一种用于儿童青少年抑郁症代谢标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用

本发明属于儿童青少年抑郁症体外诊断，具体涉及一种用于儿童青少年抑郁症代谢标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、抑郁症是儿童青少年时期最常见的精神障碍之一。《2025年世界精神卫生报告》显示，全球超过3.5亿人罹患抑郁症，且发病群体呈年轻化趋势，截至2025年不完全统计估算中国抑郁症患者已突破1亿。尤其值得关注的是，儿童青少年抑郁症患病率持续攀升，然而该群体的就诊率不足20%，大量患者在确诊时已处于中重度阶段，错失了早期干预的最佳时机。抑郁症不仅严重影响患者的学业表现、社交功能与身心发育，还给家庭带来沉重的照护负担，对社会医疗资源和劳动力造成巨大损失，已成为亟待解决的重大公共卫生问题。

2、目前，临床诊断主要依据dsm-5或icd-11中的症状学标准，依赖临床医生访谈评估和患者主观报告，缺乏客观的生物标志物辅助诊断手段。这种依赖主观判断的诊断模式，加之儿童青少年表达能力和就诊意识不足，导致大量潜在患者未被及时发现，进一步加剧了抑郁症低就诊率、高漏诊率的困境。因此，开发适用于儿童青少年人群的客观、简便、可大规模应用的抑郁症筛查工具具有重要的临床意义和社会价值。

3、近年来，研究者开始探索抑郁症的生物标志物，主要包括神经活性物质（如色氨酸、5-羟色胺、多巴胺）、下丘脑-垂体-肾上腺轴相关指标（如皮质醇）、炎症因子（如il-6、tnf-α）、氨基酸及衍生物（如环磷酸腺苷、脯氨酸、甜菜碱、丙氨酸等）以及能量代谢组学标志物（如琥珀酸、羟基丁酸）等。现有检测方法主要包括酶联免疫吸附测定（elisa）和高效液相色谱（hplc），其中elisa法一次仅能检测单一指标且存在交叉反应风险，hplc法灵敏度有限难以满足低丰度代谢物的准确定量需求。

4、然而，现有抑郁症诊断相关的代谢标志物专利中，仍存在以下技术缺陷：

5、一是检测指标数量普遍较多，高达10-31种(如专利cn120427887a、cn120446459a和cn119804732a)，导致试剂盒成本高、检测时间长、数据分析复杂，且多指标间的多重共线性问题影响诊断模型稳定性；

6、二是大部分技术针对成人人群构建（如专利cn119224186a、cn120158531a、cn119804732a、cn120009439a和cn120992968a），其参考范围和诊断模型不适用于代谢特征存在显著差异的儿童青少年人群；

7、三是多数专利仅提供代谢物浓度检测数值，未建立多指标联合诊断模型，临床医生仍需自行判读，缺乏直观的辅助诊断工具（如专利cn119224186a、cn120118990a、cn120992968a）；

8、四是内参系统设计简单，多采用单一混合内标，难以针对不同理化性质的待测物实现精准校正（如专利cn119224186a）；

9、五是现有其他技术多聚焦于蛋白质标志物、肠道菌群标志物（如专利cn117723759b、cn120174123a、cn120118990a、cn120608140a、cn120652107a等），小分子代谢物标志物的研究尚属空白。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中缺乏专用于儿童青少年抑郁症代谢标志物检测的简便、高效、精准定量试剂盒的技术问题，本技术发明人在前期研究中已确定了环磷酸腺苷、葡萄糖醛酸和十一烯酰基肉碱三种代谢标志物（参见已授权专利cn119252459a）。在后续研究中，发明人进一步发现并鉴定了十一烷酰基肉碱（c11），并证实其具有独立于c11:1的增量诊断价值（详见实施例1）。同时，基于前期年龄分组差异分析结果（详见实施例6），将年龄作为协变量纳入诊断模型。由此，本发明提供了一种用于检测camp、glua、c11:1和c11四种代谢标志物的试剂盒及其制备方法和应用。

2、需要特别说明的是，虽然有研究报道了十一烷酰基肉碱（c11）在成人首次确诊未用药抑郁症患者中的诊断潜力（liu et al., behavioural brain research, 2026, 497:115864），该研究显示c11联合其他酰基肉碱在成人群体中的auc为0.831。然而，儿童青少年群体与成人群体在代谢特征上存在本质差异—儿童青少年处于生长发育的关键时期，其代谢水平随年龄呈动态变化，能量代谢、脂肪酸β-氧化通量及肉碱代谢池的稳态调控机制均与成人显著不同，成人研究中所建立的生物标志物参考范围和诊断模型无法直接应用于儿童青少年人群。本技术发明人通过前期研究发现，camp、glua和c11:1等代谢物浓度在不同年龄组间存在极显著差异（p<0.001），且14岁后浓度进入快速攀升阶段。因此，在构建诊断模型时，必须将年龄作为重要的协变量予以纳入，以消除不同发育阶段对代谢物浓度的混杂影响，从而建立真正适用于儿童青少年人群的精准诊断工具，本发明在儿童青少年人群中的发现具有完全不同的技术内涵和临床意义：

3、（1）人群差异：成人研究中的c11诊断价值是基于成人代谢稳态建立的，而儿童青少年处于代谢快速发育阶段，其c11的基线水平、波动范围及与抑郁症的关联强度均与成人存在显著差异（详见本发明实施例6的年龄分组差异分析）；

4、（2）模型构建策略差异：成人研究未考虑年龄这一关键协变量，而本发明首次将年龄分组（≤14岁 vs >14岁） 作为独立协变量纳入逻辑回归模型，有效消除了不同发育阶段对c11等代谢物浓度的混杂影响，使模型在儿童青少年不同年龄亚组中均具有稳定的诊断效能；

5、（3）诊断效能差异：成人研究中c11联合模型的auc为0.831，而本发明四指标联合模型（含年龄协变量）在儿童青少年人群中的auc可达0.921，提升幅度达10.8%，充分说明针对儿童青少年人群优化后的模型具有显著的诊断优势。

6、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

7、第一方面，本发明提供一种用于儿童青少年抑郁症代谢标志物检测试剂盒，所述试剂盒用于检测的代谢标志物由环磷酸腺苷（camp）、葡萄糖醛酸（glua）、十一烷酰基肉碱（c11）和十一烯酰基肉碱（c11:1）组成。

8、所述试剂盒还包括：

9、（1）混合标准品溶液：包括系列浓度梯度的环磷酸腺苷（camp）、葡萄糖醛酸（glua）、十一烷酰基肉碱（c11）和十一烯酰基肉碱（c11:1）；

10、进一步地，所述混合标准品溶液中，环磷酸腺苷的浓度范围为0~78.125ng/ml，葡萄糖醛酸的浓度范围为0~195.3125ng/ml，十一烷酰基肉碱的浓度范围为0~78.125ng/ml，十一烯酰基肉碱的浓度范围为0~3.90625ng/ml。

11、（2）质控品溶液：包括低、中、高三个浓度水平的环磷酸腺苷（camp）、葡萄糖醛酸（glua）、十一烷酰基肉碱（c11）和十一烯酰基肉碱（c11:1）；

12、进一步地，所述质控品溶液中，低浓度质控品含环磷酸腺苷5.0ng/ml、葡萄糖醛酸12.0ng/ml、十一烯酰基肉碱0.25ng/ml，十一烷酰基肉碱5.0ng/ml。中浓度质控品含环磷酸腺苷20ng/ml、葡萄糖醛酸50.0ng/ml、十一烯酰基肉碱1.0ng/ml，十一烷酰基肉碱20ng/ml。高浓度质控品含环磷酸腺苷60ng/ml、葡萄糖醛酸150ng/ml、十一烯酰基肉碱3.0ng/ml，十一烷酰基肉碱60ng/ml。

13、（3）萃取液：包含稳定同位素内标的甲醇溶液，所述稳定同位素内标由环磷酸腺苷稳定同位素内标（is_camp）、葡萄糖醛酸稳定同位素内标（is_glua）和月桂酰肉碱稳定同位素内标（is_c12）组成；

14、进一步地，所述萃取液中，is_camp的浓度为0.5~5ug/ml，is_glua的浓度为10~50ug/ml，is_c12的浓度为5~20ug/ml；优选地，is_camp的浓度为2.5ug/ml，is_glua的浓度为20ug/ml，is_c12的浓度为10ug/ml。

15、第二方面，本发明提供一种用于儿童青少年抑郁症代谢标志物检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：试剂盒按照以下方法制备：

16、（1）配制系列浓度梯度的混合标准品溶液：将环磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、十一烯酰基肉碱和十一烷酰基肉碱标准品用甲醇溶解并稀释，加入内标准品is_camp、is_glua和is_c12，制备6个浓度水平的混合标准品溶液；

17、（2）配制低、中、高三个浓度水平的混合质控品溶液：以空白血浆为基质，添加环磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、十一烯酰基肉碱和十一烷酰基肉碱标准品和内标准品is_camp、is_glua和is_c12，制备质控品溶液；

18、（3）制备萃取液：将内标准品is_camp、is_glua和is_c12溶于甲醇中，配制成含内标的萃取液，所述萃取液中is_camp的浓度为0.5～5 μg/ml、is_glua的浓度为10～50 μg/ml、is_c12的浓度为5～20 μg/ml；

19、（4）将上述标准品溶液、质控品溶液和萃取液组装为试剂盒。

20、第三方面，本发明提供一种用于儿童青少年抑郁症代谢标志物的检测系统，包括样本前处理单元、数据采集模块和数据分析模块，所述数据采集模块包括上述试剂盒和液相色谱-串联质谱单元；样本前处理单元用于执行所述样本前处理步骤，以获得上机待测液；液相色谱-串联质谱单元用于执行液相色谱-串联质谱检测步骤，得到检测数据，检测数据用于数据分析模块进行分析。

21、进一步的，样本前处理方法包括：按照常规静脉采血方法采集全血后，轻轻颠倒混匀抗凝管，避免溶血，并尽快进行血浆分离：将抗凝全血对称放入离心机配平，以1500~2000×g离心10~15分钟（温度20~25℃），离心后小心吸取上层血浆，避免触及白膜层及红细胞层，转移至无菌带盖样本管中。分离后的血浆若可立即检测，置于室温备用；若不能立即检测，应于-20℃或-80℃冷冻保存，避免反复冻融。

22、样本前处理单元：冷冻保存的血浆需提前取出于4℃解冻，充分混匀后备用；在1.5ml离心管中先加入25~100µl血浆样本，再加入100~400µl萃取液（含内标的甲醇溶液），剧烈振荡0.5~2min分钟充分混匀，置于-10~-30℃静置0.5~2小时进行萃取，期间每25~35min取出剧烈振荡1次；萃取结束后于4℃下以15000 rpm~17000rpm离心15~20min分钟，小心吸取100~120 µl上清液至装有内插管的进样瓶中，避免吸到沉淀，盖上瓶盖，立即上机检测或于4℃暂存。

23、进一步的，液相色谱-串联质谱单元包括流动相a为含0.1–0.5%氨水和0.1–0.5%3–7m乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈-水；梯度洗脱程序：0–1.0 min，b相由0%线性升至100%；1.0–4.5 min，b相由100%线性降至50%；4.5–6.5 min，保持50% b；6.5–6.7 min，b相由50%线性升至100%；6.7–11.5 min，保持100% b；柱温20–40℃，流速0.1–0.5 ml/min，进样量0.5–1.5 µl。

24、进一步的，所述数据分析模块包括二元逻辑回归模型，其表达式为p=exp(x）/（1+exp(x））；其中，x=c+a∗ccamp+b∗cglua+c∗cc11:1+d∗cc11+e*agegroup；ccamp、cglua、cc11:1、cc11分别为数据采集模块采集的环磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、十一烯酰基肉碱和十一烷酰基肉碱的浓度；agegroup为年龄分组，以14岁为分界点，当年龄≤14岁时取e值为1，当年龄>14岁时e值为2；c为常数项，a、b、c、d分别为环磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、十一烯酰基肉碱和十一烷酰基肉碱的系数项，所述常数项c及系数项a、b、c、d通过训练集建立模型得到。

25、与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

26、1、本发明提供了一种专用于儿童青少年抑郁症代谢标志物检测的试剂盒，试剂盒用于检测的代谢标志物由环磷酸腺苷、葡萄糖醛酸、十一烯酰基肉碱和十一烷酰基肉碱组成，标志物精简至4种，显著降低检测成本和分析复杂度，适配儿童青少年人群的大规模筛查场景。

27、2、本发明的试剂盒采用三种独立稳定同位素内标（is_camp、is_glua和is_c12）分别校正各待测物，经实验验证加标回收率为95.0%～100.5%，rsd ≤ 7.6%，实现了各代谢物的精准定量，显著优于现有技术中单一混合内标的校正策略。

28、3、本发明提供了一种专用于本试剂盒的一步萃取前处理方法。与传统方法（如cn119224186a等）中常见的多步衍生化、固相萃取或单独配制内标后分步添加的前处理方法（需8-10个步骤）相比，本方法将三种稳定同位素内标直接预溶于甲醇萃取液中，仅需加入血浆、振荡、低温沉淀、离心3个核心步骤即可完成，无需额外衍生化或复溶步骤，显著简化操作、缩短时间（全程仅需约1.5小时），降低了人为误差。实验证明（见实施例4），该方法配合本试剂盒，加标回收率可达95.0%～100.5%，rsd ≤ 7.6%，在极大地提升检测通量的同时，保证了卓越的准确度和精密度。

29、4. 本发明配套lc-ms/ms技术，采用beh amide hilic色谱柱和高乙腈梯度的特定流动相体系（流动相a为含0.1%～0.5%氨水和0.1%～0.5% 3～7m乙酸铵的水溶液），恒定添加的氨水和乙酸铵稳定了ph环境，改善了峰形与离子化效率；结合正负离子切换mrm模式，可在一针运行中实现四种目标物及其内标的基线分离，兼具高选择性与高通量。

30、5. 本发明将四种标志物的检测浓度代入预先构建的二元逻辑回归模型p=exp(x)/(1+exp(x))，可自动输出抑郁症风险概率值p，为临床提供客观、量化的辅助诊断依据。

31、6. 本发明通过对比实验证实，在camp、glua和c11:1三指标基础上增加c11作为第四指标后，联合诊断模型的auc由0.813显著提升至0.897（δauc=+0.084），约登指数由0.494显著提升至0.653（δ=+0.159）；进一步将年龄分组（≤14岁 vs >14岁）作为协变量纳入模型后，四指标模型auc由0.897进一步提升至0.921（δ=+0.024），约登指数由0.653提升至0.711（δ=+0.058）。综合来看，本发明的四指标联合模型（含年龄协变量）较三指标基线模型auc提升达0.108（0.813→0.921），约登指数提升达0.217（0.494→0.711），提升幅度分别达13.3%和43.9%。年龄协变量的纳入有效消除了不同发育阶段对代谢物浓度的混杂影响，使模型在不同年龄亚组中具有更广泛的适用性。

32、7. 与现有成人抑郁症代谢标志物研究相比，本发明首次实现了c11在儿童青少年抑郁症中的精准检测与应用。通过大样本（n=934）临床验证，本发明证实c11在儿童青少年人群中的诊断贡献度（ wald χ²=18.762，p<0.001）及其与年龄分组的交互效应具有统计学显著性，表明c11在儿童青少年中的诊断价值不能简单地由成人研究结果直接应用于儿童青少年群体。本发明填补了儿童青少年抑郁症代谢标志物检测领域的技术空白。

33、8、综上，本发明从试剂盒组成、内标校正策略、样本前处理、lc-ms/ms检测到数据分析构建了完整的全流程解决方案，实现了儿童青少年抑郁症代谢标志物的快速、精准、高通量检测，特别适用于儿童青少年大规模临床筛查场景。

34、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段，可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述内容和其目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。