一种大别班达病毒IgG抗体检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种利用生物素和链霉亲和素结合的方法，检测大别班达病毒感染后人的血清、血浆样本中大别班达病毒igg抗体的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、大别班达病毒，也曾称发热伴血小板减少综合征病毒、新布尼亚病毒，是引起发热伴血小板减少综合征的主要病原体，主要通过蜱虫叮咬传播，也可通过接触患者或感染动物的血液、分泌物等传播。感染大别班达病毒后主要以发热、血小板及白细胞减少为主要特征，常伴头痛、肌肉酸痛、恶心、呕吐、腹泻等症状的一种急性传染病。

2、蜱虫一生中要多次更换宿主，多次吸食不同动物的血液，可造成大别班达病毒的蔓延和传染源的扩散。人感染大别班达病毒后会产生大别班达病毒核蛋白特异性igg抗体，病人体内检测的igg有助于评估恢复期状态；普通隐性感染人群体内检测到特异性igg抗体，可用于评估既往感染的情况，检测普通人群体内igg抗体阳性率和分布特征，可用于评估当地人群发热伴血小板减少综合征发生的风险，为发热伴血小板减少综合征科学防控提供针对性依据。

3、近年来发热伴血小板减少综合征原有疫区发病率明显升高，且不断出现新疫区，疫区内以农村青壮年人群、山林作业人群和山林旅居人群为主。大别班达病毒不仅对人身体健康和生命安全造成危害，还会对社会经济发展造成严重影响，已成为重要公共卫生问题。因此，开展发热伴血小板减少综合征大别班达病毒的流行病学和病原检测尤为重要。方便及时了解人群既往感染情况，检测疫情动态和流行规律，对发热伴血小板减少综合征的预防和控制工作至关重要。

4、目前用于大别班达病毒感染检测和监测的主要方法有病毒核酸检测技术、胶体金侧向流层析、免疫荧光法、化学发光法和酶联免疫吸附法。

5、病毒核酸检测灵敏度和特异度均较高，但核酸检测技术操作步骤复杂、对样本采集要求较高、需在生物安全实验室内操作、需专业技术人员操作和荧光定量扩增仪器设备检测。

6、胶体金侧向流层析操作简单，但灵敏度较低。免疫荧光技术操作步骤复杂、需要配备荧光显微镜。

7、化学发光法检测灵敏度高，但检测步骤复杂、试剂成本较高、需配备相应化学发光分析设备等。

8、酶联免疫吸附法因其操作简便、成本较低、技术成熟稳定、可批量检测、结果客观等优势，在抗体检测中得到广泛应用；目前市场应用的大别班达病毒igg抗体检测酶联免疫试剂盒采用直接包被大别班达抗原进行igg抗体检测，其包被抗原成分复杂且以非特异形式与酶标板结合，检测灵敏度和特异度受限，存在假阳性和漏检情况。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的目的在于提出一种大别班达病毒igg抗体检测试剂盒，主要是利用生物素与链霉亲和素结合系统的高度亲和力、高灵敏度、高特异性的结合特征，结合间接酶联免疫吸附法原理，以链霉亲和素为酶标板包被蛋白去特异性捕获和结合生物素标记重组大别班达病毒核蛋白，检测大别班达病毒igg抗体，具有高灵敏度、特异性，检测准确性强、重复性和稳定性好，且操作便捷、成本低的优点。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种大别班达病毒igg抗体检测试剂盒，包括酶标板、酶标结合物、样本稀释液、阴性对照、阳性对照、显色液a、显色液b、终止液和浓缩洗涤液，所述酶标板为包被链霉亲和素结合生物素标记重组大别班达病毒核蛋白的酶标板；

3、所述酶标结合物为采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记到山羊抗人igg，所述辣根过氧化物酶标记抗人igg的工作浓度为0.05µg/ml。

4、进一步的：所述生物素标记重组大别班达病毒核蛋白采用基因工程技术、重组蛋白表达纯化技术和生物素标记技术制备，制备方法如下：

5、以大别班达病毒s基因开放读码框rna序列为模板，设计带avi标签和his标签的重组大别班达病毒核蛋白表达质粒，经密码子优化后合成带avi标签和his标签的重组大别班达病毒核蛋白编码区dna序列，再与线性pet-28（+）载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α中，大肠杆菌细胞dh5α摇床培养增殖后收集菌体细胞，提取质粒pet-28（+）/avitag-连接肽-dbv np-his tag；

6、质粒测序鉴定：鉴定正确后，将pet-28（+）/avi tag-连接肽-dbv np-his tag质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21（de3）中，摇床培养，iptg诱导含重组质粒的大肠杆菌细胞bl21（de3）进行蛋白表达，收集菌体细胞，超声破碎菌体细胞释放重组蛋白，离心收集上清液，用镍柱亲和层析纯化带his标签的重组大别班达病毒核蛋白，镍柱亲和层析纯化产物经除盐柱更换蛋白缓冲液，再经阴离子交换层析和凝胶过滤层析进一步纯化重组大别班达病毒核蛋白，经sds-page电泳鉴定纯化的重组大别班达病毒核蛋白，最终获得所述重组大别班达病毒核蛋白。

7、进一步的：带avi标签和his标签的重组大别班达病毒核蛋白dna序列为723bp，包含240个氨基酸；重组大别班达病毒核蛋白基因序列为seq id no.1，氨基酸序列为seq idno.2，通过生物素连接酶将生物素分子与重组大别班达病毒核蛋白的avi标签进行连接，获得生物素标记重组大别班达病毒核蛋白。

8、进一步的：所述酶标板包被链霉亲和素结合生物素标记重组大别班达病毒核蛋白的制备方法为：

9、（1）链霉亲和素包被：采用ph9.6的碳酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释至工作浓度为1µg/ml，按照100µl/孔的剂量加入酶标板条孔中，酶标板放置于4~8℃吸附24小时；

10、（2）封闭：弃掉包被液，取封闭液按照200µl/孔的剂量加入到酶标板孔中，在4~8℃封闭24h；

11、（3）生物素标记重组大别班达病毒核蛋白结合：用含0.1% tween-20、ph7.2的磷酸盐缓冲液将生物素标记重组大别班达病毒核蛋白稀释至工作浓度为5µg/ml，按照100µl/孔的剂量加入酶标板条孔中，酶标板放置于37℃结合2小时；

12、（4）干燥密封保存：弃去酶标板孔中溶液，用结合洗涤液洗涤酶标板1次，在37℃干燥箱内静置8h，取出酶标板装入铝箔袋，迅速密封保存。

13、进一步的：所述包被液为含5% 海藻糖的碳酸盐缓冲液；

14、所述封闭液为含10%胎牛血清和5%海藻糖、0.1% tween-20的磷酸盐缓冲液ph7.2；

15、所述结合洗涤液为含0.1% tween-20的磷酸盐缓冲液ph7.2。

16、一种大别班达病毒igg抗体检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：

17、s1.加样：取包被链霉亲和素结合生物素标记重组大别班达病毒核蛋白的酶标板，分别在酶标板上标记待检样品孔、阴性对照、阳性对照、空白对照，酶标板每孔加入样本稀释液100µl，空白对照孔除外，分别在酶标板的待检样品孔加入5µl待测样本血清或血浆，在酶标板条的阴性对照和阳性对照孔中加入阴性对照5µl、阳性对照5µl，粘贴封板膜后，轻轻震荡混匀，置于37℃孵育30~60分钟；

18、s2.加入酶标结合物：弃去酶标板孔中的溶液，使用洗涤液洗涤酶标板6次，拍干，每孔加入酶标结合物100µl，粘贴封板膜后，置于37℃孵育30~60分钟；

19、s3.显色：弃去酶标板孔中溶液，用洗涤液洗涤酶标板6次，拍干，每孔分别加入显色液a和显色液b各50µl，置于37℃ 孵育10分钟，每孔加入终止液50µl；

20、s4.吸光度测定：采用单波长450nm检测时，在酶标仪上读取450nm处吸光度值，并用空白对照吸光度值调零后计算各孔吸光度值；

21、采用双波长450nm/600~650nm检测时，在酶标仪上分别设定检测波长为450nm，参考波长为600~650nm，分别读取检测波长450nm和参考波长600~650nm的吸光度值，并用检测波长450nm吸光度值减去参考波长600~650nm吸光度值计算各孔吸光度值；

22、s5.临界值计算：

23、临界值=0.10+阴性对照孔吸光度值的平均值

24、当阴性对照吸光度值的平均值小于0.05时，按0.05计算；

25、s6.结果判定：根据步骤5测定和计算的吸光度值结果验证测试的有效性，当酶标板阴性对照吸光度值均＜0.15，且酶标板阳性对照吸光度值均＞0.6时，测试有效：

26、当酶标板待检样品孔吸光度值≥临界值，判为大别班达病毒igg阳性，

27、当酶标板待检样品孔吸光度值＜临界值，判为大别班达病毒igg阴性。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

29、本发明一种大别班达病毒igg抗体检测试剂盒，主要是利用生物素与链霉亲和素结合系统将重组大别班达病毒核蛋白特异性捕获结合于酶标板固相载体上，以间接酶联免疫吸附法原理实现大别班达igg抗体的检测。生物素与链霉亲和素结合具有高亲和力、高灵敏度和高特异性，预先包被在酶标板孔的链霉亲和素可特异性捕获和结合生物素标记的重组大别班达病毒核蛋白，提高酶标板对重组大别班达病毒核蛋白的吸附结合专一性，进一步提高大别班达igg抗体检测的灵敏度和特异度。本发明所用的大别班达病毒核蛋白为原核表达重组蛋白，经过镍柱亲和层析初步纯化、阴离子交换层析精细纯化和凝胶过滤层析除盐除杂纯化步骤，蛋白抗原纯度高、表达效率高、获取成本较低、制备工艺简单，可作为规模化制备检测原料；同时本试剂盒检测准确性强、重复性和稳定性好、操作便捷、成本低。