一种双靶点的SICM诊断预后联合检测试剂盒及其制备方法

本发明属于体外诊断试剂盒，具体涉及一种同时检测人心肌肌钙蛋白i（ctni）和b型钠尿肽（bnp）的双靶点联合检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、脓毒性心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，sicm）是脓毒症最严重的并发症之一，以心肌抑制和心室功能障碍为特征。临床研究表明，约30%~50%的脓毒症患者会出现心脏收缩功能下降，其中部分患者进展为不可逆的心肌损伤。sicm患者的28天死亡率高达50%~70%，显著高于无心肌损伤的脓毒症患者。因此，对sicm的早期诊断和预后评估具有重要的临床价值。

2、目前，临床上用于评估心肌损伤和心功能的生物标志物主要包括：

3、心肌肌钙蛋白i（ctni）：是心肌细胞损伤的特异性标志物，在心肌细胞坏死或凋亡时释放入血。ctni具有高度的心肌特异性（仅表达于心肌组织），是诊断心肌损伤的金标准。脓毒性心肌病患者常伴有血清ctni水平升高，且升高程度与心肌损伤严重程度正相关。然而，单一ctni检测无法评估心室功能状态。

4、b型钠尿肽（bnp）及n末端b型钠尿肽前体（nt-probnp）：bnp主要由心室肌细胞分泌，在心室壁张力增加或容量负荷过重时表达上调。bnp是评估心室功能和心力衰竭的重要指标，其水平与sicm患者的心室射血分数（lvef）呈负相关。然而，单一bnp检测无法判断心肌细胞是否发生损伤。

5、现有技术中，ctni和bnp通常作为独立的检测项目，分别使用不同的试剂盒进行检测，存在以下缺陷：

6、（1）分开检测增加样本用量和操作时间：两次独立检测需要双份样本量，操作流程繁琐，无法满足急诊和icu快速检测的需求；

7、（2）无法实现同步联合判读：单独检测ctni和bnp难以反映心肌损伤和心室功能障碍的同步状态，无法满足sicm"损伤+功能"双维度评估的临床需求；

8、（3）现有双标志物联检试剂盒结构复杂：已有的ctni+bnp联合检测试剂盒多为免疫层析定性/半定量卡，灵敏度不足，无法满足icu对精确定量的要求；

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种双靶点的sicm诊断预后联合检测试剂盒及其制备方法，有效解决了现有技术中ctni和bnp单独检测无法满足sicm同步"诊断+预后"联合评估需求，以及现有联检试剂盒存在灵敏度不足、操作复杂、无法同步定量等技术问题。

2、本发明采取的技术方案如下：本发明提出了一种双靶点的sicm诊断预后联合检测试剂盒，包括

3、（1）双抗体夹心体系：第一抗体对（捕获抗体+检测抗体）特异性结合ctni，第二抗体对（捕获抗体+检测抗体）特异性结合bnp，两对抗体对分别识别目标抗原的不同表位，避免相互干扰；

4、（2）磁性微球固相载体：采用羧基修饰的磁性微球（粒径1~3 μm）作为固相载体，通过酰胺键共价偶联捕获抗体，固相载体在磁场下快速分离，实现高通量自动化检测；

5、（3）双靶点同步检测：将两种捕获抗体偶联微球按比例混合后作为固相，将两种酶标检测抗体混合后作为酶标试剂，实现同一反应管中ctni和bnp的同步夹心反应和化学发光信号检测；

6、（4）hrp-鲁米诺化学发光体系：酶标抗体采用hrp标记，底物采用鲁米诺+对碘酚+过氧化氢发光体系，检测信号强度与目标抗原浓度正相关，灵敏度比elisa高10~100倍。

7、进一步地，所述第一捕获抗体和第一检测抗体分别针对ctni的不同表位，所述表位选自ctni氨基酸序列第28~36位、第56~76位和/或第80~110位所在表位；所述第二捕获抗体和第二检测抗体分别针对bnp的不同表位，所述表位选自bnp分子第77~108位环状结构区和/或c端第13~32位区域。

8、进一步地，所述磁性微球的粒径为0.5~5 μm，优选为1~3 μm，磁核为fe3o4或γ-fe2o3，表面修饰为羧基或氨基。

9、进一步地，所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体通过以下方式固定于磁性微球表面：先将两种捕获抗体分别偶联于独立磁性微球，再将两种抗体偶联微球按比例混合；或者，将两种捕获抗体预先混合后再共同偶联于同一批磁性微球表面。

10、进一步地，所述酶标记物为hrp，所述化学发光底物溶液含有鲁米诺、对碘酚和过氧化氢；或所述酶标记物为ap，所述化学发光底物溶液为aps-5或cdp-star。

11、进一步地，所述试剂盒中用于检测时，固相试剂与待测样本的加入体积比为1:1，酶标抗体试剂与固相复合物的体积比为1:1至1:2；且所述固相试剂和酶标抗体试剂在2~8℃保存有效期不少于12个月，在-20℃保存有效期不少于18个月。

12、本发明还提出了一种双靶点的sicm诊断预后联合检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：

13、s1. 取羧基修饰的磁性微球，用mes缓冲液洗涤后，加入edc和nhs活化羧基，制得活化磁性微球悬液；

14、s2. 将第一捕获抗体与活化磁性微球混合，室温反应0.5~2小时，使第一捕获抗体偶联于磁性微球，得第一抗体偶联微球；同样将第二捕获抗体偶联得第二抗体偶联微球；

15、s3. 将第一抗体偶联微球和第二抗体偶联微球按体积比1:0.5~1:2混合，用含bsa和表面活性剂的磷酸盐缓冲液重悬，得混合固相悬液；

16、s4. 将第一检测抗体、第二检测抗体分别与hrp偶联，制得酶标第一检测抗体和酶标第二检测抗体；

17、s5. 将混合固相悬液分装得固相试剂，酶标抗体混合分装得酶标抗体试剂，连同化学发光底物溶液、校准品和质控品密封组装，即得。

18、进一步地，s1中所述mes缓冲液浓度为10~50 mm，ph 5.0~6.5；所述edc和nhs的浓度分别为1~10 mg/ml，活化反应在ph 5.5~6.5条件下进行5~30分钟。

19、进一步地，s2中第一捕获抗体与磁性微球的投料质量比为1:20，第二捕获抗体与磁性微球的投料质量比为1:20，偶联反应在ph 7.0~7.5条件下进行1~1.5小时；步骤三中第一抗体偶联微球和第二抗体偶联微球的混合体积比为1:1。

20、进一步地，s4中hrp与检测抗体的偶联采用改良过碘酸钠氧化法：将hrp溶于去离子水，加入naio4溶液，室温避光搅拌30分钟，终止反应后加入检测抗体，室温反应2小时，加入nabh4还原，制得酶标抗体。

21、本发明提出了一种双靶点的sicm诊断预后联合检测试剂盒及其制备方法及其使用方法，有益效果如下：（1）同步双靶点检测：在同一反应体系中同时检测ctni和bnp，样本用量减少50%，检测时间缩短至90分钟内，满足icu急诊快速检测需求；

22、（2）超高灵敏度：clia化学发光体系的ctni检出限达0.01 ng/ml，比传统elisa（0.1 ng/ml）高10倍；bnp检出限达10 pg/ml，满足icu精确定量要求；

23、（3）双维度临床评估：ctni反映心肌细胞损伤程度，bnp反映心室功能状态，双靶点联合实现sicm"损伤+功能"同步评估，比单一标志物检测具有更高的诊断准确度（预期auc≥0.92）；

24、（4）预后价值提升：联合检测双阳性患者的28天死亡率显著高于单项阳性者，有效指导临床分层管理和治疗决策；

25、（5）制备工艺稳定可靠：采用改良过碘酸钠氧化法进行hrp-抗体偶联，偶联率≥80%，批次间一致性良好，试剂盒有效期≥12个月；