一种p-tau217的光激化学发光检测试剂、试剂盒及其应用的制作方法

本技术涉及免疫检测，尤其涉及一种p-tau 217的光激化学发光检测试剂、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（alzheimer disease，ad）俗称老年痴呆，是最常见的神经系统退行性疾病。在出现ad的临床症状前15~20年，就存在神经病理改变，如脑组织会出现β淀粉样蛋白（aβ）斑块、tau蛋白过度磷酸化等，aβ蛋白和tau蛋白的积聚会使神经元功能出现障碍甚至死亡，导致患者记忆等认知功能显著下降，但这个过程进展极其缓慢，因此将窗口前移，在疾病早期进行准确识别有助于ad的早期干预。

2、目前临床上对于ad的诊断手段包括量表评估、核磁共振成像（magneticresonance imaging，mri）、正电子发射断层扫描（positron emission tomography，pet）以及脑脊液（cerebro-spinal fluid，csf）检测等，由于存在客观性不足、侵入性强、操作繁琐，价钱昂贵等缺点极大限制了临床推广使用，特别是在基层医疗保健机构中的使用。ad临床漏诊率高达76.8%，难以对ad进行早期筛查和干预。因此，提供一种成本低、创伤性小、检测便捷、结果可标准化的ad血液标志物的精准检测成为临床的迫切需要。

3、p-tau 217是tau蛋白的一种磷酸化形式，主要在tau蛋白的第217位苏氨酸上发生磷酸化，在ad患者的临床前期已经显著升高，可以更早提示ad的发生。研究表明，健康人群的血浆中p-tau 217的平均水平大约在0.3至0.4 pg/ml，ad患者中则达到1至2 pg/ml，阳性判断值在1pg/ml以下。常规免疫检测技术通过光、电等检测手段对试剂体系反应后的整体信号进行检测，再通过标准曲线信号强度转换为检测浓度，但是其检测限普遍在1至10ng/ml左右，难以达到如此高的灵敏度要求，无法稳定检出血浆中的p-tau 217。单分子免疫阵列（single molecule array，simoa）技术是一种数字化检测技术，通过在磁珠表面形成捕获抗体-待测抗原-生物素化检测抗体-亲和素偶联的酶复合物，在结合荧光底物后将磁珠落入阵列化的微孔中进行反应后检测，其检测灵敏度相较于elisa和常规化学发光检测法得到了指数级的提升；但检测操作流程繁琐复杂、检测成本极高，极大限制了其临床推广使用。

技术实现思路

1、为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本技术提供一种p-tau 217的光激化学发光检测试剂、试剂盒及其应用，能够提高光激化学发光检测过程中检测试剂包含的能够特异性识别p-tau 217的有效抗体量，从而提高检测信号值，使得p-tau 217的检测灵敏度达到飞克级，满足血液样本中p-tau 217的检测需求。

2、本技术第一方面提供一种p-tau 217的光激化学发光检测试剂，其包括：包被于发光微球的特异性识别p-tau 217的第一抗体和标记有特异性结合配对成员之一的特异性识别p-tau 217的第二抗体；其中，所述第一抗体和/或第二抗体通过异肽键将其非特异性结合区域定向与目标物质偶联。

3、在一些实施方式中，所述异肽键通过catcher-tag系统形成。

4、在一些实施方式中，所述catcher-tag系统中catcher带有标签蛋白。

5、在一些实施方式中，所述catcher分子量为12～55kda。

6、在一些实施方式中，所述catcher包含赖氨酸残基。

7、在一些实施方式中，所述catcher中赖氨酸残基数量≥5。

8、在一些实施方式中，所述catcher-tag系统中catcher包被于发光微球表面，tag连接于所述第一抗体的非特异性结合区域。

9、在一些实施方式中，所述catcher-tag系统中catcher上标记有特异性结合配对成员之一，tag连接于所述第二抗体的非特异性结合区域。

10、在一些实施方式中，所述第一抗体的非特异性结合区域通过第一catcher-tag系统定向连接于所述发光微球；所述特异性结合配对成员之一通过第二catcher-tag系统定向连接于所述第二抗体的非特异性结合区域。

11、在一些实施方式中，所述第一catcher-tag系统和所述第二catcher-tag系统不同。

12、在一些实施方式中，每个所述第二抗体连接两个第二catcher-tag系统，均位于所述第二抗体的fc段。

13、本技术第二方面提供一种p-tau 217的光激化学发光检测试剂盒，其包括本技术第一方面所述的试剂。

14、本技术第三方面提供一种如上述的试剂或试剂盒在检测血液样本中p-tau 217标志物的应用。具体检测方法包括：将待测样本与包含第一抗体、第二抗体的反应体系相互接触，得到由第一抗体-(p-tau 217)-第二抗体形成的免疫反应产物，并检测所述免疫反应产物的光信号强度；其中，所述第一抗体和/或第二抗体通过异肽键将其非特异性结合区域定向与目标物质偶联。

15、在一些实施方式中，所述第一抗体和/或第二抗体通过catcher-tag系统形成异肽键，以将其与目标物质定向偶联。

16、在一些实施方式中，所述catcher-tag系统中catcher带有标签蛋白。

17、在一些实施方式中，所述catcher分子量为12～55kda。

18、在一些实施方式中，所述catcher包含赖氨酸残基。

19、在一些实施方式中，所述catcher中赖氨酸残基数量≥5。

20、在一些实施方式中，所述catcher-tag系统中catcher包被于发光微球表面，tag连接于所述第一抗体的非特异性结合区域。

21、在一些实施方式中，所述catcher-tag系统中catcher上标记有特异性结合配对成员之一，tag连接于所述第二抗体的非特异性结合区域。

22、在一些实施方式中，所述第一抗体的非特异性结合区域通过第一catcher-tag系统定向连接于所述发光微球；所述特异性结合配对成员之一通过第二catcher-tag系统定向连接于所述第二抗体的非特异性结合区域。

23、在一些实施方式中，所述第一catcher-tag系统和所述第二catcher-tag系统不同。

24、在一些实施方式中，每个所述第二抗体连接两个catcher-tag系统，均位于所述第二抗体的fc段。

25、在一些实施方式中，所述血液样本包括但不限于全血、血清、血浆中的一种或多种。

26、需要说明的是，本技术所述检测方法为非疾病诊断目的的方法。

27、本技术提供的技术方案可以包括以下有益效果：通过在光激化学发光检测中引入定向偶联的方式，提升了光激化学发光检测性能，使得光激化学发光法检测p-tau 217的灵敏度达到飞克级，满足血液样本p-tau 217的检测需求。本发明研究人员创造性发现，本方案增加了p-tau 217的光激化学检测试剂中能够特异性识别p-tau 217的有效抗体量，也可以最大限度保留检测试剂中p-tau 217抗体的活性。该试剂检测p-tau 217的检测成本低、检测操作流程简单，具有非常重要的临床应用价值。