一种重组蛋白、口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种重组蛋白、口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法与应用。


背景技术：

2.口蹄疫(foot-and mouth disease,fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and mouth disease virus,fmdv)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，症状是动物口、鼻、蹄和母畜乳头等部位出现水泡，或水泡破损后形成的溃疡或斑痂，可感染猪、牛、羊等多种主要家畜，造成巨大经济损失，严重威胁全球畜牧业的发展，世界动物卫生组织(oie)也将其列为a类动物疫病名单的首位。
3.fmdv属于小rna病毒科口蹄疫病毒属，包括a、o、c、asia 1和sat1、sat2、sat3等7个没有交叉免疫保护的血清型，型间无交叉保护，型内不同毒株之间的遗传变异可导致抗原差异，其中o型、a型和asia 1型是最主要流行的血清型。fmdv病毒粒子直径约20～30nm，为二十面体，主要包括rna和衣壳两大部分，衣壳主要由vp1、vp2、vp3、vp4四种结构蛋白组成，分别编码1a、1b、1c、1d 4种结构蛋白，4种结构多肽都参与免疫原性。其中，结构蛋白vp1、vp2、vp3是构成病毒衣壳的主要蛋白，也是最主要的抗原蛋白，其大多数的抗原表位(antigenic epitope)都位于fmdv衣壳蛋白上，决定着fmdv对宿主的抗原性及免疫原性。结构蛋白vp1与中和抗体以及病毒的感染有关，是诱导中和抗体的主要成分，也是抗原位点以及抗原变异的关键。
4.我国防治口蹄疫是采用常规灭活疫苗免疫预防，但灭活苗免疫后常出现食欲减退、呕吐、体温升高等不良反应，有的甚至引起死亡，而且存在生物安全隐患问题。所以，研发更为安全、有效、实用的新型疫苗是现在口蹄疫研究的主要热点。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种重组蛋白、口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.编码所述重组蛋白的dps-vp1基因的核苷酸序列。
9.优选的是，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒为pet-11a-dps-vp1重组质粒。
11.本发明还提供一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗，所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗包括权利要求1所述的重组蛋白和其他药学上可接受的免疫佐剂。
12.优选的是，所述免疫佐剂为isa201佐剂。
13.本发明还提供一种所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
14.(1)构建pet-11a-dps-vp1重组质粒；
15.(2)将所述重组质粒导入感受态细胞中，并进行菌落pcr鉴定；
16.(3)将鉴定结果为阳性的菌落扩大培养，诱导所述重组质粒表达；
17.(4)破碎菌体、纯化，得到如权利要求1所述的重组蛋白；
18.(5)向佐剂中缓慢地加入等体积的重组蛋白，涡旋4-8min，置于18-22℃静置40-80min，得到所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗。
19.优选的是，所述感受态细胞为感受态bl21细胞。
20.优选的是，所述菌落pcr鉴定的引物包括如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物。
21.优选的是，所述扩大培养的培养基为含amp的lb液体培养基。
22.优选的是，诱导所述重组质粒表达具体包括在培养基od
600
达到0.5-0.7时，加入终浓度为1mm的iptg，37℃诱导表达6h。
23.本发明还提供了一种所述的重组蛋白或所述口蹄疫病毒样颗粒疫苗在制备治疗和/或预防口蹄疫的药物中的应用。
24.本发明公开了以下技术效果：
25.the dna-binding protein from starved cells(dps)是仅存在于细菌和古细菌中的一个纳米颗粒蛋白，由以2：3堆成排列的12个相同的亚基组成的十二聚体纳米颗粒，直径约9nm，其n端和c端可同时结合dna，在65℃时失去结合dna的功能，但是在其与dna结合状态下，即使在100℃，也不会与dna游离，仍保持着dna结合活性。传统抗原尤其是多表位组合抗原，分子量小，免疫原性差，不利于抗原分子的识别和呈递。因此，本发明通过分析dps蛋白的基因序列，找到对其结构和功能影响最小并在十二聚体结构中处于外表面的区域，插入外源抗原基因序列，表达制备表位融合抗原分子，并通过自组装成十二聚体，在其表面展示抗原分子，形成免疫原性极强的颗粒状抗原，不但增加了抗原分子与抗体的接触面积，也相当于增加了抗原的分子量，从而提高了抗原的免疫原性，有助于激发机体免疫应答。
26.本发明成功构建pet-11a-dps-vp1重组质粒，经大肠杆菌诱导表达，重组蛋白dps-vp1能稳定表达，并自组装为病毒样颗粒(约9nm)，能在室温下存放至少6个月；重组蛋白dps-vp1经乳化制备疫苗，免疫balb/c小鼠(50μg/只)，能有效诱导小鼠产生fmdv特异性抗体。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps的酶切鉴定；其中，1代表dna marker；2、4为重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps双酶切；3、5为重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps；
29.图2为菌落pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps的pcr鉴定；其中，1代表dna marker；2代表ddh2o；3代表bl21(de3)；4代表pet-11a；5-8代表dps-vp1、lane 9-12和dps；
30.图3为重组蛋白dps-vp1、dps上清的sds-page鉴定；其中，1代表蛋白marker；2代表
dps-vp1未诱导；3代表dps-vp1诱导；4代表dps未诱导；5代表dps诱导；
31.图4为重组蛋白dps-vp1、dps的western blot鉴定；其中，1代表蛋白marker；2-3代表重组蛋白dps-vp1和dps；
32.图5为重组蛋白dps-vp1和dps经ni-nta纯化结果；其中，a为重组蛋白dps-vp1与ni-nta结合后的流过液sds-page结果，b为重组蛋白dps-vp1经500mm咪唑洗脱后收集液的sds-page结果，c为重组蛋白dps与ni-nta结合后的流过液sds-page结果，d为重组蛋白dps经400mm咪唑洗脱后收集液的sds-page结果；
33.图6为重组蛋白dps-vp1、dps的透射电镜鉴定；其中，a为重组蛋白dps-vp1；b为重组蛋白dps；
34.图7为小鼠不同脏器切片的he染色结果；
35.图8为小鼠免疫后体重监测结果；
36.图9为小鼠特异性抗体检测水平；
37.图10为重组蛋白dps-vp1和dps的稳定性检测。
具体实施方式
38.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
39.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
40.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
41.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
42.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
43.实施例1
44.1.1基因合成与重组质粒pet-11a-dps-vp1/pet-11a-dps构建
45.根据ncbi收录的猪o型口蹄疫vp1蛋白第129～169位氨基酸以及e.coli dps gene for binding protein(167aa)，将dps氨基酸序列和vp1氨基酸序列串联，得到重组蛋白如seq id no.1所示。
46.seq id no.1：mstaklvkskatnllytrndvsdsekkatvellnrqviqfidls litkqahwnmrganfiavhemldgfrtalidhldtmaeravqlggvalgttqvins ktplksypldihnvqdhlkeladryaivandvrkaigeakdddtadiltaasrdldk flwfiesnievyngnckygespvtnvrgdlqvlaqkaartlptsfnygaik。
47.按照大肠杆菌的偏好性对密码子进行优化，在n端添加6
×
his标签，分别在n、c端添加bamh i和nde i酶切位点，进行基因序列合成并测序。基因序列检测结果如seq id no.2所示。
48.seq id no.2：catatgcaccaccaccaccaccactcaacagctaaactagtaaagagt aaggcgaccaacctgctgtacacccgtaacgatgttagcgacagcgagaagaaagcgaccgtggaactgctgaaccgtcaggttatccaattcattgatctgagcctgatcaccaaacaggcgcactggaacatgcgtggtgcgaacttcattgcggtgcacgagatgctggacggctttcgtaccgcgctgatcgatcacctggacaccatggcggaacgtgcggtgcagctgggtggcgttgcgctgggtaccacccaagtgatcaacagcaagaccccgctgaaaagctacccgctggatattcacaacgttcaagaccacctgaaggagctggcggatcgttatgcgatcgtggcgaacgacgttcgtaaggcgattggcgaagcgaaagacgatgacaccgcggatattctgaccgcggcgagccgtgatctggacaagttcctgtggtttatcgagagcaacattgaagtgtacaacggtaactgcaaatatggcgagagcccggtgaccaacgttcgtggtgacctgcaggttctggcgcaaaaggcggcgcgtaccctgccgaccagctttaactatggcgcgatcaaataatgaggatcc。
49.1.2重组质粒的提取及酶切鉴定
50.将公司合成的含有重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps的top10克隆菌株进行lb固体培养板(含amp)划线，于37℃恒温培养箱中放置12h；挑取单菌落接种至5ml含amp的lb液体培养基中，37℃，220rpm，培养12h；按照plasmid mini kit质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒。使用bamh i和nde i内切酶对重组质粒进行双酶切，h2o和pet-11a( )质粒作对照，反应体系如表：
[0051][0052]
pcr仪中37℃反应2h，酶切后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电压120v，20min，用凝胶成像仪扫描凝胶。
[0053]
1.3重组质粒的转化
[0054]
将5μl重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps分别加入感受态细胞bl21(de3)中，用移液枪轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，立即冰浴2min，沿管壁缓慢加入1ml lb液体培养基，37℃，200rpm，培养1h；在含有amp抗性的lb固体培养板上滴加150μl上述菌液，用无菌玻璃棒轻轻涂布均匀，37℃静置1h后，将平板倒置培养12h。
[0055]
1.4重组菌的pcr鉴定
[0056]
引物采用pet系列载体的通用引物，
[0057]
seq id no.3：t7：5
’‑
taatacgactcactataggg-3’；
[0058]
seq id no.4：t7t：5
’‑
gctagttattgctcagcgg-3’。
[0059]
从上述四个平板中各随机选取6个单菌落，用无菌枪头分别挑取单菌落溶于20μlddh2o中，抽取1μl作为模板，以h2o和pet-11a作对照，上下游引物各0.8μl，2
×
taq pcr mix 10μl，8.4μl ddh2o，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，35个循环；72℃延伸40s；72℃复性7min。
[0060]
pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电压120v，20min，用凝胶成像仪扫描凝胶。
[0061]
1.5重组蛋白dps-vp1、dps的原核表达及鉴定
[0062]
选取pcr鉴定正确的单菌落，分别接种于5ml含amp的lb液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养，作为种子液；将上述种子液按照1：100的比例加入到300ml含amp的lb液体培养基中，37℃，200rpm，直至od
600
达到0.6左右，加入终浓度为1mm的iptg于37℃诱导表达6h；4℃，4000rpm离心30min，弃上清，用无菌pbs溶液重悬细菌沉淀，4℃，4000rpm离心10min，重复三次，最后用30ml pbs重悬菌体；用超声破碎仪破碎菌体，工作功率400w，工作2s，间歇5s，直到菌体清亮，4℃，12000rpm离心20min，收集上清，沉淀用等体积pbs重悬，加入4
×
loading buffer，于恒温金属浴中95℃变性10min，做sds-page检测；用anti-his tag鼠单克隆抗体和goat anti-mouse hrp igg二抗孵育做western blot鉴定。
[0063]
1.6重组蛋白dps-vp1、dps的纯化
[0064]
(1)在破碎后收集的上清液中加入nacl、tris-hcl和咪唑，终浓度分别为：0.5mol/l、0.02mol/l、0.005mol/l，用0.45μm滤器过滤除杂；
[0065]
(2)将xk16/20层析柱与恒流泵连接，加入蒸馏水检查密封性，然后取10ml proteinpure ni-nta树脂加入层析柱中，使其自然沉降；加入10倍体积的平衡液平衡柱子；
[0066]
(3)将(1)中的上清液流过层析柱，流速为6ml/min，收集流过液；再次用8倍体积的平衡液平衡柱子，收集洗脱液；
[0067]
(4)用8倍体积不同浓度的咪唑溶液对结合的蛋白进行洗脱，各收集8ml
×
8管，加入适量20％乙醇收集ni-nta树脂，4℃保存，将上述收集液体加入4
×
loading buffer，95℃变性，进行sds-page凝胶电泳；
[0068]
(5)将仅含有目的蛋白的洗脱液混合，加入millipore超滤离心管中，室温下4000rpm离心30min，浓缩后装入3.5kda透析袋中，在室温下用含有1m nacl、ph 8.0的pbs透析液透析6h，每隔2h换一次透析液；
[0069]
(6)收集透析后的蛋白，经0.22μm滤器除菌，用bca蛋白浓度测定试剂盒测目的蛋白的浓度，并分装到无菌ep管中，用封口膜密封，保存于室温。
[0070]
1.7重组蛋白dps-vp1纳米颗粒的透射电镜鉴定
[0071]
吸取10μl纯化后的蛋白dps-vp1、dps滴加到铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，吸取醋酸双氧铀10μl滴加到铜网上沉淀1min，也用滤纸吸去浮液，常温干燥5-10min，80-120kv进行电镜检测成像，得到透射电镜成像结果。
[0072]
1.8疫苗的制备
[0073]
将montanidetm isa201佐剂、pbs、重组蛋白dps-vp1、dps在水浴锅中加热到31℃，然后向isa201佐剂中缓慢地加入等体积的pbs或重组蛋白dps-vp1、dps，在涡旋振荡器上涡旋5min，置于20℃水浴锅中静置1h，形成水包油包水双相油乳疫苗。
[0074]
1.9免疫接种
[0075]
6-8周龄balb/c小鼠被随机分为4组，6只/组(雌、雄各3只)，分别是pbs组、10μg dps-vp1组、50μg dps-vp1组、100μg dps-vp1组，经小鼠后腿内侧肌肉注射100μl，两次免疫间隔两周，观察小鼠精神状态及死亡情况，并于第二次免疫后14d处死小鼠，剖取心、肝、脾、肺、肾，通过he染色观察脏器病理变化。
[0076]
6-8周龄balb/c雌鼠被随机分为6组，6只/组，分别是pbs组、50μg dps-vp1组(dps-vp1 h)、10μg、30μg、50μg dps-vp1 isa201组(dps-vp1 h isa201、dps-vp1m isa201、dps-vp1 l isa201)、50μg dps isa201组以及口蹄疫二价疫苗组，经小鼠后腿内侧肌肉注射100μl，口蹄疫二价疫苗按照物种间剂量换算注射15μl，两次免疫间隔两周，分别于0d、14d、28d、42d小鼠眼眶静脉采血，分离血清，用间接elisa检测小鼠体内特异性抗体。
[0077]
1.10重组蛋白稳定性实验
[0078]
将纯化后的重组蛋白dps-vp1和dps置于室温保存，每隔一个月测定重组蛋白浓度，检测其在不同室温环境下的稳定性。
[0079]
试验结果：
[0080]
酶切结果如图1显示，重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps经双酶切后，均显示了与预期相符的目的条带，分别为657bp和534bp，说明成功构建了插入目的基因的重组表达质粒。将重组质粒pet-11a-dps-vp1、pet-11a-dps导入感受态细胞bl21(de3)中，并进行菌落pcr，结果如图2所示，除重组菌落pet-11a-dps-vp1的2号单菌落没有出现目的片段，其余单菌落均出现了特定长度的目的片段，分别为850bp和727bp，鉴定为阳性克隆，可以进行重组蛋白的诱导表达。
[0081]
分别取pcr阳性的单菌落在37℃，200rpm，amp浓度100μg/ml，iptg终浓度为1mm的lb培养基中诱导表达6h，经超声破碎仪破碎后，取上清做sds-page检测，结果如图3所示，重组蛋白dps-vp1和dps未经iptg诱导时，未见目的蛋白的表达，重组蛋白dps-vp1经诱导后在23.9kda处出现目的条带，并在47.8kda处出现二聚体，dps在19.6kda处有目的条带，用his标签抗体与目的蛋白结合，同样在相同的位置出现目的条带如图4所示，可以确定重组蛋白dps-vp1和dps在大肠杆菌表达系统中可稳定表达。
[0082]
收集诱导表达的上清经ni-nta纯化，分别在500mm和400mm咪唑洗脱液中得到了纯度较高的重组蛋白dps-vp1和dps，达95％以上(如图5所示)。
[0083]
用含有1m nacl的pbs(ph 8.0)透析蛋白后，进行负染色透射电镜观察。从图6可以看出，重组蛋白dps-vp1和dps均形成大小约9nm的圆形颗粒，并且与天然口蹄疫病毒一样表面光滑。
[0084]
小鼠首免后，与pbs组对比，dps-vp1不同浓度组生长速度和精神状态均正常，直到第二次免疫后14d，未出现小鼠死亡情况。心、肝、脾、肺、肾的he染色结果表示(如图7所示)，与pbs接种组相比，50μg和100μg dps-vp1组均未观察到中性粒细胞浸润和组织构筑物丢失等明显的组织病理学变化，证明dps-vp1对小鼠没有毒性作用，且100μg dps-vp1在安全浓度范围内。
[0085]
经免疫后，各组小鼠体重变化无显著差异(如图8所示)。
[0086]
如图9所示，随着免疫次数的增加，二价疫苗组和dps-vp1不同免疫组的小鼠体内均产生vp1特异性抗体，42dpi时，与空白对照组、pbs组以及dps isa201组相比，dps-vp1不同免疫组和二价疫苗组诱导的vp1特异性igg水平显著升高，并且dps-vp1h isa201组小鼠
产生的特异性igg水平明显高于dps-vp1 h组小鼠，dps-vp1h isa201组和二价疫苗组之间无显著差异。
[0087]
如图10所示，重组蛋白dps-vp1和dps置于室温保存六个月，蛋白浓度没有显著变化。
[0088]
综上所述，本发明成功构建pet-11a-dps-vp1/pet-11a-dps重组质粒，经大肠杆菌诱导表达，重组蛋白dps-vp1和dps均能稳定表达，并自组装为病毒样颗粒(约9nm)，能在室温下存放至少6个月；重组蛋白dps-vp1经乳化制备疫苗，免疫balb/c小鼠(50μg/只)，能有效诱导小鼠产生fmdv特异性抗体。
[0089]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。