一种结直肠癌预后的多重免疫荧光检测试剂盒及量化评估方法与流程

本发明体外诊断试剂，具体为一种结直肠癌预后的多重免疫荧光检测试剂盒及量化评估方法。

背景技术：

1、结直肠癌（colorectal cancer, crc）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其预后评估对于制定治疗策略至关重要。近年来，随着肿瘤免疫学和分子病理学的快速发展，多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mif）技术在肿瘤微环境研究中的应用日益广泛，该技术能够在单张组织切片上同时检测多种蛋白质标志物，并通过图像分析实现细胞空间分布的定量分析，为肿瘤预后评估提供了新的技术手段。然而，现有技术中仍存在诸多不足，需要进一步改进。

2、比如，公开号为cn113151483a的中国专利，公开了一种结直肠癌代谢基因预后预测模型及试剂盒，其技术方案涉及利用ugt2a、acaa2、pkm、gpx3、pafah1b3、sox9等6个代谢相关基因的表达量与系数乘积之和来预测患者预后。然而，该技术方案存在以下不足：该方法仅基于基因表达水平的静态数值分析，缺乏对肿瘤微环境中免疫细胞空间分布的考量，无法反映肿瘤细胞与免疫细胞之间的空间相互作用关系；同时，该方法依赖于外周血或组织样本的基因检测，因而无法在单张组织切片上同时呈现多种蛋白标志物的空间表达信息，限制了其在肿瘤微环境层面的预后评估能力。

3、公开号为cn117153382a的中国专利，公开了一种预测结直肠癌预后风险的模型构建方法，通过gse39582数据集筛选结直肠癌预后相关基因，构建预后标签pscrc并进行验证，进一步整合临床指标构建多因素预后模型。然而，该技术方案同样存在以下不足：该方法基于基因表达芯片数据进行分析，属于分子水平的静态检测，缺乏对肿瘤组织原位空间分布的表征能力；该技术方案无法同时检测多种蛋白质标志物在肿瘤微环境中的空间表达情况，因此无法评估不同细胞类型之间的空间邻域关系和物理接触状态，制约了其在精准预后评估中的应用效果。

4、再比如，coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoralimmunity at the colorectal cancer invasive front；期刊名称、卷号、期号和页码：《cell》、2020年，第182卷、第5期、第1341-1359页。公开了一种评估结直肠癌微环境空间分布的方法。其主要技术措施与步骤如下：（1）采用 codex（co-detection by indexing）高通道多重荧光成像平台，使用包含 35 种寡核苷酸标签抗体的超大面板（panel）对 crc 石蜡切片进行原位染色。（2）通过图像处理软件进行单细胞核分割，提取单细胞的 35 个标志物表达矩阵以鉴定几十种免疫与间质细胞表型。（3）以每个单细胞为中心，选取其最近邻的20 个细胞作为一个“空间窗口（window）”，计算窗口内的细胞类型频率。（4）利用 k-means算法对所有空间窗口的细胞频率进行无监督聚类，将具有相似细胞组成的区域定义为“细胞邻域（cellular neighborhoods, cns）”，最终通过特定邻域的组合频率来预测患者的生存期。该技术方案的依赖包含 35 种特殊标记抗体的检测试剂盒以及昂贵的专有硬件设备，单张切片的检测成本高达数万元，且染色与扫描周期极长。产品与工艺成本极高，无法满足临床常规应用。与此同时，空间算法缺乏精确的物理距离约束：其“细胞邻域”的定义是基于局部窗口内“细胞种类频率”的宏观聚类，掩盖了特定细胞之间的微观物理直接接触。该算法无法精确捕捉到引发极端恶性表型的单一细胞点对点互作（如距离 <50μm 的物理依附），容易因邻域范围过大而引入假阳性关联。

5、quantitative multiplex immunohistochemistry reveals myeloid-inflamedtumor-immune complexity associated with poor prognosis；期刊、卷号、期号和页码：《cell reports》、2017年，第19卷、第1期、第203-217页。公开了一种利用 7 色多重免疫组化（mihc）量化肿瘤组织中巨噬细胞及 t 细胞以评估预后的方法。其主要技术措施与步骤如下：（1）使用包含 pan-ck, cd68, cd163, cd8 等常规抗体的检测试剂盒对肿瘤切片进行多重染色。（2）通过图像分析软件（如 inform）识别上皮细胞与间质区域。（3）根据荧光阈值，将间质中的细胞分类为总巨噬细胞（cd68+）、m2型巨噬细胞（cd163+）和效应 t 细胞（cd8+）。（4）计算全切片或人为划定的感兴趣区（roi）内各细胞的整体密度，并计算“cd8+ t细胞密度”与“m2型巨噬细胞密度”的简单比值，以此比值作为患者预后不良及免疫抑制的评估指标。然而，该方案的靶点组合（panel）缺乏针对极端恶性状态的特异性：该试剂盒使用的标志物（如仅用 cd163 标记 m2 巨噬细胞）过于宽泛，无法精准识别结直肠癌微环境中真正主导免疫排斥的核心亚群（如表达 apoe 的特异性巨噬细胞）。同时，其对肿瘤细胞的识别仅停留在静态的上皮特征（pan-ck），忽略了处于上皮间质转化中间态（hybrid-emt）这一最具侵袭性的肿瘤细胞动态特征。同时，该方案缺乏真实空间拓扑量化，性能不足：其统计方法仅计算大面积区域内的“平均细胞密度”或“密度比值”，这种静态统计完全割裂了结直肠癌微环境中“距离肿瘤边缘远近直接决定 t 细胞浸润程度”的空间排斥效应（immune exclusion）。由于未能引入基于最近邻物理距离（nearest neighbor distance）的空间量化模型，其在预测早期结直肠癌患者（如常规 mss 型）的高复发风险时，灵敏度与特异性存在严重不足。

6、综上所述，现有的结直肠癌预后相关技术主要依赖于基因表达分析、单一蛋白标志物检测或影像学方法，这些技术方案均未能充分利用多重免疫荧光检测技术在单张组织切片上同时检测多种蛋白质标志物的优势，无法全面获取肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤细胞之间的空间分布信息和相互作用关系。因此，研发一种能够同时检测多种标志物并评估空间分布的结直肠癌预后多重免疫荧光检测试剂盒及评估方法，具有重要的临床应用价值。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中结直肠癌预后评估方法存在的成本高昂、标志物组合缺乏特异性以及缺乏精确空间拓扑量化模型等技术缺陷，提供了一种成本可控、特异性强且具备精确空间距离量化能力的检测试剂盒及评估方法。

2、第一方面，本发明提供了一种用于结直肠癌预后评估的多重免疫荧光检测试剂盒，该试剂盒包含以下组成部分：

3、特异性一抗组合，该一抗组合由以下五种抗体组成：抗pan-ck抗体、抗vimentin抗体、抗cd68抗体、抗apoe抗体以及抗cd8抗体；所述抗pan-ck抗体用于标记肿瘤细胞上皮标记物，所属pan-ck为广谱细胞角蛋白，能够识别大多数上皮源性肿瘤细胞；所述抗vimentin抗体用于标记间质细胞标记物，vimentin蛋白在处于上皮间质转化过程中的肿瘤细胞中高表达；所述抗cd68抗体用于标记巨噬细胞总群体，cd68为巨噬细胞特异性表面分子；所述抗apoe抗体用于标记具有免疫排斥功能的特异性巨噬细胞亚群，apoe（载脂蛋白e）在特定促肿瘤型巨噬细胞中高表达；所述抗cd8抗体用于标记细胞毒性t淋巴细胞，cd8分子在效应t细胞表面特异性表达。

4、荧光检测系统，包括分别对应上述五种一抗的具有不同发射波长的酪胺信号放大荧光染料；具体包括：用于检测抗pan-ck抗体的第一荧光染料，采用if440-tyramide或类似荧光素，其激发波长为434纳米，发射波长为470～490纳米；用于检测抗vimentin抗体的第二荧光染料，采用if434-tyramide或类似荧光素，其激发波长为491纳米，发射波长为510～530纳米；用于检测抗cd68抗体的第三荧光染料，采用if546-tyramide或类似荧光素，其激发波长为541纳米，发射波长为550～570纳米；用于检测抗apoe抗体的第四荧光染料，采用if594-tyramide或类似荧光素，其激发波长为588纳米，发射波长为590～610纳米；用于检测抗cd8抗体的第五荧光染料，采用if647-tyramide或类似荧光素，其激发波长为656纳米，发射波长为660～680纳米；上述五种荧光染料均采用酪胺信号放大技术进行标记，该技术通过辣根过氧化物酶催化酪胺底物在抗原位置形成大量活性氧基团，进而与荧光染料结合实现信号放大，显著提高检测灵敏度。上述波长配置确保各通道之间光谱分离度大于80%，最大程度避免光谱重叠造成的信号串扰。

5、细胞核染料，该细胞核染料为dapi染液，dapi（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）能够特异性结合双链dna，在紫外光激发下发出蓝色荧光，用于细胞核轮廓的显像和细胞分割定位。

6、辅助试剂组合，该辅助试剂组合包含以下组分：抗原修复液，用于对组织切片进行热诱导抗原修复，恢复被交联掩盖的抗原表位，抗原修复液的具体配方为ph=6.0的柠檬酸盐缓冲液体系；免疫染色抗体洗脱液，用于在多重免疫荧光染色过程中洗脱已结合的一抗和二抗，以便进行下一轮抗体染色，抗体洗脱液含有ph=8.0的 tris-edta缓冲液并添加适量去垢剂；染色稀释液，用于稀释一抗和二抗至工作浓度，含有bsa和tween-20的pbs缓冲体系；组织自发荧光淬灭剂，用于降低组织切片的自发荧光背景，典型配方为含硫酸铜和氨水的缓冲体系；抗荧光淬灭封片剂，用于封片后防止荧光淬灭，为含有甘油和抗荧光淬灭剂的混合溶液。

7、在上述检测试剂盒的一些优选实施方式中，所述特异性一抗组合中各抗体的浓度范围如下：抗pan-ck抗体的工作浓度为2～10ng/ml；抗vimentin抗体的工作浓度为2～10ng/ml；抗cd68抗体的工作浓度为2～10ng/ml；抗apoe抗体的工作浓度为0.5～5ng/ml；抗cd8抗体的工作浓度为2～10ng/ml。

8、第二方面，本发明提供了一种基于上述检测试剂盒的空间量化评估方法，该方法包括以下步骤：

9、步骤一，细胞分割与表型鉴定，首先利用图像扫描设备获取经试剂盒染色的结直肠癌石蜡切片的多通道荧光图像，图像扫描设备采用高分辨率荧光显微镜或组织切片荧光扫描仪，配备20x或40x物镜；然后利用图像分析软件对dapi通道图像进行细胞核识别和分割，具体采用基于深度学习的细胞核分割算法（如u-net架构的卷积神经网络）或基于形态学操作的经典分割算法（分水岭算法结合形态学重建），提取每个细胞核的中心坐标和轮廓信息；接着提取每个单细胞在各荧光通道的平均荧光强度，计算公式为：，其中为单个像素的荧光强度值，为该细胞轮廓内参与计算的像素数量；然后根据预设的荧光强度阈值对各通道进行二值化处理，判定阳性与阴性。

10、该阈值的设定采用以下方法：取同批次阴性对照切片对应通道荧光强度的均值加上2～3倍标准差作为阈值；或采用免疫组化阳性样本的荧光强度分布确定阳性阈值；最后根据双阳性标准筛选目标细胞群，具体筛选标准如下：细胞群a（杂交emt肿瘤细胞）的筛选标准为pan-ck通道荧光强度大于阈值且vimentin通道荧光强度大于阈值；细胞群b（apoe阳性巨噬细胞）的筛选标准为cd68通道荧光强度大于阈值且apoe通道荧光强度大于阈值。

11、进一步地，扫描好的切片用qupath软件读取并计算。

12、步骤二，空间最近邻距离计算，包括以下具体操作：首先从步骤一获取的细胞分割结果中提取所有细胞群a和细胞群b的物理坐标，每个细胞的坐标以其细胞核中心在图像中的像素位置表示，然后根据图像的像素尺寸将其转换为μm单位的物理坐标（x, y），像素尺寸的确定依赖于扫描设备的校准参数，典型值为0.25μm/pixel；然后对于切片中的每一个细胞群a细胞，计算其到所有细胞群b细胞的欧氏距离，选取最小值作为该细胞群a细胞的最近邻距离，计算公式为：，其中为第i个细胞群a细胞的最近邻距离，和为该细胞的物理坐标，和为第j个细胞群b细胞的物理坐标，j的取值范围为1至n（n为细胞群b的细胞总数）；接着计算切片中所有细胞群a细胞最近邻距离的统计参数；最后统计细胞群a与细胞群b之间距离小于预设阈值的配对细胞数量，该预设阈值的优选范围为20μm～100μm，默认值为50μm。

13、进一步地，在上述步骤二的一些优选实施方式中，对于细胞数量大于1000个的大样本切片，采用基于kd树的空间索引算法加速最近邻搜索，降低计算复杂度。对于某些特殊需求，还可以计算第二近邻距离和第三近邻距离，以获得更全面的空间分布信息。

14、步骤三，高风险生态位量化与预后分层，包括以下具体操作：首先设定空间共定位距离阈值t，该阈值的默认值为50μm；在实际应用中，可根据具体实验平台的分辨率和肿瘤分期进行优化调整；然后计算每个高风险生态位区域的cd8阳性t细胞浸润密度，具体方法为：选取该区域周围50μm～200μm范围内的所有细胞，统计cd8通道阳性的细胞数量，除以该环形区域的面积，得到cd8阳性t细胞的浸润密度值；接着设定cd8阳性t细胞浸润密度的阈值d，该阈值根据以下方法确定：取同批次样本中cd8阳性t细胞浸润密度的中位数作为分界值，或采用受试者工作特征曲线（roc曲线）分析确定最优区分阈值；若切片中细胞群a与细胞群b之间的平均最近邻距离小于或等于阈值t，且该区域周边cd8阳性t细胞的浸润密度低于阈值d，则判定该区域存在高风险免疫排斥生态位；进一步计算整张切片中高风险生态位所占的密度；最后根据高风险生态位密度对患者进行预后分层，具体分层标准为：高风险生态位密度大于5的患者判定为高复发风险组，高风险生态位密度为2～5的患者判定为中等风险组，高风险生态位密度小于2的患者判定为低风险组。

15、进一步地，在上述步骤三的一些优选实施方式中，对于cd8阳性t细胞浸润密度的计算，采用多尺度分析方法，分别计算肿瘤核心区域、肿瘤浸润前沿和肿瘤间质区域的cd8阳性t细胞浸润密度，以获取更精细的空间分布信息。

16、进一步地，将高风险生态位的判定与临床病理参数（如tnm分期、分化程度、淋巴血管侵犯等）相结合，构建多因素预后评估模型，进一步提高预后判断的准确性。

17、本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

18、1、在标志物组合方面，本发明提出了将pan-ck、vimentin、cd68、apoe和cd8这五种特定蛋白标志物组合用于同一张结直肠癌切片的预后检测。该标志物组合的设计基于以下科学发现：pan-ck作为广谱上皮标记物，能够识别绝大多数肿瘤细胞；vimentin作为间质标记物，在经历上皮间质转化（emt）的肿瘤细胞中高表达；处于杂交emt状态（即同时表达上皮标记物和间质标记物）的肿瘤细胞具有更高的侵袭性和转移能力，是导致患者预后不良的关键细胞亚群；apoe在肿瘤相关巨噬细胞的一个特定亚群中高表达，该亚群具有显著的免疫抑制功能，能够有效排斥cd8阳性t细胞的浸润；cd8阳性t细胞是机体抗肿瘤免疫的主要效应细胞，其浸润程度与患者预后密切相关。通过同时检测这五种标志物并分析其空间关系，能够全面反映肿瘤微环境中的关键预后因素，为精准预后评估提供信息丰富的技术平台。

19、2、在细胞表型定义方面，本发明提出了在常规形态学无法分辨的情况下，利用pan-ck与vimentin细胞内同位共表达来界定高侵袭性杂交emt细胞的定量标准。传统病理诊断主要依赖形态学特征进行肿瘤细胞鉴定，难以区分处于不同emt状态的肿瘤细胞亚群；免疫组化方法虽然能够检测单一标志物的表达，但无法在同一细胞内同时检测两种标志物的共表达情况；本发明采用多重免疫荧光技术，在单细胞分辨率下同时检测pan-ck和vimentin两种标志物的表达，通过设定双阳性阈值精确识别同时表达这两种标志物的细胞，将其定义为杂交emt肿瘤细胞，为预后评估提供了更具特异性的细胞群体。

20、3、在空间量化模型方面，本发明建立了基于细胞群a与细胞群b之间最近邻距离（nnd）小于特定阈值的空间拓扑学定量模型，突破了传统仅依赖细胞密度的评估方法。传统方法计算的是大面积区域内的平均细胞密度或密度比值，这种静态统计方法完全割裂了肿瘤微环境中不同细胞类型之间的空间相互作用关系；本发明采用的最近邻距离算法能够精确捕捉任意两个特定细胞之间的物理距离，特别适用于识别处于物理接触或近距离互作状态的细胞对；设定距离阈值为50μm（优选范围20至100μm）能够有效识别存在直接接触或旁分泌关系的细胞对，该距离范围涵盖了细胞间直接接触（约10至20μm）和常见细胞因子扩散距离（约50至100μm）；通过结合cd8阳性t细胞浸润密度的判定条件，进一步区分存在免疫排斥的高风险区域和免疫活跃的低风险区域。

21、4、在临床应用可行性方面，本发明依托现有的多重免疫荧光病理扫描平台即可完成检测，所需组织样本为常规福尔马林固定石蜡包埋组织切片，检测试剂盒中的各组分均为市售常规试剂或可通过常规方法制备，试剂成本显著低于空间转录组测序方法，便于在常规医院病理科进行规模化推广。

22、5、在具体参数优化方面，本发明提供的优选参数范围经过大量实验验证：在抗体浓度方面，各一抗的工作浓度设定为2～10ng/ml范围能够确保信号强度与特异性之间的最佳平衡；在荧光染料波长选择方面，采用470～680纳米的长波长组合能够有效减少组织自发荧光的干扰；在空间距离阈值方面，20～100μm的阈值范围能够涵盖不同生物学意义的细胞互作距离，50μm作为默认值适用于大多数临床样本的常规分析；在细胞密度阈值方面，cd8阳性t细胞浸润密度的阈值采用样本中位数或roc曲线优化方法确定，能够实现最佳的风险分层效果。

23、6、在算法实现方面，本发明采用的细胞分割算法可采用基于深度学习的u-net架构卷积神经网络模型，该模型在细胞核分割任务中具有较高的准确率；空间最近邻距离计算采用基于kd树的空间索引算法，能够高效处理大规模细胞数据的距离计算；高风险生态位的判定采用多条件组合逻辑，能够有效排除假阳性结果，提高预后分层的准确性。

24、综上所述，本发明提供的检测试剂盒及量化评估方法，通过特定的五标志物组合和精确的空间距离算法，实现了对结直肠癌患者预后及局部免疫排斥状态的精准预测，解决了现有技术中成本高昂、标志物缺乏特异性以及缺乏精确空间量化模型等技术问题，具备显著的技术创新性和临床应用价值。