一种金纳米探针及制备方法、活菌可视化检测方法与流程

本发明属于纳米生物传感微生物快检，具体涉及一种金纳米探针及制备方法、活菌可视化检测方法，适用于饮用水、生鲜食品匀浆、创面渗出液、医疗污水、消毒效果验证等场景中革兰氏阴性活菌快速可视化定性筛查。

背景技术：

1、食源性革兰氏阴性致病菌（大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌等）是食品安全、临床创面感染、水体微生物污染的主要风险源。传统微生物检测依赖平板菌落培养，检测周期长达18-48 h，无法满足现场即时筛查需求；pcr、酶联免疫检测依赖精密仪器、专业操作人员，成本高昂，不适合基层、野外批量检测。

2、现有裸眼可视化金纳米颗粒（aunps）比色检测技术是当前快检主流方案，其原理为单分散aunps溶液呈酒红色，颗粒发生聚集后表面等离子共振峰红移，溶液转变为蓝紫色，肉眼可直接判读。但现有公开技术存在一些缺陷：

3、第一，无法区分活菌与死菌。现有修饰配体包括抗体、普通适配体、甘露糖、单一阳离子抗菌肽，识别靶点为细菌细胞膜固定结构（脂多糖lps、膜蛋白、核酸），高温灭活、抗生素杀灭后的死菌、细菌裂解碎片依然能够结合探针，诱导aunps聚集变色，假阳性检出率高；消毒效果验证、水质活菌计数场景完全无法适用。

4、第二，复杂基质抗干扰能力差。血液、创面渗出液、高蛋白肉类匀浆、浑浊污水中游离蛋白、油脂、胶体杂质极易引发aunps非特异性静电团聚，无目标细菌时溶液自发变蓝紫色，严重干扰裸眼判读结果。

5、第三，传感机制单一，仅依靠单一亲和作用力触发聚集，缺少双重筛选门槛，特异性与灵敏度无法兼顾。若提高配体特异性，则检测灵敏度大幅下降；若提升灵敏度，则基质干扰显著加剧。

技术实现思路

1、针对现有金纳米细菌可视化检测技术无法区分活菌死菌、复杂基质假阳性高、特异性与灵敏度难以兼顾的行业瓶颈，本发明提供一种金纳米探针及制备方法、活菌可视化检测方法。

2、本发明第一方面提供一种金纳米探针，包括金纳米颗粒以及共修饰于所述金纳米颗粒表面的ph响应构象开关肽和lps特异性靶向短肽；

3、所述ph响应构象开关肽的氨基酸序列如氨基酸序列表中seq id no.1所示，c-gllhllhhllhh-nh2，n端带有游离半胱氨酸巯基，c端酰胺化封端；

4、所述lps特异性靶向短肽的氨基酸序列如氨基酸序列表中seq id no.2所示，c-kvrvrvk，n端带有游离半胱氨酸巯基。

5、本发明提供一种双巯基多肽共修饰的金纳米探针，通过构建双重分子锁传感机制，仅完整代谢活性活菌可触发aunps聚集变色，死菌、细菌碎片、基质杂质无响应，兼顾高特异性、强抗干扰、裸眼可视化多重技术效果。

6、ph响应构象开关肽，完整氨基酸序列：c-gllhllhhllhh-nh2；n端半胱氨酸提供游离巯基用于结合金纳米颗粒，c端酰胺化封端消除游离羧基负电荷；多肽链包含多组氨酸残基与疏水亮氨酸残基；中性ph环境下肽链舒展亲水，活菌膜周弱酸性微环境（ph 5.0-6.2）下组氨酸咪唑基质子化，肽链发生无规卷曲向α螺旋构象翻转，疏水残基外露，提供颗粒间疏水聚集驱动力，促使纳米颗粒聚集。

7、革兰氏阴性菌lps特异性靶向短肽，完整氨基酸序列：c-kvrvrvk；n端半胱氨酸游离巯基共价修饰金纳米颗粒；多肽富含赖氨酸、精氨酸阳离子残基，可特异性静电结合革兰氏阴性活菌外膜脂多糖lps负电磷酸基团，实现探针在活菌表面定点锚定；无lps结构的蛋白杂质无法结合lps特异性靶向短肽；死菌碎片虽含有少量lps，但该lps空间构象不完整，难以与lps特异性靶向短肽稳定结合，不会产生明显检测信号干扰。构建第一道抗假阳性屏障。lps为脂多糖。

8、游离组氨酸富集ph响应多肽、游离lps结合阳离子短肽仅被报道用于体外抑菌、脓毒症中和实验，本发明采用两种功能多肽按固定摩尔比例共修饰构建“靶向识别锁+活菌微环境ph响应锁”双分子开关结构应用于aunps体系中，用于金纳米颗粒活菌可视化传感。

9、优选的，所述ph响应构象开关肽和所述lps特异性靶向短肽的摩尔比为2:1~5:1。

10、优选的，所述ph响应构象开关肽和所述lps特异性靶向短肽的摩尔比为3:1。

11、高比例ph响应构象开关肽保证构象响应灵敏度，低比例lps特异性靶向肽实现精准锚定，协同形成“靶向锚定第一锁+ph构象翻转第二锁”双分子触发体系；仅双锁同时开启时，金纳米颗粒发生有序交联聚集。

12、优选的，所述金纳米颗粒为单分散柠檬酸钠还原金纳米颗粒。

13、本发明第二方面提供上述的金纳米探针的制备方法，包含如下步骤：

14、将混合多肽母液与金纳米颗粒溶胶混合，孵育，得到所述金纳米探针；所述混合多肽母液由所述ph响应构象开关肽和所述lps特异性靶向短肽混合得到。

15、优选的，所述混合多肽母液由所述ph响应构象开关肽和所述lps特异性靶向短肽溶于ph 7.2-7.5的hepes缓冲液得到。

16、hepes的化学名：4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

17、优选的，所述hepes缓冲液的ph为7.4。

18、ph响应构象开关肽在中性环境下肽链舒展亲水，在活菌细胞膜周ph 5.0-6.2弱酸性微环境下发生无规卷曲向α螺旋构象翻转，疏水亮氨酸残基外露，产生金纳米颗粒间疏水交联驱动力。

19、优选的，所述孵育的时间为12 h。

20、优选的，所述ph响应构象开关肽和所述lps特异性靶向短肽分别通过固相多肽合成法制备得到。

21、和/或，所述孵育步骤后，还包括以下步骤：对孵育的产物进行盐老化处理，纯化，得到所述金纳米探针。

22、和/或，所述金纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：取超纯水煮沸，加入质量分数1%柠檬酸钠水溶液混合均匀，一次性加入氯金酸水溶液，沸腾搅拌反应15 min，冷却，得到所述金纳米颗粒。

23、本发明第三方面提供一种活菌可视化检测方法，包含如下操作步骤：

24、s1、取待测样品上清液，加入上述的金纳米探针的储备液，混匀，得到混合液；

25、s2、将混合液常温避光静置孵育20 min-30 min；

26、s3、当孵育后的混合液保持酒红色，则为阴性；当孵育后的混合液变为蓝紫色或灰蓝色，则为阳性。

27、活菌可视化检测方法可区分活菌与高温灭活死菌，死菌无质子跨膜代谢活动，细胞膜周无局部弱酸化微环境，无法触发多肽构象翻转，不会诱导金纳米颗粒聚集变色。

28、裸眼判读结果：体系保持酒红色为阴性，代表样品无活菌、仅含死菌或杂质；体系变为蓝紫色/灰蓝色为阳性，代表样品存在具有完整代谢活性的革兰氏阴性活菌。

29、优选的，待测样品上清液与金纳米探针储备液的体积比为 1:(2-4)。

30、优选地，待测样品上清液与金纳米探针储备液的体积比为 1:2。

31、本发明第四方面提供如上述的金纳米探针在革兰氏阴性活菌裸眼可视化快速检测中的应用。

32、可应用在饮用水、生鲜食品、创面渗出液、医疗污水中革兰氏阴性活菌裸眼可视化快速检测中。

33、本发明有益效果：

34、1.本发明提供的金纳米探针具有创新的双分子锁协同传感机制，能够用于实现裸眼精准区分活菌与死菌。现有单配体修饰体系仅识别细菌固定结构，死菌碎片即可触发变色；本发明需要同时满足“lps靶向锚定+活菌代谢产生局部弱酸化诱导多肽构象翻转”两个条件，死菌无质子跨膜代谢、无局部ph下降，多肽维持亲水舒展状态，无法形成聚集驱动力，完全杜绝死菌造成的假阳性，可直接用于消毒效果验证、水体活菌计数等传统技术无法覆盖的场景。

35、2.本发明提供的金纳米探针抗复杂基质干扰，适配高蛋白、高油脂、浑浊液体样本。双重筛选门槛形成两级过滤：第一级lps特异性靶向短肽仅结合含完整lps活菌，游离蛋白、胶体杂质无法吸附探针；第二级ph响应构象开关肽仅活菌微环境可激活，即使少量探针非特异性吸附杂质，无构象翻转驱动力，不会产生团聚，血液、肉类匀浆、污水检测无自发蓝变现象。

36、3.本发明提供的活菌可视化检测方法检测速度快、操作简单、无需大型仪器，适合现场基层筛查。全程仅20 min-30 min肉眼出结果，无需pcr仪、恒温培养箱；试剂盒便携，单人即可完成批量样品检测，检测成本远低于免疫、核酸检测方案。