基于绿色荧光蛋白的植物叶绿体亚区室特异性钙成像监测方法及应用和检测试剂盒

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于绿色荧光蛋白的植物叶绿体亚区室特异性钙成像监测方法及应用和检测试剂盒。

背景技术：

1、钙离子是植物最重要的第二信使之一，参与调控植物生长发育、逆境响应（如干旱、高温、病虫害等）、光合作用等几乎所有重要的生理过程。而叶绿体作为植物特有的半自主细胞器，不仅是光合作用的场所，也是细胞内重要的钙离子库和环境信号感受细胞器。叶绿体钙信号在调节光合效率、应对逆境胁迫、介导细胞器间信号传导等方面发挥着关键作用。然而由于实验手段的限制，缺乏高时空分辨率、高特异性的亚细胞钙成像技术，目前人们对叶绿体不同亚细胞结构（外膜、内膜和类囊体膜外侧）中对环境变化引起的钙信号时空动态变化规律的了解还非常有限。

2、传统化学钙指示剂（如 fluo-4 am、rhod-2 am 等）无法特异性定位到叶绿体的不同亚细胞结构；且难以穿透植物细胞壁，加载效率极低，加载后还会在细胞内自由扩散，导致监测结果无法反映特定细胞器的真实钙信号。

3、现有基因编码钙指示剂（geci）大多仅能定位到细胞质或细胞核中。

技术实现思路

1、本发明旨在解决现有技术中的问题，提供一种能实现叶绿体亚区室钙信号全方位精准监测的基于绿色荧光蛋白的植物叶绿体亚区室特异性钙成像监测方法及应用和检测试剂盒。

2、为了实现上述目的，本申请第一方面提供一种能实现叶绿体亚区室钙信号全方位精准监测的基于绿色荧光蛋白的植物叶绿体亚区室特异性钙成像监测方法，包括：

3、s100、将分别靶向叶绿体外膜、叶绿体内膜、叶绿体基质和类囊体膜外侧的特异性信号肽与钙指示剂gcamp6m的n端融合得到融合片段，将融合片段克隆构建得到四种重组表达载体；

4、s120、将所述四种重组表达载体分别导入受体植物，获得稳定表达各钙成像探针的转基因植株；

5、s140、对获得的转基因植株施加高温胁迫处理，利用荧光显微镜连续采集时序荧光图像，计算相对钙信号强度，实现叶绿体不同亚细胞结构钙信号的实时动态监测。

6、在一实施方式中，靶向叶绿体外膜的特异性信号肽为atoep7信号肽，其核苷酸序列如seq id no:1所示；靶向叶绿体内膜的特异性信号肽为attic21信号肽，其核苷酸序列如seq id no:2所示；靶向叶绿体基质的特异性信号肽为atbam4信号肽，其核苷酸序列如seq id no:3所示；靶向类囊体膜外侧的特异性信号肽为atstn7信号肽，其核苷酸序列如seq id no:4所示。

7、在一实施方式中，所述钙指示剂gcamp6m的核苷酸序列如seq id no:5所示。

8、在一实施方式中，所述克隆为将各融合片段克隆至camv35s启动子驱动的phellsgate8植物双元表达载体中。

9、在一实施方式中，所述受体植物为micro-tom番茄或moneymaker番茄。

10、在一实施方式中，在对获得的转基因植株施加胁迫处理之前，还包括s130、利用激光共聚焦显微镜对转基因植株进行荧光成像，验证各钙成像探针在对应叶绿体亚细胞结构的靶向定位效果。

11、在一实施方式中，激光共聚焦显微镜成像的gfp荧光通道激发波长为488nm，发射光采集范围为500-550nm；叶绿素自发荧光通道激发波长为488nm，发射光采集范围为650-700nm。

12、本申请的第二方面提供上项所述方法在植物叶绿体钙信号监测中的应用。

13、本申请的第二方面提供一种植物叶绿体亚区室特异性钙成像检测试剂盒，包含四种重组表达载体，所述四种重组表达载体分别为：靶向叶绿体外膜的atoep7-gcamp6m融合表达载体、靶向叶绿体内膜的attic21-gcamp6m融合表达载体、靶向叶绿体基质的atbam4-gcamp6m融合表达载体及靶向类囊体膜外侧的atstn7-gcamp6m融合表达载体。在一实施方式中，利用这一方法检测和区分了在常温24℃下，以及高温胁迫37℃以及42℃下细胞质以及叶绿体的钙信号差异。

14、与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：本发明通过构建靶向叶绿体外膜、叶绿体内膜、叶绿体基质和类囊体膜外侧的特异性信号肽与钙指示剂gcamp6m的n端融合得到融合片段获得相应的重组表达载体，可以实现毫秒级监测植物叶绿体不同亚细胞部位的钙信号变化，实现了对叶绿体特定亚细胞结构钙信号的特异性监测，避免了传统化学指示剂的非特异性扩散问题，在高温胁迫条件下，利用荧光显微镜连续采集时序荧光图像，计算相对钙信号强度，实现叶绿体不同亚细胞结构钙信号的实时动态监测，为进一步研究植物的叶绿体钙信号相关分子生物学机制以及品种改良提供理论与实践依据，具有非常重要的经济效益和社会效益。结果发现：37℃高温胁迫下叶绿体内膜、基质、类囊体膜外侧均可监测到钙信号升高（约50s达峰），而外膜无响应；42℃极端胁迫下外膜出现滞后响应（约60s开始升高，180s达峰）。这表明植物响应高温胁迫时钙信号最先在叶绿体内部产生，随胁迫程度升高可进一步传导至胞质侧，呈现出分区、时序化的特征。

1.一种基于绿色荧光蛋白的植物叶绿体亚区室特异性钙成像监测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，靶向叶绿体外膜的特异性信号肽为atoep7信号肽，其核苷酸序列如seq id no:1所示；靶向叶绿体内膜的特异性信号肽为attic21信号肽，其核苷酸序列如seq id no:2所示；靶向叶绿体基质的特异性信号肽为atbam4信号肽，其核苷酸序列如seq id no:3所示；靶向类囊体膜外侧的特异性信号肽为atstn7信号肽，其核苷酸序列如seq id no:4所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钙指示剂gcamp6m的核苷酸序列如seqid no:5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆为将各融合片段克隆至camv35s启动子驱动的phellsgate8植物双元表达载体中。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受体植物为micro-tom番茄或moneymaker番茄。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对获得的转基因植株施加胁迫处理之前，还包括s130、利用激光共聚焦显微镜对转基因植株进行荧光成像，验证各钙成像探针在对应叶绿体亚细胞结构的靶向定位效果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，激光共聚焦显微镜成像的gfp荧光通道激发波长为488nm，发射光采集范围为500-550nm；叶绿素自发荧光通道激发波长为488nm，发射光采集范围为650-700nm。

8.权利要求1-7任一项所述方法在植物叶绿体钙信号监测中的应用。

9.一种植物叶绿体亚区室特异性钙成像检测试剂盒，其特征在于，包含四种重组表达载体，所述四种重组表达载体分别为：靶向叶绿体外膜的atoep7-gcamp6m融合表达载体、靶向叶绿体内膜的attic21-gcamp6m融合表达载体、靶向叶绿体基质的atbam4-gcamp6m融合表达载体及靶向类囊体膜外侧的atstn7-gcamp6m融合表达载体。