CXCR4+B细胞作为干燥综合征诊断或辅助诊断标志物的应用

本发明涉及临床检验诊断，具体涉及cxcr4+b细胞作为干燥综合征诊断或辅助诊断标志物的应用。

背景技术：

1、干燥综合征（sjögren's disease，sjd）是一种系统性自身免疫性上皮炎，其主要病理特征为泪腺和唾液腺的慢性淋巴细胞浸润，导致外分泌功能衰竭及口眼干燥症状。目前，干燥综合征的诊断主要依据2016年美国风湿病学会（acr）和欧洲抗风湿病联盟（eular）联合制定的分类标准，该标准综合了临床症状（眼干、口干）、血清学指标（抗ssa抗体阳性）、眼部检查（schirmer试验、角膜染色）及唇腺活检病理结果。然而，上述诊断手段存在明显不足：唇腺活检为侵入性操作，患者接受度低且存在采样误差；血清自身抗体（如抗ssa/ssb抗体）在部分干燥综合征患者中呈阴性，敏感性有限，导致大量早期或血清阴性患者被漏诊；眼部及口腔检查受主观因素影响较大。因此，寻找无创或微创、简便易行且具有高敏感性的辅助诊断标志物，用于干燥综合征的早期预警和阴性人群的快速排除，是当前临床诊疗中亟待解决的关键需求。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供cxcr4+b细胞作为干燥综合征诊断或辅助诊断标志物的应用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

2、本发明的第一方面提供了检测受试者外周血中cxcr4+b细胞亚群比例的试剂在制备诊断或辅助诊断干燥综合征的产品中的应用，所述cxcr4+b细胞亚群为表达cxcr4的b细胞，所述比例为cxcr4+b细胞数占b细胞总数的百分比。

3、cxcr4（c-x-c motif chemokine receptor 4）属于g蛋白偶联的7次跨膜受体，是cxc趋化因子家族成员基质细胞衍生因子-1（sdf-1/cxcl12）的受体。在本发明中，cxcr4包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长、未加工的cxcr4，以及源自细胞中加工的任何形式的cxcr4，涵盖cxcr4的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体），涵盖例如cxcr4基因，人的cxcr4以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物（例如小鼠和大鼠）的cxcr4。作为一种优选的实施方案，在本发明中，cxcr4为人的基因，基因id为7852。

4、进一步，所述试剂为能够结合完整b细胞上cxcr4的特异性结合剂，所述检测以保持细胞完整形态的方式在单细胞水平上进行。

5、在可选的实施例中，所述特异性结合剂为抗cxcr4抗体或其抗原结合片段。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。适用于本发明的抗cxcr4抗体的非限制性实例包括克隆号为12g5、2b11、12g8等的抗cxcr4抗体。所述特异性结合剂还可以是cxcr4的天然配体（如cxcl12/sdf-1α）或其衍生物、经改造的配体类似物、能够特异性结合cxcr4的肽、核酸适配体或小分子化合物。

6、在本发明中，所述在单细胞水平上的检测包括通过流式细胞术对b细胞群体进行亚群划分，并计算各b细胞亚群中cxcr4阳性细胞的比例。适用于本发明的单细胞水平检测方法包括但不限于：流式细胞术（facs）、质谱流式技术（mass cytometry）、单细胞成像流式术、基于微流控芯片的单细胞分析、单细胞转录组分析以及抗体-寡核苷酸标记的单细胞多组学分析。

7、进一步，所述特异性结合剂包括特异性结合cxcr4基因编码蛋白的荧光标记抗体和/或识别b细胞表面标志物的抗体。

8、在可选的实施例中，所述特异性结合剂携带可检测的标记物，所述标记物选自荧光染料（如pe、fitc、apc、bv421等）、放射性同位素、酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）、生物素、化学发光基团、量子点或金属标签（适用于质谱流式检测）。

9、在本发明的一个实施方案中，所述特异性结合剂为荧光染料标记的抗cxcr4抗体，可通过流式细胞术检测完整b细胞表面的cxcr4表达。

10、在可选的实施例中，所述b细胞表面标志物为cd19和/或cd20。

11、在可选的实施例中，所述干燥综合征包括原发性干燥综合征和/或继发性干燥综合征。

12、本发明第二方面提供了一种用于诊断或辅助诊断干燥综合征的试剂盒，所述试剂盒包含检测受试者外周血中cxcr4+b细胞亚群比例的试剂。

13、进一步，所述试剂盒包括：（1）用于识别b细胞表面标志物的第一抗体；（2）用于检测cxcr4的第二抗体。所述b细胞表面标志物为cd19和/或cd20。

14、所述第一抗体和第二抗体带有不同标记。

15、所述标记选自荧光染料（如pe、fitc、apc、bv421等）、放射性同位素、酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）、生物素、化学发光基团、量子点或金属标签（适用于质谱流式检测）。所述“不同标记”是指：第一抗体与第二抗体各自偶联了具有不同物理化学特性的信号报告基团，这些基团能够通过特定的检测设备（如流式细胞仪、质谱仪、酶标仪或荧光显微镜）产生可供检测系统区分的信号。只要对应的检测通道或信号读取方式互不干扰，即视为符合本发明的“带有不同标记”。

16、作为一种可选的实施方式，所述第一抗体和所述第二抗体分别独立地偶联于固相载体，所述固相载体选自磁性微球、酶标板孔壁或微流控芯片通道。

17、在可选的实施例中，所述试剂盒还包括选自以下的一种或多种：细胞固定液、细胞破膜缓冲液、同型对照抗体、细胞活性染料、计数微球。

18、本发明第二方面提供的试剂盒中，所述cxcr4+b细胞亚群比例高于健康对照人群的参考值时，指示受试者可能患有干燥综合征或患干燥综合征的风险升高。

19、本发明第三方面提供了一种体外检测受试者外周血中cxcr4+b细胞亚群比例的方法，所述方法包括以下步骤：

20、（1）获取受试者的外周血样本，分离外周血单个核细胞，保持细胞完整形态；

21、（2）使用识别b细胞表面标志物的第一抗体和检测cxcr4的第二抗体对细胞进行依次或同时孵育；

22、（3）通过流式细胞术检测并计数cxcr4+b细胞数量及b细胞总数；

23、（4）计算cxcr4+b细胞数占b细胞总数的百分比。

24、所述b细胞表面标志物为cd19和/或cd20。

25、本发明的优点和有益效果：本发明提供的辅助诊断标志物样本需求低，仅需外周血样本即可检测，创伤性小，且可重复检测，适用于疾病的动态监测和疗效评估。检测方法上，本发明采用流式细胞术标准操作流程，简便快捷，整个检测周期短，适合临床检验科常规批量开展，具有良好的临床可及性。在核心诊断效能方面，该标志物的灵敏度高达94.4%，赋予其极强的阴性预测能力，可作为干燥综合征的一线筛查分流工具。基于此，临床实践中可将该标志物检测作为前置分流手段：检测结果为阴性者，可高效排除患病可能，大幅减少不必要的唇腺活检等侵入性操作及其带来的采样误差和患者痛苦；检测结果为阳性者，再序贯联合2016年acr/eular分类标准进行确诊。该“筛查-分流-确诊”序贯策略有效规避了单一指标特异性不足的局限，将本发明高灵敏度的核心优势切实转化为临床分流效益，在显著降低漏诊率的同时优化了医疗资源配置，具有广阔的临床应用推广前景。