用于打印高密度组织纤维的系统和方法与流程

本发明涉及用于生产具有封装的细胞群的组织纤维的微流体打印头设计、生物打印系统和方法，所述组织纤维具有更一致的纤维结构以及增加的细胞密度和提高的活力，并且涉及由此产生的高密度组织纤维。

背景技术：

1、可植入的实体器官细胞疗法通常需要用移植细胞替换5%至20%的天然上皮(实质)细胞质量，以便建立治疗效果所需的足够功能阈值。为了进一步提高这些细胞的寿命和功能，许多治疗聚焦于通过使用细胞聚集来模拟器官密度。这增加了细胞与细胞的附着，对于维持上皮细胞类型来说是至关重要的，这进而产生了提高的生理相关功能。然而，同时，这种对细胞聚集和/或密度的增加的依赖会导致其他重大并发症。

2、仅举一例，目前正在开发的细胞疗法通常由封装在生物材料中的细胞聚集体组成。生物材料和细胞团在体积上往往相等，或者在细胞聚集体情况下更常见的是，生物材料占据的空间体积明显大于细胞的空间体积。这必然会对由此类纤维组成的装置造成大小限制，从而往往使得该装置由于潜在外科手术部位处的空间有限而难以植入。一个代表性的例证是肝脏替代疗法，其中典型的成人肝脏占据约1500 ml体积(zhu等人，1999)，并且当前的数据表明，为了建立治疗窗口，必须替换最少10%的肝脏质量。这相当于约150 ml的细胞体积(假设生理密度)。如果那些细胞以10%的低密度封装，则所得植入物的体积将为约1500ml，并且在不给患者造成重大影响的情况下不可能进行植入。

3、此外，肝脏组织植入物的当前迭代的制造时间较长，并且可能会超过患有急性肝衰竭的患者的有效治疗的生存窗口期。另外，现有技术工艺的复杂性以及制造失败的对应增加的可能性进一步加剧了患者可能无法及时接受治疗的风险。

4、因此，仍然需要在设计、材料和技术上的改进，以提供可在生物打印组织纤维中以较高密度有效封装，同时保持足够的细胞活力和功能性的组织疗法。

技术实现思路

1、本发明通过提供以下项成功解决了本领域的前述挑战：打印头设计，所述打印头设计允许生物打印具有精确且一致的直径和壳厚度的更细的芯/壳纤维；使用所述打印头设计来生产封装用于植入的感兴趣的细胞群的生物打印组织纤维的方法；以及由此产生的所得的高密度组织纤维。

2、在一个方面，提供了微流体打印头，所述微流体打印头包括：多个堆叠层，所述多个堆叠层形成多个流体通道，所述多个流体通道包括：芯通道，所述芯通道包括至少一个入口和出口；至少一个壳通道，所述至少一个壳通道包括至少一个入口和出口，其中所述至少一个壳通道在所述打印头的同一层中同心地围绕所述芯通道设置，其中所述芯通道和所述至少一个壳通道与接收锥的入口流体连通，所述接收锥朝向以分配孔口结尾的分配通道会聚，其中所述接收锥包括被配置为使流体朝向所述分配通道聚焦的截头圆锥体或漏斗形状；以及鞘流通道，所述鞘流通道在鞘液腔室处与所述接收锥会聚，其中所述鞘液腔室包括截头圆锥体形状，所述截头圆锥体形状被配置为使流体朝向与所述分配通道流体连通的鞘液腔室出口聚焦；其中所述接收锥以与所述分配通道对准的方式纵向地延伸穿过所述鞘液腔室的中心区域，并且所述鞘液腔室的侧表面逐渐变细到大于所述分配通道的直径的直径，从而限定所述鞘液腔室中的底表面。

3、在实施方案中，所述鞘液腔室的所述底表面的至少一部分朝向所述鞘液出口和所述分配通道向下并向内倾斜或弯曲。在实施方案中，所述底表面的至少一部分朝向所述分配通道是成角度的、倒角的、圆角的和/或斜切的。

4、在实施方案中，所述芯通道出口相对于所述壳通道出口是倒角的。

5、在实施方案中，所述鞘液腔室的所述侧表面逐渐变细到约1.20 mm与约1.50 mm之间，或约1.55 mm的直径，并且所述鞘液腔室出口处的所述分配通道的所述直径是在约0.50与约0.85之间。

6、在实施方案中，所述芯通道包括至少两个芯入口子通道，所述至少两个芯入口子通道具有不同的流体储存器、输入孔口和流体开关(例如，控制阀)，所述芯入口子通道会聚以形成与所述接收锥流体连通的单个芯通道出口，优选地其中所述至少两个芯入口子通道在所述芯通道出口处或附近会聚。在实施方案中，每个芯入口子通道被配置为分配不同的材料，优选地其中所述芯通道包括两个流体开关，并且每个芯入口子通道流体地连接到不同的流体开关。

7、在实施方案中，所述打印头还包括具有至少一个入口和出口的第二壳通道，其中所述第二壳通道出口在所述打印头的同一层中同心地围绕所述第一壳通道设置并且与所述接收锥流体连通。在实施方案中，所述至少一个壳通道包括至少两个壳入口子通道，所述至少两个壳入口子通道具有不同的流体储存器、输入孔口和流体开关(例如，控制阀)，所述壳入口子通道会聚以形成与所述接收锥流体连通的单个壳通道出口。在实施方案中，至少一个壳通道包括三个壳入口子通道，所述三个壳入口子通道中的一个连接到包括缓冲溶液的流体储存器。

8、在实施方案中，所述鞘流通道包括经由所述鞘流腔室朝向所述分配通道会聚的多个鞘流子通道。

9、在实施方案中，所述至少一个壳通道还包括至少一个流体分流孔口，所述至少一个流体分流孔口被配置为围绕所述至少一个壳通道出口的圆周分流流体。在实施方案中，所述至少一个流体分流孔口将所述至少一个壳通道入口与所述至少一个壳通道出口的上弯曲表面的顶点连接；优选地其中所述上弯曲表面具有抛物线或椭圆形形状。

10、在另一个方面，本发明提供了一种用于生产纤维结构的系统，所述系统包括根据任何前述设计的打印头，以及定位部件，所述定位部件用于在三维空间中定位所述打印头的所述分配孔口，其中所述定位部件可操作地耦接到所述打印头。在实施方案中，所述系统还包括可编程控制处理器，以用于控制所述定位部件并且用于控制一种或多种流体通过所述打印头的流速。

11、在实施方案中，所述系统还包括流体去除部件，所述流体去除部件被配置为去除从所述打印头分配的过量流体，其中所述流体去除部件包括被配置为允许所述过量流体通过的多孔膜，和/或其中所述流体去除部件包括被配置为抽吸所述过量流体的真空。在实施方案中，所述系统还包括压力控制部件，所述压力控制部件被配置为调节所述一种或多种流体通过所述打印头的所述流速。

12、在另一个方面，提供了一种用于生成包含高密度细胞群的生物打印组织纤维的方法，所述方法包括：提供用于生产包括芯和至少一个壳的纤维结构的系统，所述系统包括：根据任何前述设计的打印头，其中所述打印头被配置为通过所述芯通道分配芯材料，通过所述至少一个壳通道分配包含生物相容性不可降解的可交联水凝胶的至少一种壳材料，并且通过所述鞘流通道分配包含交联剂的鞘溶液，其中所述细胞群被封装在所述芯中和/或至少一个壳中，并且包含包埋在生物相容性基质中的至少5 x 107个细胞/毫升，优选地至少1 x 108个细胞/毫升；接收表面，所述接收表面用于接收从所述打印头分配的第一材料层；定位部件，所述定位部件用于在3d空间中定位所述打印头的所述分配孔口，其中所述定位部件可操作地耦接到所述打印头；可编程控制处理器，所述可编程控制处理器用于控制所述定位部件并且用于控制一种或多种流体通过所述打印头的流速；流体储存器，所述流体储存器包括所述芯材料、所述壳材料和鞘溶液，其中所述流体储存器与所述打印头流体连通；使所述壳材料与所述鞘溶液在所述鞘流腔室中接触以生成固化的纤维结构；以及从所述打印头的所述分配孔口分配所述固化的纤维结构。在实施方案中，所述打印头包括具有至少一个入口和出口的第二壳通道，其中所述第二壳通道出口在所述打印头的同一层中同心地围绕所述第一壳通道设置并且与所述接收锥流体连通，并且所述固化的纤维结构包括至少两个壳，最内层壳包括封装所述细胞群的环状层。

13、在实施方案中，所述细胞群包含至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的解离细胞。在实施方案中，所述生物相容性基质包含至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%或至少约85% v/v的在生理基质材料中的细胞。在实施方案中，所述生物相容性基质包含至少约2:1、优选地至少约3:1、更优选地至少约4:1的细胞:生理基质材料的比率。

14、在实施方案中，所述芯材料和所述壳材料包含相同的水凝胶材料；优选地其中所述水凝胶材料是藻酸盐；任选地其中所述芯材料和/或所述壳材料包含经化学修饰的藻酸盐。

15、在实施方案中，所述方法还包括用冷冻保护剂冷冻保存所述生物打印芯壳组织纤维，其中所述纤维在所述解离细胞聚集之前进行冷冻保存；优选地在生物打印约10分钟至一小时内，更优选地在生物打印约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟内进行冷冻保存。在实施方案中，所述冷冻保存步骤包括在冷冻之前将冷冻保护剂添加到所述打印纤维中并且进行孵育，持续至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟。

16、在实施方案中，所述芯材料还包含增粘剂，优选地其中所述芯材料和所述壳材料的粘度基本上相等。

17、在实施方案中，所述细胞群包括来自内分泌腺和外分泌腺的原代细胞，所述内分泌腺和所述外分泌腺选自由以下组成的组：胰腺、肝脏、肾脏、甲状旁腺、甲状腺、松果体腺、垂体腺、胸腺、肾上腺、卵巢、睾丸、扁桃体腺、肠内分泌细胞、干细胞、任何前述原代细胞类型的干细胞衍生细胞、或被工程化以分泌治疗剂的细胞。在实施方案中，细胞群包括hepg2、原代人肝细胞(phh)、间充质干细胞(msc)、胚胎干细胞或诱导多能干细胞衍生的肝细胞样细胞、肝脏干细胞衍生的肝细胞样细胞、异种肝细胞、基因工程化干细胞衍生的肝细胞、干细胞衍生内皮细胞或原代内皮细胞以及其组合。

18、在另一个方面，本发明提供了一种通过任何前述方法制成的生物打印组织纤维，所述生物打印组织纤维包含高密度细胞群，其中所述组织纤维包含至少1 x 107个细胞/毫升或至少1 x 108个细胞/毫升。

19、在实施方案中，所述细胞群被封装在所述芯中，并且所述芯直径一致地在约50 um与约250 um之间，或在约100 um与约200 um之间，优选地一致地在约130 um与约200 um之间，优选地一致地在约140 um与约190 um之间，更优选地一致地在约150 um至175 um之间，更优选地一致地约150 um、约155 um、约160 um、约165 um、约170 um或约175 um。在实施方案中，所述芯直径沿着所述生物打印纤维的长度变化不超过5%、10%或15%。

20、在实施方案中，所述壳厚度一致地在约20 um与约200 um之间，或在约30 um与80um之间，优选地一致地在约50 um与70 um之间，更优选地一致地约60 um、约65 um或约70um。在实施方案中，所述壳厚度沿着所述生物打印纤维的所述长度变化不超过5%、10%或15%。

21、在实施方案中，总纤维直径一致地在约200 um与500 um之间，或在约270 um与约330 um之间，优选地一致地在约280 um与约320 um之间，更优选地一致地约290 um至约310um，更优选地一致地约290 um、约300 um或约310 um。在实施方案中，所述总纤维直径沿着所述生物打印纤维的所述长度变化不超过5%、10%或15%。

22、在实施方案中，所述细胞群被封装在所述环状层中，并且所述芯直径一致地在约50 um与750 um之间，或在约300 um与约500 um之间，优选地一致地在约350 um与约450 um之间，更优选地一致地约350 um、约375 um、约400 um、约425 um或约450 um。在实施方案中，所述芯直径沿着所述生物打印纤维的所述长度变化不超过5%、10%或15%。

23、在实施方案中，所述环状层厚度一致地在约100 um与约300 um之间，优选地一致地在约50 um与约300 um之间，或在约130 um与约200 um之间，优选地一致地在约140 um与约190 um之间，更优选地一致地在约150 um至175 um之间，更优选地一致地约150 um、约155 um、约160 um、约165 um、约170 um或约175 um。在实施方案中，所述环状层厚度沿着所述生物打印纤维的所述长度变化不超过5%、10%或15%。

24、在实施方案中，所述冷冻保存的纤维还包括外壳，所述外壳具有在约30 um与约120 um之间，或在约30 um与80 um之间，更优选地一致地在约45 um与70 um之间，更优选地一致地约60 um、约65 um或约70 um的一致厚度。在实施方案中，所述外壳厚度沿着所述生物打印纤维的所述长度变化不超过5%、10%或15%。

25、在实施方案中，所述总纤维直径一致地在约300至1400 um之间，或在约500至1200um之间，优选地一致地在约700 um与约1000 um之间，更优选地一致地约800 um、约900 um或约1000 um。在实施方案中，所述总纤维直径沿着所述生物打印纤维的所述长度变化不超过5%、10%或15%。

26、以引用的方式并入

27、本说明书所提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文中，其程度就如同每个独立的公布、专利或专利申请被具体地且单独地指出以引用的方式并入那样。