马腺疫间接ELISA检测试剂盒及其应用

本发明涉及一种马腺疫间接elisa检测试剂盒及其应用，特别涉及一种基于无gst标签“eq8+sclf”融合蛋白的马腺疫间接elisa检测试剂盒及其应用。本发明属于医药。

背景技术：

1、马腺疫（strangles）是由马链球菌马亚种（streptococcus equi subspeciesequi, s.equi）引起的全球性高度接触性传染病，对全球养马业造成了明显的经济损失与动物健康威胁（boyle, et al., 2018）。该病防控的主要难点在于，部分康复马匹会转变为无症状携带者，其喉囊内长期潜伏的病原体可间歇性排菌，成为隐蔽传染源，导致疫情在马群中难以彻底根除（slater, 2003）。因此，建立能够回溯感染史、精准识别此类携带者的高效血清学诊断方法，是实现有效防控与净化的关键。

2、目前，血清学诊断广泛依赖进口的idvet®双抗原夹心elisa试剂盒，该试剂盒基于sem与seq_2190抗原对，诊断性能良好，被广泛用作参考方法（robinson, et al., 2013）。然而，其高昂成本和进口依赖在一定程度上制约了在我国基层的普及应用。此外，早期基于单一sem蛋白的elisa方法因与近缘种兽疫链球菌（s.zooepidemicus）存在交叉反应，特异性欠佳。因此，开发一种诊断性能相当、成本较低且供应稳定的国产化替代方案，具有重要的现实意义。

3、近年来，基于马腺疫疫苗候选抗原的基因组保守性分析为筛选新型诊断靶标提供了重要线索。研究发现，eq8（seq_0402）与sclf（seq_0855）基因编码的蛋白具有作为诊断抗原的潜力。本研究从中筛选出高保守的特异性片段“eq8”（150aa）和“sclf”（44aa）作为诊断靶标，构建为融合蛋白。gst标签虽便于亲和纯化，但其本身可能与非特异性抗体发生交叉反应，干扰检测结果。为此，本研究采用gst融合表达与酶切去除策略，制备无标签“eq8+sclf”融合蛋白，以消除标签干扰。通过棋盘滴定优化反应条件，建立间接elisa方法，并以idvet试剂盒为参比，评价其灵敏度、特异度和一致性，为开发国产化马腺疫诊断工具提供试验基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于无gst标签的“eq8+sclf”融合蛋白的马腺疫间接elisa检测试剂盒及其应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、本发明的一种马腺疫间接elisa检测试剂盒，包含包被有马链球菌马亚种eq8和sclf特有的高保守特异性片段融合蛋白的酶标板，其中编码所述的eq8和sclf特有的高保守特异性片段的核苷酸序列分别如seq id no.1以及2所示，二者之间通过柔性连接肽连接。

4、其中，优选的，编码所述的柔性连接肽的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、其中，优选的，所述的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。

6、其中，优选的，编码所述的融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.4所示。

7、其中，优选的，所述的融合蛋白是将seq id no.4所示核苷酸序列插入pegx-6p-1载体中通过诱导表达、纯化并且使用带gst标签的prescission protease对纯化后的融合蛋白进行酶切，获得的无gst标签的含有eq8和sclf特有的高保守特异性片段的融合蛋白。

8、其中，优选的，所述的试剂盒还包含以下试剂中的一种或多种：

9、（1）封闭液：5%v/v胎牛血清；

10、（2）血清稀释液：5%w/w牛血清白蛋白；

11、（3）酶标抗体稀释液：hrp耦联物稳定剂i型；

12、（4）hrp标记的兔抗马igg二抗；

13、（5）tmb显色液；

14、（6）终止液：2 mol/l h2so4；

15、（7）洗涤液：1×pbst。

16、其中，优选的，所述的酶标板的包被条件为：将所述的融合蛋白用ph 9.6，0.05mol/l碳酸盐缓冲液稀释至1 μg/ml，每孔加入100 μl，4℃包被12 h。

17、进一步的，本发明还提出了所述的马腺疫间接elisa检测试剂盒在制备马腺疫诊断试剂中的应用。

18、再进一步的，本发明还提出了所述的马腺疫间接elisa检测试剂盒在制备区分马腺疫疫苗免疫与马链球菌马亚种自然感染的试剂中的应用。

19、本发明筛选s.equi特有的“eq8”与“sclf”高保守片段作为诊断靶标，采用gst融合表达与酶切去除策略制备无标签“eq8+sclf”融合蛋白，western blot证实标签已完全去除，免疫反应性良好，且未检出与gst标签的交叉反应。通过棋盘滴定优化反应条件，建立间接elisa方法，并以idvet试剂盒为参考方法，对157份临床血清进行盲法比较。与idvet试剂盒的比较结果显示，两种方法的总符合率为92.36%，kappa值为0.84，表明两者一致性极强；本方法的相对灵敏度为89.55%（95% ci: 80.6%-95.7%），相对特异度为94.44%（95% ci:88.3%-98.3%），批间重复性良好（cv < 10%）。

20、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

21、1、高特异性与准确性：本发明筛选的“eq8”和“sclf”片段具备严格的s. equi种水平特异性，“sclf”片段在马链球菌兽疫亚种中缺失，“eq8”片段与兽疫亚种同源性低，从源头规避了与近缘菌株的交叉反应风险。同时，采用无标签纯化工艺，经western blot验证，gst标签已完全去除，未引入非特异性干扰，确保诊断特异度仅由“eq8+sclf”抗原本身的免疫反应特性决定。该试剂盒的特异度达94.44%，与进口idvet®试剂盒的总符合率达92.36%，kappa值为0.84，表明两者一致性极强，诊断结果准确可靠。

22、2、国产化与低成本：本试剂盒所用试剂均为国产化来源，相较于进口试剂盒，成本更低，更适合在我国基层养殖场景广泛应用，为马腺疫的大规模血清学筛查提供了经济可行的技术方案，有助于降低养殖成本，提高防控效率。

23、3、良好的重复性与稳定性：批间重复性试验结果显示，该试剂盒的变异系数均小于10%，表明其具有良好的重复性和稳定性，能够保证检测结果的可靠性，有利于诊断试剂的标准化生产和质量控制。

24、4、潜在的diva特性：本发明的诊断靶标“eq8”与“sclf”与国外已上市马腺疫疫苗strangvac®的抗原无交叉，“sclf”44aa特异性片段与strangvac®疫苗中的sclf片段属于不同氨基酸序列区域，理论上赋予该试剂盒区分疫苗免疫与自然感染马的潜力，为未来马腺疫疫苗的免疫监测和流行病学调查提供了备选技术方案。

25、5、技术创新性：本发明未沿用现有检测体系的抗原，而是通过生物信息学分析筛选新的特异性诊断靶标，构建融合蛋白并优化制备工艺，建立了一种全新的马腺疫间接elisa检测试剂盒，为马腺疫诊断技术的发展提供了新的思路和技术参考。

26、综上，本发明成功建立了国产化、成本可控的马腺疫间接elisa诊断方法，其诊断性能与进口商品化试剂盒高度一致，为减少进口依赖、实现基层大规模血清学筛查提供了技术支撑。