为300个核苷酸，优选至少为500个核苷酸，更优选至少为1000个核苷酸，最优选至少为1500个核苷酸。

212、在另一个优选方面，本发明mrna的长度为300至5000个核苷酸，优选为500至4000个核苷酸，最优选为1000至3000个核苷酸。

213、本发明还提供用作药物、优选用作疫苗、或用于在身体上实施的诊断方法的本发明组合物。

214、在另一方面，本发明还涉及本发明组合物在制备药物、优选疫苗、或在制备诊断剂中的用途。

215、本文所用术语“疫苗”特别指包含至少一种免疫活性组分的药物组合物，当其施用于动物时在动物中诱导免疫应答。

216、此外，本发明提供用于将本发明rna递送至对象的方法中的本发明组合物，其中所述方法包括将本发明组合物局部施用于所述对象。

217、在另一方面，本发明涉及用于将本发明rna通过皮肤递送至对象的方法中的本发明组合物，其中所述方法包括将本发明组合物施用于所述对象的皮肤。

218、本发明还提供一种将核糖核酸(rna)递送至对象的方法，包括将本发明组合物局部施用于所述对象的步骤。

219、同时，本发明提供一种将核糖核酸(rna)通过皮肤递送至对象的方法，包括将本发明组合物施用于所述对象的皮肤的步骤。

220、在每种所述递送核糖核酸(rna)的方法中，优选本发明组合物的水相含有待递送至所述对象的rna。因此，在所述递送核糖核酸(rna)的方法中，待递送至所述对象的rna优选为本发明rna。

221、在本文所述的本发明上下文中的任何医学用途和递送方法中，特别优选将本发明组合物局部施用于对象耳部表面。最优选地，将本发明组合物局部施用于对象的内耳廓。由此，可实现rna向对象的特别简单的施用。

222、本发明还提供用于在对象中诱导免疫应答的方法中的本发明组合物。所述免疫应答特别是针对本发明mrna编码的抗原的免疫应答。

223、本文所述的“免疫应答”可以是细胞和/或抗体介导的免疫应答，特别是针对本发明mrna编码的抗原和/或针对所述抗原来源的病原体的免疫应答。

224、通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种效应：产生或激活特异性针对本发明免疫原性组合物中包含的rna所编码的一种或多种抗原的抗体、b细胞、辅助t细胞、抑制t细胞和/或细胞毒性t细胞和/或γδt细胞。优选地，施用包含编码抗原的本发明mrna的本发明组合物的对象将显示保护性免疫应答或治疗性应答。

225、“保护性免疫应答”将通过感染宿主通常显示的一种或多种临床体征的减少或缺失、更快的恢复时间和/或感染性持续时间缩短或感染宿主组织或体液或排泄物中病原体滴度降低来证明。

226、本发明特别提供用于在对象中诱导免疫应答的方法中的本发明组合物，其中所述免疫应答是针对本发明mrna编码的抗原的免疫应答。

227、本发明还提供用于在对象中诱导免疫应答的方法中的本发明组合物，其中所述免疫应答优选是针对病原体的免疫应答。

228、特别地，本发明组合物用于在对象中诱导针对选自病毒、细菌和寄生虫的病原体的免疫应答的方法中。

229、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对病毒的免疫应答的方法中。

230、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法中。

231、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对猪流感病毒的免疫应答的方法中。

232、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对猪甲型流感病毒(siav)的免疫应答的方法中。

233、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对包含h3的流感病毒的免疫应答的方法中。

234、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对h3n2流感病毒的免疫应答的方法中。

235、在一方面，本发明组合物用于在对象中诱导针对siav h3n2亚型的免疫应答的方法中。

236、根据另一个优选方面，本文提及的免疫应答是粘膜免疫应答。

237、优选地，任何上述医学用途和方法包括向所述对象施用一剂或多剂本发明组合物。

238、优选地，任何上述医学用途和方法包括向所述对象施用两剂本发明组合物。

239、优选地，本发明组合物的一剂的体积约为0.01 ml至1 ml。

240、优选地，本发明组合物的一剂的体积约为0.05 ml至0.5 ml。

241、优选地，本发明组合物的一剂的体积约为0.1 ml至0.25 ml。

242、本文所述本发明上下文中的对象优选为哺乳动物。

243、优选地，所述对象是动物。

244、优选地，所述对象是猪，特别是仔猪。

245、本发明还提供一种生产本发明组合物的方法，包括在容器中混合以下物质的步骤：

246、- 油相，

247、- 第一表面活性剂，

248、- 第二表面活性剂，和

249、- 含有rna的水相。

250、本发明还提供一种生产本发明组合物的方法，包括以下步骤：

251、(a) 混合油相、第一表面活性剂和第二表面活性剂，以及

252、(b) 向步骤(a)中获得的混合物中加入含有rna的水相。

253、优选地，在所述生产本发明组合物的方法中：

254、- 所述油相是本发明油相，

255、- 所述第一表面活性剂是本发明第一表面活性剂，

256、- 所述第二表面活性剂是本发明第二表面活性剂，且

257、- 所述水相是本发明水相。

258、更具体地，参考下文进一步公开的条款，在所述生产本发明组合物的方法中：

259、- 所述油相是如条款8、9、17、18、35至49、85、86和91中任一项所指定的油相，

260、- 所述第一表面活性剂是如条款10至12、17至25、37、38、53至57、87、88和91中任一项所指定的第一表面活性剂，

261、- 所述第二表面活性剂是如条款13至18、26至30、37、38、58至61、89至91中任一项所指定的第二表面活性剂，和/或

262、- 所述水相是如条款6、7、17、18、31至33、37、38、51、52、82至84和91中任一项所指定的水相，

263、并且其中优选所述rna是如条款92至155中任一项所指定的rna。

264、此外，在本发明上下文中，提供了一种血凝素3(h3)，其中所述h3包含或由与seqid no:6的序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列组成，并且所述h3在下文中也称为“本发明相关h3”。

265、在一方面，本发明相关h3是包含与seq id no:6的序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列的h3。

266、在另一方面，本发明相关h3是由与seq id no:6的序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列组成的h3。

267、在一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第295位具有酪氨酸残基。

268、在另一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第176位具有丙氨酸残基。

269、在又一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第188位具有天冬酰胺残基。

270、更优选地，本发明相关h3具有：

271、- 在氨基酸第176位的丙氨酸残基，

272、- 在氨基酸第188位的天冬酰胺残基，和

273、- 在氨基酸第295位的酪氨酸残基。

274、如本文所述，氨基酸位置的编号参照全长野生型h3蛋白(seq id no:6)的氨基酸序列。因此，本文提及的氨基酸位置编号参照具有566个氨基酸残基的野生型h3序列，包括在(n端)氨基酸第1位的甲硫氨酸残基。

275、因此，本文所用短语“其中氨基酸位置的编号参照野生型h3的氨基酸序列”涉及天然存在的h3的序列，如seq id no:6中示例性所示。

276、根据一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第180位具有谷氨酰胺残基。

277、根据另一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第21位具有精氨酸残基。

278、根据又一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第291位具有天冬氨酸残基。

279、根据再一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第69位具有赖氨酸残基。

280、根据再又一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第214位具有缬氨酸残基。

281、在一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第176位具有丙氨酸残基。

282、在另一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第188位具有天冬酰胺残基。

283、在又一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第140位具有天冬氨酸残基。

284、在再一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第208位具有苏氨酸残基。

285、在再又一个优选方面，本发明相关h3在氨基酸第10位具有缬氨酸残基。

286、优选地，本发明相关h3在氨基酸第19位具有苯丙氨酸残基。

287、在另一方面，本发明相关h3在氨基酸第323位具有组氨酸残基。

288、在又一方面，本发明相关h3在氨基酸第546位具有异亮氨酸残基。

289、在再一方面，本发明相关h3在氨基酸第552位具有异亮氨酸残基。

290、优选地，本发明相关h3是猪甲型流感病毒(siav)的h3。

291、优选地，本发明相关h3是猪甲型流感病毒(siav)h3n2亚型的h3。

292、根据一个优选方面，本发明相关h3包含或由与seq id no:6的序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列组成。

293、根据另一个优选方面，本发明相关h3包含或由与seq id no:6的序列具有99%序列相同性的氨基酸序列组成。

294、根据又一个优选方面，本发明相关h3包含或由与seq id no:6的序列具有至少99.3%、优选至少99.5%、更优选至少99.7%或特别是100%序列相同性的氨基酸序列组成。

295、此外，提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明相关h3。

296、此外，提供了一种多核苷酸，其包含编码本发明相关h3的序列，并且还提供：

297、- 包含所述多核苷酸的载体，或

298、- 包含所述多核苷酸的质粒。

299、还提供了一种mrna，其包含编码本发明相关h3的序列。

300、此外，在本发明相关h3的上下文中，优选：

301、- 所述h3，

302、- 所述免疫原性组合物，

303、- 所述多核苷酸，

304、- 所述mrna，

305、- 所述载体，和/或

306、- 所述质粒

307、用于制备药物，特别是疫苗。

308、此外，在本发明相关h3的上下文中，提供了一种在对象中诱导针对病毒的免疫应答的方法，其中所述方法包括向对象施用：

309、- 所述h3，

310、- 所述免疫原性组合物，

311、- 所述多核苷酸，

312、- 所述mrna，

313、- 所述载体，和/或

314、- 所述质粒，

315、并且其中所述针对病毒的免疫应答优选是针对以下的免疫应答：

316、- 流感病毒，

317、- 猪流感病毒，

318、- 猪甲型流感病毒(siav)，

319、- 包含h3的流感病毒，

320、- h3n2流感病毒，和/或

321、- siav h3n2亚型。

322、还提供了一种分离的流感病毒，其包含本发明相关h3和/或其基因组编码本发明相关h3，并且其中所述流感病毒优选为：

323、- 猪甲型流感病毒(siav)，和/或

324、- siav h3n2亚型。

325、在此上下文中，“分离的”意指“通过人工”从其自然状态改变，即如果其存在于自然界中，则已被改变或从其原始环境中移出，或两者兼有。例如，天然存在于活生物体中的病毒不是“分离的”，但同一病毒与其自然状态的共存物质分离则是“分离的”，如本文所用该术语。

326、实施例

327、以下实施例仅旨在说明本公开。它们不以任何方式限制权利要求的范围。

328、实施例1

329、以1 µg/ml终浓度生产含有编码mcherry衍生物的mrna的测试乳剂。

330、按照以下方案生产该测试组合物：

331、(a) 在层流下，于100 ml烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下，加入21.81 g表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)，然后加入17.88 g聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france))，然后加入7.97g矿物油(marcol® 52(exxon, usa))；

332、(b) 分别制备含有mrna的水相：该水相通过将30 µl浓度为155.4 µg/ml的mrna(seq id no:3(即包含5´-utr、编码seq id no:1的mcherry衍生物的编码区、kozak序列(位于所述编码区起始密码子周围)、3´-utr和聚(a)尾，无5´-帽))加入870 µl无rna酶水中制备，得到含有浓度为5.18 µg/ml的mrna的水相；

333、(c) 在5 ml玻璃小瓶中，向上文步骤(a)获得的3.347 ml混合物中加入0.8 ml上文步骤(b)获得的(含5.18 µg/ml mrna的)水相。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

334、该乳剂进一步如实施例4所述进行测试。

335、实施例2

336、配制包含编码报告蛋白(人分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap))的mrna的乳剂，将该制剂局部施用于仔猪，以及随后报告蛋白在仔猪中的表达。

337、按照以下方案生产待测试的组合物：

338、在层流下，于10 ml玻璃小瓶中，在磁力搅拌器搅拌下，加入1.372 ml表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)(其由少量单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯以及主要为辛酸(c8)和癸酸(c10)的peg-8(mw 400)单酯和二酯组成)，然后加入1.126 ml聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest,france))，然后加入0.502 ml矿物油(marcol® 52(exxon, usa))，然后加入0.717 ml含有浓度为1 mg/ml的编码seap(seq id no:4)的mrna的水相(1 mm柠檬酸盐缓冲液ph 6.4)，所述mrna具有与实施例1的mrna相当的结构，但具有编码seap(而非mcherry衍生物)的编码区(seq id no:5)，并具有cap1结构m7gpppam的5´-帽(可使用cleancap® ag试剂(trilinkbiotechnologies, san diego (ca), usa，产品号n-7113)按照制造商说明生产)。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

339、随后进行了一项研究，以测试将待测试组合物局部施用于动物是否能有效递送其中所含的rna通过皮肤进入动物体内。特别地，该动物研究的目的是评估(i)这种局部施用于仔猪的安全性，以及(ii)这种局部施用所产生的目标蛋白质的生产效率。

340、在该研究中，在研究第0天(d0)约为10周龄的无特定病原体(spf)仔猪在d0接受0.25 ml参比产品(对应于待测试组合物但不含rna，并按相同方式生产)(第1组(g1))，或0.10 ml(第2组(g2))或0.25 ml(第3组(g3))待测试组合物(下文中也称为“产品”)，施用于右耳耳瓣内表面(即内耳廓)。为此，参比产品和待测试组合物分别通过无针头的1 ml注射器施用，并通过圆周按摩均匀涂抹在耳朵的相应皮肤表面上。每个测试组(g1、g2和g3)包括五头仔猪。

341、在d1和d2(即耳部施用后一天和两天)收集血液，在d2收集耳组织，并通过如下所述的seap酶活性定量评估所收集的样品。研究实验设计概览见表1。

342、表1实验设计

343、

344、分别监测血清中以及从耳组织提取后的seap酶活性，该活性由局部施用递送的mrna在仔猪细胞中的细胞摄取和翻译产生。

345、简言之，将全血收集在肝素钠采血管中，并在20℃下以1,100 g离心10分钟。收集血清并立即按下文所述测试/定量seap酶活性。

346、将来自产品施用区域的耳组织称重块悬浮于pbs(不含ca2+和mg2+的pbs)中，并使用gentlemacs™ m管结合gentlemacs™解离器(miltenyi biotec)使用预加载程序m_heart_01进行解离。将匀浆样品在20℃下以1,100 g离心10分钟。收集上清液并立即按下文所述测试/定量seap酶活性。根据重量对每个耳样品测得的酶活性进行标准化。

347、seap酶活性通过使用商业试剂盒(novabright™ phospha-light™ exp assaykit for seap (secreted placental alkaline phosphatase) reporter genedetection, invitrogen)按照制造商说明进行定量。该试剂盒/测定采用终点法，使用氯代5-取代的金刚烷基-1,2-二氧杂环丁烷磷酸酯(cspd)作为底物。化学发光底物cspd被分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)去磷酸化，产生不稳定的二氧杂环丁烷阴离子，其分解并发射光。光发射在477 nm波长处具有最大活性。

348、为测量光发射(来自96孔微板(96 well white plate, thermo scientific))，使用设置为发光测量的envision读板器(perkin-elmer)。

349、该研究的结果见图1(“每克耳的seap浓度”，显示研究第2天上清液中(每1克处理耳组织)的seap活性，通过化学发光测量)和图2(“血清中的seap浓度”，显示研究第1天和研究第2天的seap活性，通过化学发光测量)。

350、结论：施用后两天，配制在本文所述微乳剂中的编码seap的mrna被猪细胞有效摄取并翻译成活性seap。分泌的酶不仅在局部组织中检测到，而且在施用后两天在体循环中也检测到。考虑到10周龄仔猪的大小和重量(约20 kg)，这表明目标蛋白质的生产速率惊人地高。

351、此外，在将产品施用于仔猪后未观察到明显的不良事件(即发热、发红、肿胀)。

352、实施例3

353、配制包含编码抗原(猪甲型流感病毒(siav)h3n2的血凝素3(h3))的mrna的乳剂，将该制剂局部施用于仔猪，以及随后在仔猪中诱导免疫。

354、按照以下方案生产待测试的组合物：

355、在层流下，于5 ml玻璃小瓶中，在磁力搅拌器搅拌下，加入686 µl表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)，然后加入563 µl聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france))，然后加入251 µl矿物油(marcol® 52(exxon, usa))，然后加入359 µl含有浓度为1 mg/ml的编码siav的h3(seq id no:6)的mrna的水相(1 mm柠檬酸盐缓冲液ph 6.4)，所述mrna具有与实施例1的mrna相当的结构，但具有编码siav的h3(而非mcherry衍生物)的编码区(seq id no:7)，并具有cap1结构m7gpppam的5´-帽(可使用cleancap® ag试剂(trilink biotechnologies,san diego (ca), usa，产品号n-7113)按照制造商说明生产)。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

356、进行了一项动物研究，以测试将待测试组合物局部施用于动物是否能在动物中诱导针对该组合物中所含rna编码的抗原的免疫应答。

357、在该研究中，在研究第0天(d0)约为7周龄的常规猪在d0和研究第21天(d21)接受0.25 ml参比产品(对应于待测试组合物但不含rna，并按相同方式生产)(第1组(g1))或0.2ml待测试组合物(第2组(g2))，施用于双耳耳瓣内表面(每耳100 µl)。为此，参比产品和待测试组合物分别通过无针头的1 ml注射器施用，并通过圆周按摩均匀涂抹在耳朵的相应皮肤表面上。每个测试组(g1和g2)包括五头仔猪。

358、在第二次施用后二十一天(研究第42天(d42))收集血液。

359、此外，收集支气管肺泡灌洗液(balf)以监测可能诱导的粘膜免疫。研究实验设计概览见表2。

360、血清中的特异性igg(血液以1,000g离心10分钟后)和balf中的特异性iga(以1,000g离心10分钟后)通过elisa定量，使用重组h3胞外域作为靶抗原，并使用抗猪igg或抗猪iga二抗进行显色，如下所述：

361、简言之，将120 µl浓度为167 µg/ml的h3胞外域(对应于seq id no:6的氨基酸残基1-529)重组蛋白在碳酸盐缓冲液中的溶液于4℃包被过夜并洗涤。在5% pbs中饱和1小时后，将血清在tris elisa缓冲液(teb)+1%牛奶中进行1/4稀释及随后的1/5稀释，于37℃施加1.5小时。用tris缓冲液+0.1% tween 20洗涤5次后，施加100 µl hrp标记的二抗(conjugate goat anti swine igg-hrp - biorad aai41p 或 goat anti-swine iga-hrp- fortis life science a100-102p)，按制造商说明稀释，于37℃施加1.5小时，然后使用tmb(symbiotics, france)底物于20℃显色30分钟。通过加入浓硫酸终止反应，并在bio-teck instruments power wave 340读板器上于630/450 nm读取。滴度表示为达到od平台期前最小稀释度获得的od最大值。每个组在同一稀释比下进行比较。

362、表2实验设计

363、

364、如图3所示，如所述局部施用待测试组合物导致d42测试动物血清中特异性抗siavh3 igg抗体水平升高。

365、如图4所示，如所述局部施用待测试组合物导致d42测试动物balf中特异性抗siavh3 iga抗体水平升高。

366、作为该研究的结果，发现局部mrna-h3施用诱导了仔猪中特异性体液应答的产生。

367、实施例4

368、测定含有不同性质不同量mrna的各种微乳剂中分散在油相中的水相的平均液滴尺寸。

369、使用动态光散射(dls)技术，在nano zs zetasizer(zen3600, malverninstruments ltd., enigma business park, grovewood road, uk)上于20℃测定平均液滴尺寸和多分散指数。使用zetasizer软件(malvern instruments ltd.)计算平均液滴尺寸。

370、如下所述(a)-(d))的乳剂，用marcol® 52进行5倍体积稀释。对每个样品进行三次测量(研究(a)-(c))或四次测量(研究(d))，结果分别表示为三次或四次测量的平均值。

371、分散剂的ri指数为1.460，材料ri为1.33。粘度为16.0000 cp。采集时间固定为60秒。

372、(a)水相中无mrna的结果

373、按照以下方案生产该水相中无mrna的测试乳剂：

374、(a) 在层流下，于100 ml烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下，加入21.81 g表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)，然后加入17.88 g聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france))，然后加入7.97g矿物油(marcol® 52(exxon, usa))；

375、(b) 在10 ml玻璃小瓶中，向上文步骤(a)获得的3 ml混合物中加入0.717 ml不含ca2+和mg2+的磷酸盐缓冲盐水。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

376、在该乳剂中，通过dls测得分散在油相中的水相的平均液滴尺寸为57.33 nm，标准偏差(st dev)为14.56 nm(图5a)。多分散指数(pdi)值为0.173。

377、(b)含有编码mcherry衍生物的mrna终浓度为1 µg/ml或30 µg/ml的乳剂的结果

378、1 µg mrna/ml目标乳剂按实施例1所述生产。

379、30 µg mrna/ml目标乳剂按照以下方案生产：

380、(a) 在层流下，于100 ml烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下，加入21.81 g表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)，然后加入17.88 g聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france))，然后加入7.97g矿物油(marcol® 52(exxon, usa))；

381、(b) 分别制备含有mrna的水相：该水相通过将17 µl浓度为2 mg/ml的mrna(seqid no:3(即包含5´-utr、编码seq id no:1的mcherry衍生物的编码区、kozak序列(位于所述编码区起始密码子周围)、3´-utr和聚(a)尾，无5´-帽))加入202 µl无rna酶水中制备，得到含有浓度为155.4 µg/ml的mrna的水相；

382、(c) 在5 ml玻璃小瓶中，向上文步骤(a)获得的0.791 ml混合物中加入0.189 ml上文步骤(b)获得的(含155.4 µg/ml mrna的)水相。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

383、在mrna终浓度为1 µg/ml的乳剂中，通过dls测得分散在油相中的水相的平均液滴尺寸为35.44 nm，st dev为8.506 nm(图5b)。pdi值为0.068。

384、在mrna终浓度为30 µg/ml的乳剂中，通过dls测得分散在油相中的水相的平均液滴尺寸为32.45 nm，st dev为10.23 nm(图5c)。pdi值为0.130。

385、(c)含有编码seap的mrna终浓度为200 µg/ml的乳剂的结果

386、按照以下方案生产待测试的组合物：

387、(a) 在层流下，于100 ml烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下，加入21.81 g表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)，然后加入17.88 g聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france))，然后加入7.97g矿物油(marcol® 52(exxon, usa))；

388、(b) 在10 ml玻璃小瓶中，向上文步骤(a)获得的3 ml混合物中加入0.717 ml实施例2所述的水相(1 mm柠檬酸盐缓冲液ph 6.4，含有浓度为1 mg/ml的编码seap(seq id no:4)的mrna)。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

389、在该乳剂中，通过dls测得分散在油相中的水相的平均液滴尺寸为35.74 nm，stdev为19.44 nm(图5d)。pdi值为0.220。

390、(d)含有编码siav h3的mrna终浓度为200 µg/ml的乳剂的结果

391、按照以下方案生产待测试的组合物：

392、(a) 在层流下，于100 ml烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下，加入21.81 g表面活性剂labrasol®(gattefosse sa, saint-priest, france)，然后加入17.88 g聚甘油3二油酸酯(plurol® oleique cc 497(gattefosse sa, saint-priest, france))，然后加入7.97g矿物油(marcol® 52(exxon, usa))；

393、(b) 在10 ml玻璃小瓶中，向上文步骤(a)获得的3 ml混合物中加入0.717 ml实施例3所述的水相(1 mm柠檬酸盐缓冲液ph 6.4，含有浓度为1 mg/ml的编码siav的h3(seq idno:6)的mrna)。在室温下继续磁力搅拌5分钟。所得乳剂呈乳光色。

394、在该乳剂中，通过dls测得分散在油相中的水相的平均液滴尺寸为44.28 nm，stdev为11.40 nm(图5e)。pdi值为0.106。

395、附图列表

396、图1：“每克耳的seap浓度”，显示研究第2天上清液中(每1克处理耳组织)的seap活性，通过化学发光测量。

397、图2：“血清中的seap浓度”，显示研究第1天和研究第2天的seap活性，通过化学发光测量。

398、图3：d42(第二次施用后21天)的抗siav h3 igg elisa应答。

399、图4：d42(第二次施用后21天)的支气管肺泡灌洗液(balf)中的抗siav h3 igaelisa应答。

400、图5：(a)-(e)动态光散射(dls)光谱，显示分散在油相中的水相在以下乳剂中的液滴尺寸分布：

401、- 水相中无mrna的乳剂(图5a)，

402、- 终浓度为1 µg/ml的含有编码mcherry衍生物的mrna的乳剂(图5b)，

403、- 终浓度为30 µg/ml的含有编码mcherry衍生物的mrna的乳剂(图5c)，

404、- 终浓度为200 µg/ml的含有编码seap的mrna的乳剂(图5d)，

405、- 终浓度为200 µg/ml的含有编码siav h3的mrna的乳剂(图5e)。

406、序列表/来源和地理来源(如适用)：

407、seq id no:1对应于mcherry衍生物的氨基酸序列，

408、seq id no:2(rna)对应于编码seq id no:1的mcherry衍生物的mrna编码区，

409、seq id no:3(rna)对应于示例性mrna序列，包含5´-utr、seq id no:2的mrna编码区、kozak序列(位于所述编码区起始密码子周围)、3´-utr和聚(a)尾，

410、seq id no:4对应于分泌型胚胎人碱性磷酸酶(seap)的氨基酸序列，

411、seq id no:5(rna)对应于编码seq id no:4的seap的mrna编码区，

412、seq id no:6对应于猪甲型流感病毒(siav)h3n2分离株a/swine/germany/ar452/2014(2014年分离自德国猪)的血凝素3(h3)的氨基酸序列，

413、seq id no:7(rna)对应于编码seq id no:6的h3的mrna编码区。

414、在所附st.26标准序列表中的rna序列中，尿嘧啶核苷酸以符号“t”表示。

415、以下条款也在此公开。因此，本公开还包括以下条款所体现的方面：

416、1.一种组合物，包含

417、·含有核糖核酸(rna)的水相，和

418、·油相。

419、2.条款1的组合物，其中所述组合物包含

420、·一种或多种表面活性剂。

421、3.条款1或2的组合物，其中所述组合物包含

422、·含有rna的水相，

423、·油相，

424、·第一表面活性剂，和

425、·第二表面活性剂。

426、4.条款1至3中任一项的组合物，其中所述组合物由以下组成：

427、·含有rna的水相，

428、·油相，

429、·第一表面活性剂，和

430、·第二表面活性剂。

431、5.条款1至4中任一项的组合物，其中所述组合物是混合物。

432、6.条款1至5中任一项的组合物，其中所述水相包含选自水以及水与任何其他水混溶性溶剂的混合物的溶剂。

433、7.条款1至6中任一项的组合物，

434、其中所述水相包含水，

435、或其中所述水相不含固体纳米颗粒，或分别地，特别是不含脂质纳米颗粒(lnp)和/或脂质样纳米颗粒(lln)。

436、8.条款1至7中任一项的组合物，其中所述油相选自矿物油和植物油。

437、9.条款1至8中任一项的组合物，其中所述油相是矿物油。

438、10.条款3至9中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂是非离子型表面活性剂。

439、11.条款3至10中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂是水溶性表面活性剂。

440、12.条款3至11中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂的亲水亲油平衡(hlb)值大于10。

441、13.条款3至12中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是辅表面活性剂。

442、14.条款3至13中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是非离子型表面活性剂。

443、15.条款3至14中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是水不溶性表面活性剂。

444、16.条款3至15中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂的hlb值小于10。

445、17.条款3至16中任一项的组合物，其中所述组合物包含：

446、·含有rna的水相，其中所述水相包含水；

447、·油相，其中所述油相是矿物油；

448、·hlb值大于10的第一表面活性剂；和

449、·hlb值小于10的第二表面活性剂。

450、18.条款3至17中任一项的组合物，其中所述组合物由以下组成：

451、·含有rna的水相，其中所述水相包含水；

452、·油相，其中所述油相是矿物油；

453、·hlb值大于10的第一表面活性剂；和

454、·hlb值小于10的第二表面活性剂。

455、19.条款3至18中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂选自聚乙二醇衍生物、聚乙二醇、基于甘油的表面活性剂、聚乙二醇(peg)酯。

456、20.条款3至19中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂的hlb值为11至16。

457、21.条款3至20中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂包含peg-8辛酸/癸酸甘油酯或peg-6辛酸/癸酸甘油酯。

458、22.条款3至21中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂的hlb值为11至13。

459、23.条款3至22中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂包含peg-8辛酸/癸酸甘油酯。

460、24.条款3至23中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂包含单甘油酯、二甘油酯和/或三甘油酯。

461、25.条款3至24中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂主要由peg-8辛酸/癸酸甘油酯组成。

462、26.条款3至25中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是聚甘油脂肪酸酯。

463、27.条款3至26中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂的hlb值为约3至约8。

464、28.条款3至27中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂选自聚甘油-3二油酸酯和聚甘油-6二油酸酯。

465、29.条款3至28中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂的hlb值为约3至约6。

466、30.条款3至29中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是聚甘油3二油酸酯。

467、31.条款1至30中任一项的组合物，其中所述含有rna的水相选自：

468、- 含有rna的水性缓冲溶液，

469、- 含有rna的水，和

470、- 以下物质的混合物：

471、• 水

472、或

473、• 水性缓冲溶液

474、与任何其他水混溶性溶剂，其中所述混合物含有rna。

475、32.条款1至31中任一项的组合物，其中所述水相包含水性缓冲溶液。

476、33.条款1至32中任一项的组合物，其中所述含有rna的水相是含有rna的水性缓冲溶液。

477、34.条款6至33中任一项的组合物，其中所述任何其他水混溶性溶剂是选自乙醇、乙二醇和甘油的一种或多种溶剂。

478、35.条款1至34中任一项的组合物，其中所述油相是矿物油，选自液体石蜡，以及由源自石油的饱和烃(如十六烷或油酸甲酯或油酸乙酯)组成的油性液体。

479、36.条款1至35中任一项的组合物，其中所述油相是液体石蜡。

480、37.条款1至36中任一项的组合物，其中所述组合物包含：

481、·含有rna的水相，其中所述含有rna的水相是含有rna的水性缓冲溶液；

482、·油相，其中所述油相是液体石蜡；

483、·第一表面活性剂，其中所述第一表面活性剂包含或主要由peg-8辛酸/癸酸甘油酯组成；和

484、·第二表面活性剂，其中所述第二表面活性剂是聚甘油-3二油酸酯。

485、38.条款1至37中任一项的组合物，其中所述组合物由以下组成：

486、·含有rna的水相，其中所述含有rna的水相是含有rna的水性缓冲溶液；

487、·油相，其中所述油相是液体石蜡；

488、·第一表面活性剂，其中所述第一表面活性剂包含或主要由peg-8辛酸/癸酸甘油酯组成；和

489、·第二表面活性剂，其中所述第二表面活性剂是聚甘油-3二油酸酯。

490、39.条款1至38中任一项的组合物，其中所述油相是液体饱和烃的纯化混合物。

491、40.条款1至39中任一项的组合物，其中所述油相通过催化加氢纯化从石油获得。

492、41.条款1至40中任一项的组合物，其中所述油相包含约67%至约68%的链烷烃碳。

493、42.条款1至41中任一项的组合物，其中所述油相包含约32%至约33%的环烷烃碳。

494、43.条款1至42中任一项的组合物，其中所述油相在20℃下的动态粘度不超过约100 mpa·s，优选不超过约50 mpa·s，更优选不超过约30 mpa·s，最优选不超过约20mpa·s。

495、44.条款1至43中任一项的组合物，其中所述油相在20℃下的动态粘度为约10mpa·s至约100 mpa·s。

496、45.条款1至44中任一项的组合物，其中所述油相在20℃下的动态粘度为约10mpa·s至约50 mpa·s。

497、46.条款1至45中任一项的组合物，其中所述油相在20℃下的动态粘度为约10mpa·s至约30 mpa·s。

498、47.条款1至46中任一项的组合物，其中所述油相在20℃下的动态粘度为约10mpa·s至约20 mpa·s。

499、48.条款1至47中任一项的组合物，其中所述油相是marcol 52中所含组分的混合物。

500、49.条款1至48中任一项的组合物，其中所述油相是marcol 52。

501、50.条款31至49中任一项的组合物，其中所述水性缓冲溶液选自柠檬酸盐缓冲液、pbs缓冲液和tris缓冲液。

502、51.条款1至50中任一项的组合物，其中所述含有rna的水相是含有rna的柠檬酸盐缓冲液。

503、52.条款50或51的组合物，其中所述含有rna的水相是含有rna的柠檬酸盐缓冲液，并且其中所述柠檬酸盐缓冲液的ph值为6.4 ± 0.2。

504、53.条款3至52中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂包含或由以下组成：

505、·平均相对分子量在200至400之间的聚乙二醇的单酯和二酯，和

506、·甘油单酯、二酯和三酯。

507、54.条款3至53中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂包含或由以下组成：

508、·辛酸(c8)和癸酸(c10)的peg-8(mw 400)单酯和二酯，和

509、·单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。

510、55.条款3至54中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂由少量单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯以及主要为辛酸(c8)和癸酸(c10)的peg-8(mw 400)单酯和二酯组成。

511、56.条款3至55中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂是labrasol中所含组分的混合物。

512、57.条款3至56中任一项的组合物，其中所述第一表面活性剂是labrasol。

513、58.条款3至57中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂的hlb值为约3。

514、59.条款3至58中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂的hlb值为约6。

515、60.条款3至59中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是plurol oleiquecc 497中所含组分的混合物。

516、61.条款3至60中任一项的组合物，其中所述第二表面活性剂是plurol oleiquecc 497。

517、62.条款1至61中任一项的组合物，其中所述组合物是乳剂。

518、63.条款1至62中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相分散在油相中的乳剂。

519、64.条款1至63中任一项的组合物，其中所述组合物是油包水乳剂。

520、65.条款62至64中任一项的组合物，其中所述乳剂是选自微乳剂和纳米乳剂的乳剂。

521、66.条款1至65中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以直径在约1至约500 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

522、67.条款1至66中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以直径在约1至约350 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

523、68.条款1至66中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以直径在约5至约500 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

524、69.条款1至68中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以直径在约5至约350 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

525、70.条款1至69中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以直径在约5至约200 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

526、71.条款1至70中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以平均直径在5至95 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

527、72.条款1至71中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以平均直径在10至90 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

528、73.条款1至72中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以平均直径在15至85 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

529、74.条款1至73中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以平均直径在20至80 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

530、75.条款1至74中任一项的组合物，其中所述组合物是其中水相以平均直径在25至75 nm范围内的液滴形式分散在油相中的乳剂。

531、76.条款62至75中任一项的组合物，其中所述乳剂是微乳剂。

532、77.条款62至76中任一项的组合物，其中所述乳剂是热力学稳定的。

533、78.条款62至77中任一项的组合物，其中所述乳剂是各向同性的。

534、79.条款62至78中任一项的组合物，其中所述乳剂是透明的。

535、80.条款62至79中任一项的组合物，其中所述乳剂是乳光的。

536、81.条款1至80中任一项的组合物，其中所述乳剂是油包水微乳剂。

537、82.条款1至81中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述含有rna的水相的终浓度约为5%至30% v/v。

538、83.条款1至82中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述水相的终浓度约为14%至24% v/v。

539、84.条款1至83中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述水相的终浓度约为14.3%至24.3% v/v。

540、85.条款1至84中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述油相的终浓度约为5%至30% v/v。

541、86.条款1至85中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述油相的终浓度约为8.5%至18.5% v/v。

542、87.条款3至86中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述第一表面活性剂的终浓度约为30.7%至70.7% v/v。

543、88.条款3至87中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述第一表面活性剂的终浓度约为31.9%至41.9% v/v。

544、89.条款3至88中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述第二表面活性剂的终浓度约为17.5%至57.5% v/v。

545、90.条款3至89中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述第二表面活性剂的终浓度约为25.2%至35.2% v/v。

546、91.条款3至90中任一项的组合物，其中在所述组合物中：

547、·所述含有rna的水相的终浓度约为19% v/v，

548、·所述油相的终浓度约为14% v/v，

549、·所述第一表面活性剂的终浓度约为37% v/v，且

550、·所述第二表面活性剂的终浓度约为30% v/v。

551、92.条款1至91中任一项的组合物，其中所述rna在所述组合物中的终浓度约为0.1至500 µg/ml。

552、93.条款1至92中任一项的组合物，其中所述rna在所述组合物中的终浓度至少约为1 µg/ml。

553、94.条款1至93中任一项的组合物，其中所述rna在所述组合物中的终浓度至少约为30 µg/ml。

554、95.条款1至94中任一项的组合物，其中在所述组合物中所述rna的终浓度约为200µg/ml。

555、96.条款1至95中任一项的组合物，其中所述rna选自信使rna(mrna)、小干扰rna(sirna)和微小rna(mirna)。

556、97.条款1至96中任一项的组合物，其中所述rna是mrna。

557、98.条款1至97中任一项的组合物，其中所述rna是编码选自抗原、功能性蛋白和报告蛋白的肽或多肽的mrna。

558、99.条款1至98中任一项的组合物，其中所述rna是编码报告蛋白的mrna。

559、100.条款1至99中任一项的组合物，其中所述rna是编码荧光蛋白的mrna。

560、101.条款100的组合物，其中所述荧光蛋白选自mcherry、gfp(绿色荧光蛋白)以及mcherry或gfp的衍生物。

561、102.条款100或101的组合物，其中所述荧光蛋白是mcherry衍生物，其中所述mcherry衍生物包含或由与seq id no:1的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%序列相同性的氨基酸序列组成。

562、103.条款100至102中任一项的组合物，其中所述编码mcherry衍生物的mrna包含与seq id no:2的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列。

563、104.条款100至103中任一项的组合物，其中所述编码mcherry衍生物的mrna包含或由与seq id no:3的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列组成。

564、105.条款1至98中任一项的组合物，其中所述rna是编码抗原的mrna，或其中所述rna是编码功能性蛋白的mrna。

565、106.条款1至98和105中任一项的组合物，其中所述rna是编码功能性蛋白的mrna。

566、107.条款1至98、105和106中任一项的组合物，其中所述rna是编码酶的mrna。

567、108.条款1至98和105至107中任一项的组合物，其中所述rna是编码分泌型胚胎人碱性磷酸酶(seap)的mrna。

568、109.条款108的组合物，其中所述seap包含或由与seq id no:4的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%序列相同性的氨基酸序列组成。

569、110.条款108或109的组合物，其中所述编码seap的mrna包含与seq id no:5的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列。

570、111.条款1至98和105中任一项的组合物，其中所述rna是编码抗原的mrna。

571、112.条款1至98、105和111中任一项的组合物，其中所述rna是编码病原体抗原的mrna。

572、113.条款1至98、105、111和112中任一项的组合物，其中所述rna是编码选自病毒抗原、细菌抗原和源自寄生虫的抗原的mrna。

573、114.条款1至98、105和111至113中任一项的组合物，其中所述rna是编码病毒抗原的mrna。

574、115.条款113或114的组合物，其中所述病毒抗原是病毒糖蛋白，或其中所述病毒抗原是病毒衣壳蛋白。

575、116.条款113至115中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是病毒糖蛋白。

576、117.条款115或116的组合物，其中所述病毒是rna病毒。

577、118.条款113至117中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是rna病毒抗原。

578、119.条款113至118中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是rna病毒糖蛋白。

579、120.条款115至119中任一项的组合物，其中所述病毒是流感病毒。

580、121.条款113至120中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是流感病毒抗原。

581、122.条款113至121中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是流感病毒糖蛋白。

582、123.条款115至122中任一项的组合物，其中所述病毒是猪流感病毒。

583、124.条款113至123中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是猪流感病毒抗原。

584、125.条款113至124中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是猪流感病毒糖蛋白。

585、126.条款115至125中任一项的组合物，其中所述病毒是猪甲型流感病毒(siav)。

586、127.条款113至126中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是猪甲型流感病毒(siav)抗原。

587、128.条款113至127中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是猪甲型流感病毒(siav)糖蛋白。

588、129.条款115至128中任一项的组合物，其中所述病毒是猪甲型流感病毒(siav)h3n2亚型。

589、130.条款113至129中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是siav h3n2亚型抗原。

590、131.条款113至130中任一项的组合物，其中所述病毒抗原是siav h3n2亚型糖蛋白。

591、132.条款1至131中任一项的组合物，其中所述rna是编码血凝素或其免疫原性片段的mrna。

592、133.条款1至132中任一项的组合物，其中所述rna是编码血凝素的mrna。

593、134.条款132或133的组合物，其中所述血凝素是血凝素3(h3)。

594、135.条款132至134中任一项的组合物，其中所述血凝素包含或由与seq id no:6的序列具有至少95%、优选至少98%、更优选至少99%或特别是100%序列相同性的氨基酸序列组成。

595、136.条款1至98、105和111至135中任一项的组合物，其中所述rna是包含与seq idno:7的序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍更优选至少95%或特别是100%序列相同性的核苷酸序列的mrna。

596、137.条款96至136中任一项的组合物，其中所述mrna是合成mrna。

597、138.条款96至137中任一项的组合物，其中所述mrna是核苷修饰的mrna。

598、139.条款96至138中任一项的组合物，其中所述mrna的长度至少为300个核苷酸。

599、140.条款96至139中任一项的组合物，其中所述mrna的长度至少为500个核苷酸。

600、141.条款96至140中任一项的组合物，其中所述mrna的长度至少为1000个核苷酸。

601、142.条款96至141中任一项的组合物，其中所述mrna的长度至少为1500个核苷酸。

602、143.条款96至142中任一项的组合物，其中所述mrna的长度为300至5000个核苷酸。

603、144.条款96至143中任一项的组合物，其中所述mrna的长度为500至4000个核苷酸。

604、145.条款96至144中任一项的组合物，其中所述mrna的长度为1000至3000个核苷酸。

605、146.条款96至145中任一项的组合物，其中所述mrna包含5´-utr、编码多肽的编码区和3´-utr。

606、147.条款146的组合物，其中所述编码区侧翼为所述5´-utr和所述3´-utr。

607、148.条款96至147中任一项的组合物，其中所述mrna包含聚(a)尾，其中所述聚(a)尾优选位于所述3´-utr之后沿3´方向。

608、149.条款146至148中任一项的组合物，其中所述3´-utr侧翼为聚(a)尾。

609、150.条款148或149的组合物，其中所述聚(a)尾包含或由约120个a核苷酸组成。

610、151.条款96至150中任一项的组合物，其中所述mrna包含kozak序列。

611、152.条款96至151中任一项的组合物，其中所述mrna包含5'-帽结构。

612、153.条款96至152中任一项的组合物，其中所述mrna包含cap1结构。

613、154.条款96至153中任一项的组合物，其中所述mrna包含具有cap1结构m7gpppnm的5´-帽。

614、155.条款96至154中任一项的组合物，其中所述mrna包含具有cap1结构m7gpppam的5´-帽。

615、156.条款1至155中任一项的组合物，用作药物或用于在身体上实施的诊断方法。

616、157.条款1至98、105至107和111至155中任一项的组合物，用作药物。

617、158.条款1至98、105和111至155中任一项的组合物，用作疫苗。

618、159.条款1至110中任一项的组合物，用于在身体上实施的诊断方法。

619、160.条款1至155中任一项的组合物，用于将所述rna递送至对象的方法中，其中所述方法包括将所述组合物局部施用于所述对象。

620、161.条款1至155中任一项的组合物，用于将所述rna通过皮肤递送至对象的方法中，其中所述方法包括将所述组合物施用于所述对象的皮肤。

621、162.条款111至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导免疫应答的方法中。

622、163.条款111至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对病原体的免疫应答的方法中。

623、164.根据条款163的方法中使用的组合物，其中所述病原体选自病毒、细菌和寄生虫。

624、165.条款114至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对病毒的免疫应答的方法中。

625、166.条款120至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法中。

626、167.条款123至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对猪流感病毒的免疫应答的方法中。

627、168.条款126至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对猪甲型流感病毒(siav)的免疫应答的方法中。

628、169.条款129至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对包含h3的流感病毒的免疫应答的方法中。

629、170.条款129至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对h3n2流感病毒的免疫应答的方法中。

630、171.条款129至155中任一项的组合物，用于在对象中诱导针对siav h3n2亚型的免疫应答的方法中。

631、172.根据条款162至171中任一项的方法中使用的组合物，其中所述免疫应答是粘膜免疫应答。

632、173.将核糖核酸(rna)递送至对象的方法，包括将条款1至155中任一项的组合物局部施用于所述对象的步骤。

633、174.将核糖核酸(rna)通过皮肤递送至对象的方法，包括将条款1至155中任一项的组合物施用于所述对象的皮肤的步骤。

634、175.条款173或174的方法，其中条款1至155中任一项的组合物的水相含有待递送至对象的rna。

635、176.条款173至175中任一项的方法，其中所述方法如条款160至172中任一项所指定。

636、177.条款173至176中任一项的方法，其中所述组合物如条款160至171中任一项所指定。

637、178.条款1至155中任一项的组合物在制备药物或制备诊断剂中的用途。

638、179.条款1至98、105至107和111至155中任一项的组合物在制备药物中的用途。

639、180.条款1至98、105和111至155中任一项的组合物在制备疫苗中的用途。

640、181.条款1至110中任一项的组合物在制备诊断剂中的用途。

641、182.条款178至180中任一项的用途，其中所述药物或疫苗用于如条款160至177中任一项所指定的方法。

642、183.条款178至182中任一项的用途，其中所述组合物如条款160至171中任一项所指定。

643、184.根据条款156至172中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177中任一项的方法、或根据条款178至183中任一项的用途，其中所述方法包括将所述组合物局部施用于所述对象。

644、185.根据条款156至172和184中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184中任一项的方法、或根据条款178至184中任一项的用途，其中所述组合物局部施用于所述对象的耳部表面。

645、186.根据条款156至172和184至185中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184至185中任一项的方法、或根据条款178至185中任一项的用途，其中所述组合物局部施用于所述对象的内耳廓。

646、187.根据条款156至172和184至186中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184至186中任一项的方法、或根据条款178至186中任一项的用途，其中所述方法包括向所述对象施用一剂或多剂所述组合物。

647、188.根据条款156至172和184至187中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184至187中任一项的方法、或根据条款178至187中任一项的用途，其中所述方法包括向所述对象施用两剂所述组合物。

648、189.根据条款187或188的方法中使用的组合物、根据条款187或188的方法、或根据条款187或188的用途，其中所述组合物的一剂的体积约为0.01 ml至1 ml。

649、190.根据条款187至189中任一项的方法中使用的组合物、根据条款187至189中任一项的方法、或根据条款187至189中任一项的用途，其中所述组合物的一剂的体积约为0.05 ml至0.5 ml。

650、191.根据条款187至190中任一项的方法中使用的组合物、根据条款187至190中任一项的方法、或根据条款187至190中任一项的用途，其中所述组合物的一剂的体积约为0.1ml至0.25 ml。

651、192.根据条款160至172和184至191中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184至191中任一项的方法、或根据条款178至191中任一项的用途，其中所述对象是哺乳动物。

652、193.根据条款160至172和184至192中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184至192中任一项的方法、或根据条款178至192中任一项的用途，其中所述对象是动物。

653、194.根据条款160至172和184至193中任一项的方法中使用的组合物、根据条款173至177和184至193中任一项的方法、或根据条款178至193中任一项的用途，其中所述对象是猪。

654、195.生产条款1至155中任一项的组合物的方法，包括以下步骤：

655、(a) 混合油相、第一表面活性剂和第二表面活性剂，以及

656、(b) 向步骤(a)中获得的混合物中加入含有rna的水相。

657、196.条款195的方法，其中所述油相是如条款8、9、17、18、35至49、85、86和91中任一项所指定的油相。

658、197.条款195或196的方法，其中所述第一表面活性剂是如条款10至12、17至25、37、38、53至57、87、88和91中任一项所指定的第一表面活性剂。

659、198.条款195至197中任一项的方法，其中所述第二表面活性剂是如条款13至18、26至30、37、38、58至61、89至91中任一项所指定的第二表面活性剂。

660、199.条款195至198中任一项的方法，其中所述水相是如条款6、7、17、18、31至33、37、38、51、52、82至84和91中任一项所指定的水相。

661、200.条款195至199中任一项的方法，其中所述rna是如条款92至155中任一项所指定的rna。

662、201.一种血凝素3(h3)，其包含与seq id no:6的序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列。

663、202.一种血凝素3(h3)，其由与seq id no:6的序列具有至少90%序列相同性的氨基酸序列组成。

664、203.条款201或202的h3，其中所述h3在氨基酸第295位具有酪氨酸残基。

665、204.条款201至203中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第176位具有丙氨酸残基。

666、205.条款201至204中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第188位具有天冬酰胺残基。

667、206.条款201至205中任一项的h3，其中所述h3具有：

668、·在氨基酸第176位的丙氨酸残基，

669、·在氨基酸第188位的天冬酰胺残基，和

670、·在氨基酸第295位的酪氨酸残基。

671、207.条款201至206中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第18位具有天冬酰胺残基。

672、208.条款201至207中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第180位具有谷氨酰胺残基。

673、209.条款201至208中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第21位具有精氨酸残基。

674、210.条款201至209中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第291位具有天冬氨酸残基。

675、211.条款201至210中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第69位具有赖氨酸残基。

676、212.条款201至211中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第214位具有缬氨酸残基。

677、213.条款201至212中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第140位具有天冬氨酸残基。

678、214.条款201至213中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第208位具有苏氨酸残基。

679、215.条款201至214中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第10位具有缬氨酸残基。

680、216.条款201至215中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第19位具有苯丙氨酸残基。

681、217.条款201至216中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第323位具有组氨酸残基。

682、218.条款201至217中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第546位具有异亮氨酸残基。

683、219.条款201至218中任一项的h3，其中所述h3在氨基酸第552位具有异亮氨酸残基。

684、220.条款201至219中任一项的h3，其中所述氨基酸位置编号参照野生型h3的氨基酸序列。

685、221.条款201至220中任一项的h3，其中所述氨基酸位置编号参照seq id no:6的氨基酸序列。

686、222.条款201至221中任一项的h3，其中所述h3是猪甲型流感病毒(siav)的h3。

687、223.条款201至222中任一项的h3，其中所述h3是猪甲型流感病毒(siav)h3n2亚型的h3。

688、224.条款201至223中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少95%序列相同性。

689、225.条款201至224中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少99%序列相同性。

690、226.条款201至225中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少99.2%序列相同性。

691、227.条款201至226中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少99.3%、优选至少99.5%、更优选至少99.7%或特别是100%序列相同性。

692、228.条款201至227中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少99.4%序列相同性。

693、229.条款201至228中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少99.6%序列相同性。

694、230.条款201至229中任一项的h3，其中所述氨基酸序列与seq id no:6的序列具有至少99.8%序列相同性。

695、231.一种免疫原性组合物，其包含条款201至230中任一项的h3。

696、232.一种多核苷酸，其包含编码条款201至230中任一项的h3的序列。

697、233.一种mrna，其包含编码条款201至230中任一项的h3的序列。

698、234.一种载体，其包含条款232的多核苷酸。

699、235.一种质粒，其包含条款232的多核苷酸。

700、236.以下物质的用途：

701、·条款201至230中任一项的h3，

702、·条款231的免疫原性组合物，

703、·条款232的多核苷酸，

704、·条款233的mrna，

705、·条款234的载体，和/或

706、·条款235的质粒，

707、用于制备药物，优选疫苗。

708、237.在对象中诱导针对病毒的免疫应答的方法，包括向对象施用：

709、·条款201至230中任一项的h3，

710、·条款231的免疫原性组合物，

711、·条款232的多核苷酸，

712、·条款233的mrna，

713、·条款234的载体，和/或

714、·条款235的质粒。

715、238.条款237的方法，其中所述针对病毒的免疫应答是针对流感病毒的免疫应答。

716、239.条款237或238的方法，其中所述针对病毒的免疫应答是针对猪流感病毒的免疫应答。

717、240.条款237至239中任一项的方法，其中所述针对病毒的免疫应答是针对猪甲型流感病毒(siav)的免疫应答。

718、241.条款237至240中任一项的方法，其中所述针对病毒的免疫应答是针对包含h3的流感病毒的免疫应答。

719、242.条款237至241中任一项的方法，其中所述针对病毒的免疫应答是针对h3n2流感病毒的免疫应答。

720、243.条款237至242中任一项的方法，其中所述针对病毒的免疫应答是针对siavh3n2亚型的免疫应答。

721、244.一种分离的流感病毒，其基因组编码条款201至230中任一项的h3。

722、245.一种分离的流感病毒，特别是条款244的分离的流感病毒，其中所述分离的流感病毒包含条款201至230中任一项的h3。

723、246.条款244或245的分离的流感病毒，其中所述流感病毒是猪甲型流感病毒(siav)。

724、247.条款244至246中任一项的分离的流感病毒，其中所述流感病毒是siav h3n2亚型。