一种快速检测ADAMTS13活性的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学检测，尤其涉及一种快速检测adamts13活性的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、adamts13，一种金属蛋白酶，是血浆中负责切割血管性血友病因子（vonwillebrand factor, vwf）的酶，其活性缺失或严重降低与血栓性血小板减少性紫癜（ttp）等疾病密切相关。准确检测adamts13活性对于ttp的诊断、分型和疗效监测至关重要。

2、目前，adamts13活性检测方法主要包括：质谱法和传统elisa法等。质谱法通过检测vwf酶切产物的分子量变化，准确度高但设备昂贵、操作复杂、耗时较长（通常需4~6小时），难以满足临床快速诊断需求；传统elisa法基于抗体检测vwf底物被切割后暴露的表位，但通常需较长的孵育时间（4小时以上），且信号背景较高，灵敏度受限，同样无法满足快速检测需求。

3、因此，亟需开发一种操作简便、检测时间短且特异性强的adamts13活性检测方案。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种快速检测adamts13活性的试剂盒及其应用，以解决现有针对adamts13的elisa检测方法时间过长，无法实现快速检测的问题。

2、本发明快速检测adamts13活性试剂盒的设计思路为：在vwf的adamts13特异性识别序列（vwf73）两端分别连接可被抗体识别的标签（如his标签和ha标签），并在n端或c端进一步偶联信号屏蔽基团（如gst、polye等），通过空间位阻和电荷效应在未切割状态下阻断标签信号；当样本中存在adamts13时，其切割vwf73序列，释放标签，使标签信号与酶活性正相关，而不加酶时信号几乎为零，可以大幅提高检测灵敏度。

3、本发明的技术方案是这样实现的：

4、第一方面，本发明提供了一种快速检测adamts13活性的试剂盒，其包括包被于固相载体上的重组多肽、标记抗体和抗体稀释液；所述重组多肽从n端至c端依次包含第一标签、vwf73片段和第二标签。

5、在以上技术方案的基础上，优选的，所述vwf73片段的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述第一标签和第二标签包括his标签或ha标签。

6、进一步优选的，所述第一标签为his标签，第二标签为ha标签。

7、其中，序列seq id no.1具体为：

8、dreqapnlvymvtgnpasdeikrlpgdiqvvpigvgpnanvqelerigwpnapiliqdfetlpreapdlvlqrle。

9、在以上技术方案的基础上，优选的，所述重组多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示、核苷酸序列如seq id no.3所示。

10、序列seq id no.2具体为：

11、mhhhhhhdreqapnlvymvtgnpasdeikrlpgdiqvvpigvgpnanvqelerigwpnapiliqdfetlpreapdlvlqrleypydvpdya。

12、序列seq id no.3具体为：

13、atgcaccaccaccaccaccacgatagggaacaagctcccaatctagtatatatggtcaccggtaatccggcaagcgacgagatcaagcgcttgccgggtgatattcaggttgttccgatcggcgttggtccgaacgcgaacgtgcaagagttggaacgtattggctggccgaacgcgccaatcctgattcaagacttcgagacgctgccgcgtgaagctccggatctggtgctgcagcgtctcgagtacccatacgatgttccagattacgcttga。

14、在以上技术方案的基础上，优选的，所述重组多肽从n端至c端依次包含信号屏蔽基团、第一标签、vwf73片段和第二标签，或所述重组多肽从n端至c端依次包含信号屏蔽基团、第一标签、vwf73片段、第二标签和第二屏蔽基团。

15、在以上技术方案的基础上，优选的，所述信号屏蔽基团和第二屏蔽基团包括gst、fc、mbp、sumo或polye中的任一种。

16、进一步优选的，所述信号屏蔽基团为gst；所述第二屏蔽基团为polye。

17、在以上技术方案的基础上，优选的，所述重组多肽的氨基酸序列如seq id no.4或seq id no.5所示。

18、其中，包含信号屏蔽基团时的序列（gst-his-vwf73-ha）如seq id no.4所示，序列seq id no.4具体为：

19、mspilgywkikglvqptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefpnlpyyidgdvkltqsmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchktylngdhvthpdfmlydaldvvlymdpmcldafpklvcfkkrieaipqidkylksskyiawplqgwqatfgggdhppksdhhhhhhdreqapnlvymvtgnpasdeikrlpgdiqvvpigvgpnanvqelerigwpnapiliqdfetlpreapdlvlqrleypydvpdya。

20、进一步的，包含信号屏蔽基团和第二屏蔽基团时的序列（gst-his-vwf73-ha-polye）如seq id no.5所示，序列seq id no.5具体为：

21、mspilgywkikglvqptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefpnlpyyidgdvkltqsmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchktylngdhvthpdfmlydaldvvlymdpmcldafpklvcfkkrieaipqidkylksskyiawplqgwqatfgggdhppksdhhhhhhdreqapnlvymvtgnpasdeikrlpgdiqvvpigvgpnanvqelerigwpnapiliqdfetlpreapdlvlqrleypydvpdyaeeeeeeeeeeeeeeeeeeee。

22、在以上技术方案的基础上，优选的，所述抗体稀释液为含bsa和稳定剂的pbs缓冲液。

23、进一步优选的，所述抗体稀释液的ph为6.0~7.0。

24、更进一步优选的，所述抗体稀释液为含0.05wt% bsa和0.01wt%稳定剂（购自上海闪锦生物科技有限公司，货号位为zb055，sg09 hrp酶稳定剂）的pbs缓冲液，ph为6.0；其中pbs缓冲液配方为：na2hpo41.44 g，kh2po40.24 g，溶解到1l双蒸水中，调节ph至7.5。

25、在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括显色液、终止液和adamts13标准品。

26、进一步优选的，所述显色液为tmb显色液；所述终止液为2m h2so4。

27、第二方面，提供了一种如上所述的试剂盒在以非疾病诊断为目的的检测adamts13活性中的应用。

28、第三方面，提供了一种如上所述的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

29、s1，使用cbs包被液将gst-his-vwf73-ha-polye稀释到200ng/ml，并每孔100ul加入酶标板孔中，于4℃恒温箱过夜孵育；

30、s2，pbst洗板三次后，加入经过ph 7.5的样品稀释液稀释好的样品，每孔100ul加入对应孔中，37℃孵育30分钟；

31、s3，pbst洗板三次后，加入8000x的his抗体偶联的hrp（使用ph 6.0的his抗体稀释液稀释），每孔加入100ul，37℃反应30分钟；

32、s4，pbst洗板三次后，每孔加入tmb显色液100μl，用封板膜封住反应孔，37℃避光反应10分钟；

33、s5，每孔加入终止液100μl，请保持加入终止液的顺序和时间与加入tmb显色剂的顺序和时间一致；

34、s6，使用终止液终止反应，后立即在450nm处读取每一孔的吸光度（od值）。

35、本发明的快速检测adamts13活性的试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：

36、1、检测速度快，显著缩短检测周期：通过引入gst和polye双重信号屏蔽基团，省去了传统elisa中冗长的封闭和多次长时间孵育步骤，将总检测时间压缩至2小时以内，相比现有质谱法（4~6小时）和传统elisa法（≥4小时），检测时间缩短50%以上，真正实现了adamts13活性的快速检测，满足临床急诊和批量筛查的需求。

37、2、灵敏度高，信号动态范围宽：本发明通过空间位阻（gst）和静电排斥（polye）的双重物理阻断机制，使未切割状态下的背景信号几乎为零。当adamts13切割底物后，信号强度与酶活性呈正比线性增长（r²＞0.987），检测下限可达3%残余活性，动态范围覆盖3%~100%相对活性，远优于传统信号下降型elisa法的检测灵敏度和范围。

38、3、特异性强，临床区分度优异：本发明采用vwf73这一adamts13特异性识别序列作为酶切底物，保证了检测的高度特异性。临床验证结果表明，16例健康人血浆与10例ttp患者（adamts13活性＜10%）血浆的od值分布无任何重叠，诊断灵敏度和特异性均达到100%，能够清晰区分正常人与ttp患者，避免了假阳性或假阴性结果。

39、4、优化抗体稀释液（ph 6.0，低盐）用于维持屏蔽基团的锁定状态，将背景信号压至最低。