一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学检测，具体涉及一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，是一种利用重组蛋白a对抗体fc片段的特异性亲和实现抗体定向固定、用于血液样本中p-tau217高灵敏检测的磁微粒化学发光试剂盒。

背景技术：

1、阿尔兹海默症是一种起病隐匿、进行性发展的神经退行性疾病，已成为全球公共卫生领域的重大挑战。据统计，全球ad患者数量逐年上升，预计到2050年将超过1.5亿。目前ad的早期诊断仍缺乏高灵敏度、高特异性的血液检测手段，影像学和脑脊液检测因成本高、有创性而难以大规模推广。

2、研究发现，血浆中的磷酸化tau（p-tau）蛋白，特别是p-tau217，在ad早期即显著升高，且与脑内淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结高度相关，被认为是极具潜力的ad血液生物标志物。然而，p-tau217在血液中的浓度极低，通常处于皮克甚至飞克每毫升的水平，属于痕量靶标。传统检测方法如elisa灵敏度不足，难以准确检出；而常规的化学发光免疫分析法虽灵敏度优于elisa，但仍面临抗体非定向固定导致的活性位点遮蔽、空间位阻大、信号响应弱等局限，无法充分满足对亚皮克级p-tau217的可靠检测需求。

3、现有磁微粒化学发光试剂盒通常采用物理吸附或化学共价偶联的方式将捕获抗体随机固定在磁珠表面，这种随机固定方式易造成抗体fc段朝向溶液而fab段被遮蔽或构象改变，降低抗原结合效率。因此，亟需开发一种能够实现抗体定向固定、提升抗原捕获能力和信号放大效率的新型检测试剂盒，以实现对血液样本中痕量p-tau217的高灵敏、高特异检测。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，旨在解决现有p-tau217检测方法灵敏度低、抗体在磁珠表面随机固定导致活性位点遮蔽及抗原捕获效率差、无法满足血液中痕量p-tau217准确检测的技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，由试剂a、试剂b和试剂c三部分组成，所述试剂a为内含有重组蛋白a包被的磁微粒工作液；所述试剂b含有重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体工作液；所述试剂c为抗p-tau217捕获抗体工作液。

3、作为上述技术方案的进一步改进：

4、所述试剂a组分是10～100mmol/l的pbs，0.1～1g/l的表面活性剂，1ml的重组蛋白a磁珠，0.1～1g/l的蛋白稳定剂，0.1～1g/l的防腐剂。

5、所述试剂b组分是10～100mmol/l的pbs，0.1～1g/l的表面活性剂，1ml的重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体，0.1～1g/l的蛋白稳定剂，0.1～1g/l的防腐剂。

6、所述试剂c组分是10～100mmol/l的pbs，0.1～1g/l的表面活性剂，0.05～0.8mg/l的抗p-tau217捕获抗体，0.1～1g/l的蛋白稳定剂，0.1～1g/l的防腐剂。

7、所述表面活性剂为曲拉通、吐温中的一种或其组合而成。

8、所述蛋白稳定剂为ce210、ce510、db1130、pa1080、酪蛋白、bsa中的一种或其组合而成。

9、所述防腐剂为pc300。

10、所述重组蛋白a磁珠按如下方法制备：

11、（1）取100μl浓度为1～5mg/ml的羧基化磁珠，加入900μl浓度为50mmol/l的pbs混匀；

12、（2）加入0.1mol/l的edc/nhs混合液于室温下震荡10min；

13、（3）加入1ml浓度为0.1～10mg/ml的重组蛋白a溶液，在室温下反应2h，获得重组蛋白a磁珠。

14、所述重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体，按如下方法制备：

15、（1）取500μl浓度为1～5mg/ml的重组蛋白a，分散重组蛋白a的缓冲液为浓度为50mmol/l的cbs ph9.0；与500μl浓度为1～2mg/ml的吖啶酯混合后，在室温摇床上混匀30min，并加入300µl 10%赖氨酸溶液终止液孵育，获得吖啶酯标记的重组蛋白a复合物；

16、（2）取500μl浓度为0.01～0.1mg/ml的抗p-tau217检测抗体和500μl上述吖啶酯标记的重组蛋白a复合物混合，并在室温下孵育30min，获得重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体。

17、一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，应用于血液样本中p-tau217检测，检测低至0.01pg/ml。

18、采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：实现抗体定向固定，抗体固化后的剩余活性提高，抗原捕获效率显著提升：本发明利用重组蛋白a对抗体fc片段的高特异性亲和力，实现了抗p-tau217捕获抗体在磁珠表面的定向固定，避免了传统随机固定方式导致的fab活性位点遮蔽或构象改变，最大限度地保留了抗体的抗原结合能力，显著提高了对痕量p-tau217的捕获效率。

19、下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

1.一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：由试剂a、试剂b和试剂c三部分组成，所述试剂a为内含有重组蛋白a包被的磁微粒工作液；所述试剂b含有重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体工作液；所述试剂c为抗p-tau217捕获抗体工作液。

2.根据权利要求1所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂a组分是10～100mmol/l的pbs，0.1～1g/l的表面活性剂，1ml的重组蛋白a磁珠，0.1～1g/l的蛋白稳定剂，0.1～1g/l的防腐剂。

3.根据权利要求1所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂b组分是10～100mmol/l的pbs，0.1～1g/l的表面活性剂，1ml的重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体，0.1～1g/l的蛋白稳定剂，0.1～1g/l的防腐剂。

4.根据权利要求1所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂c组分是10～100mmol/l的pbs，0.1～1g/l的表面活性剂，0.05～0.8mg/l的抗p-tau217捕获抗体，0.1～1g/l的蛋白稳定剂，0.1～1g/l的防腐剂。

5.根据权利要求2-4其中之一所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为曲拉通、吐温中的一种或其组合而成。

6.根据权利要求2-4其中之一所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述蛋白稳定剂为ce210、ce510、db1130、pa1080、酪蛋白、bsa中的一种或其组合而成。

7.根据权利要求2-4其中之一所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为pc300。

8.根据权利要求2所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白a磁珠按如下方法制备：

9.根据权利要求3所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白a和吖啶酯共同标记的抗p-tau217检测抗体，按如下方法制备：

10.根据权利要求1所述的一种基于抗体定向固定工艺的p-tau217磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：应用于血液样本中p-tau217检测，检测低至0.01pg/ml。