一种人参肽

1.本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种人参肽。


背景技术：

2.机体在正常代谢过程中会产生各种自由基和活性氧（ros），它们参与基因转录、信号转导和细胞程序性死亡等生理过程。这些少量的ros不会对身体造成损害，而是与体内的抗氧化系统相协调，从而维持促氧化剂和抗氧化剂之间的平衡。其中，抗氧化酶（sod、cat和谷胱甘肽过氧化物酶）是身体最重要的抗氧化系统，它与一些非酶类抗氧化因子（如褪黑激素）相互合作，抵御ros的伤害。然而，一旦ros的水平超出了细胞的抗氧化能力，氧化应激就会发生，导致各种疾病的发生。
3.由于神经元需要消耗大量的氧气且抗氧化剂水平相对较低，更容易受到氧化应激的直接损伤。氧化应激可以促进aβ聚集和tau蛋白磷酸化，从而形成淀粉样斑块和神经纤维缠结，导致神经元细胞死亡和进一步的氧化应激。因此使用抗氧化剂，维持神经元细胞内的氧化还原稳态也是治疗疾病的方式。由于合成的抗氧化剂存在副作用，寻找天然的抗氧化剂成为近年来的研究热点。其中，生物活性肽以生物安全性高、免疫原性低、易于合成及具有抗氧化功能等多种优势引起了人们的广泛关注。
4.人参肽是从人参或人参蛋白分解产物中获得的具有生物功能的肽段。人参蛋白在水解形成肽的过程中，肽键被降解，这会使可解离基团增多，从而增加其亲水性和净电荷的数量；肽键的降解也会改变其分子结构，将蛋白内部的疏水基团暴露出来。此外，还会改变肽的氨基酸个数和相对分子质量，这些变化提高了人参肽的溶解性、增加了其稳定性、乳化性以及流变学性，此外，与氨基酸相比，人参肽的渗透压较低，生物安全性高，它不仅可以作为抗氧化剂还可以作为治疗或辅助治疗手段延缓疾病的发展。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种人参肽，四种人参肽单体均具有良好的抗氧化能力，可以缓解aβ
1-42
诱导的神经细胞的氧化损伤、抑制aβ
1-42
的体内外聚集，在延缓线虫瘫痪、改善ad的症状。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种人参肽，肽的氨基酸序列如下列（1）-（4）任一项所示：（1）人参肽的氨基酸序列为如seq id no.1所示；（2）人参肽的氨基酸序列为如seq id no.2所示；（3）人参肽的氨基酸序列为如seq id no.3所示；（4）人参肽的氨基酸序列为如seq id no.4所示。
7.本发明利用酶解的方式制备了人参肽混合物，并通过分离纯化及高分辨液质联用技术，分离鉴定了四种人参肽单体。所述的人参肽肽氨基酸序列为itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa，这四种人参肽单体具有良好的抗氧化效果。
8.本发明通过aβ
1-42
寡聚体刺激构建神经细胞氧化损伤模型、利用噻唑蓝(mtt)检测细胞存活率、荧光显微镜和流式细胞术检测神经细胞内活性氧(reactive oxygen species，ros)含量、荧光显微镜检测细胞凋亡情况，阐述人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa可以抑制aβ
1-42
寡聚体诱导的神经细胞损伤。
9.本发明以转基因秀丽隐杆线虫cl4176为动物模型，检测人参肽单体对aβ
1-42
诱导的线虫瘫痪、寿命、及体内aβ的影响。
10.本发明利用分子对接模拟技术，证明了itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa与aβ
1-42
之间的相互作用。具体的，利用酶解的手段对体系中的大分子量蛋白进行水解制备小分子肽的方法已经被广泛应用，利用碱性蛋白酶制备人参肽混合物，然后依次经过离子交换层析、凝胶过滤层析并联合高分辨液质联用技术，制备了人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa。利用aβ
1-42
寡聚体刺激细胞构建ad细胞模型。发现人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa在单独作用于细胞时，对细胞没有毒性。人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa预处理细胞4 h可以显著抑制aβ
1-42
寡聚体诱导的ca
2
内流，维持线粒体膜电位稳定、改善线粒体功能损伤，降低细胞内ros水平，抑制细胞凋亡。
11.利用转基因秀丽隐杆线虫cl4176作为ad动物模型，升高线虫的培养温度至23℃，诱导aβ
1-42
基因的表达，使线虫表现ad的症状。经过人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa给药，发现所述四种人参肽单体均可以延缓线虫的瘫痪、降低瘫痪率，延长线虫寿命，降低线虫体内的ros水平，提高线虫的产卵率，减少线虫体内aβ斑块的沉积数量。
12.因此，本发明采用上述一种人参肽，人参肽itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa可以抑制aβ
1-42
的体内外聚集，缓解aβ
1-42
的神经毒性。
13.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
14.图1是人参肽的分离纯化示意图；（a）gfreh的deae sephadex a-25离子交换层析图谱。（b）fraction
ꢀⅰ
、ⅱ和ⅲ对羟自由基清除能力的检测，以vc为阳性对照组；（c）fraction
ꢀⅰ
、ⅱ和ⅲ对超氧阴离子清除能力的检测，以vc为阳性对照组；（d）fraction
ꢀⅱ
的sephadex g-10凝胶过滤层析图谱；（e）fraction 1和fraction 2对羟自由基清除能力的检测，以vc为阳性对照组；（f）fraction 1和fraction 2对超氧阴离子清除能力的检测，以vc为阳性对照组；图2是人参肽单体的结构鉴定示意图；（a）抗氧化活性最高的fractionⅱ经过hrlc-ms系统检测的总离子峰图；（b）人参肽单体的一级质谱图；（c）人参肽单体的二级质谱图；（d）人参肽单体的氨基酸序列；图3是人参肽单体的体外抗氧化检测图；（a）四种人参肽单体对羟基自由基的清除率；（b）四种人参肽单体对超氧阴离子的清除率；图4是人参肽单体对aβ
1-42
体外聚集的作用图；（a）未添加人参肽单体组，随着aβ
1-42
浓度的增加，荧光强度变化；（b）添加itgyap后，随着aβ
1-42
浓度的增加，荧光强度变化；（c）添加ltgyap后，随着aβ
1-42
浓度的增加，荧光强度变化；（d）添加itgypa后，随着aβ
1-42
浓度的增加，荧光强度变化；（e）添加ltgypa后，随着aβ
1-42
浓度的增加，荧光强度变化；图5是人参肽单体对aβ
1-42
寡聚体诱导的sh-sy5y损伤的作用图；（a）随着aβ
1-42
给药
浓度的增加，细胞存活率变化；（b）四种人参肽单体单独给药时细胞毒性；（c）aβ
1-42
浓度为5
ꢀµ
m时，itgyap人参肽单体不同给药浓度时的细胞存活率变化；（d）aβ
1-42
浓度为5
ꢀµ
m时，ltgyap人参肽单体不同给药浓度时的细胞存活率变化；（e）aβ
1-42
浓度为5
ꢀµ
m时，itgypa人参肽单体不同给药浓度时的细胞存活率变化；（f）aβ
1-42
浓度为5
ꢀµ
m时，ltgypa人参肽单体不同给药浓度时的细胞存活率变化；图6是人参肽单体对aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞ca
2
内流的作用图；（a）不同给药状态，细胞内绿色荧光强度；（b）给药itgyap人参肽单体后细胞内绿色荧光强度的量化柱形图；（c）给药ltgyap人参肽单体后细胞内绿色荧光强度的量化柱形图；（d）给药itgypa人参肽单体后细胞内绿色荧光强度的量化柱形图；（e）给药ltgypa人参肽单体后细胞内绿色荧光强度的量化柱形图；图7是人参肽单体对aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞线粒体膜电位的影响图；（a）给药不同浓度的itgyap人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化图；（b）给药ltgyap人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化图；（c）给药itgypa人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化图；（d）给药ltgypa人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化图；（e）给药不同浓度的itgyap人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化定量分析柱形图；（f）给药ltgyap人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化定量分析柱形图；（g）给药itgypa人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化定量分析柱形图；（h）给药ltgypa人参肽单体后细胞内红色荧光和绿色荧光强度变化定量分析柱形图；图8是人参肽单体对aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞内ros水平的影响图；（a）经过不同给药处理后细胞内绿色荧光强度分析；（b）使用流式细胞仪对sh-sy5y细胞内的ros含量的分析；（c）是不同给药浓度的itgyap人参肽单体对细胞内ros含量的量化分析；（d）是不同给药浓度的ltgyap人参肽单体对细胞内ros含量的量化分析；（e）是不同给药浓度的itgypa人参肽单体对细胞内ros含量的量化分析；（f）是不同给药浓度的ltgypa人参肽单体对细胞内ros含量的量化分析；图9是人参肽单体对aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞凋亡的影响图；（a）不同给药处理后细胞荧光强度分析；（b）不同给药浓度的itgyap人参肽单体处理细胞荧光定量分析；（c）不同给药浓度的ltgyap人参肽单体处理细胞荧光定量分析；（d）不同给药浓度的itgypa人参肽单体处理细胞荧光定量分析；（e）不同给药浓度的ltgypa人参肽单体处理细胞荧光定量分析；图10是不同人参肽单体对线虫瘫痪的影响图；图11是不同人参肽单体对线虫体内ros水平的影响图；图12是不同人参肽单体对线虫寿命的影响图；图13是人参肽单体对线虫产卵率的影响图；（a）不同给药处理后，线虫的日产卵数变化柱形图；（b）不同给药处理后，线虫的总产卵数变化柱形图；图14是人参肽单体对线虫体内aβ沉积的影响图；（a）不同给药处理的线虫体内aβ沉积斑块变化；（b）不同人参肽单体处理的荧光强度定量柱形图；图15是分子对接模拟人参肽单体与aβ
1-42
的相互作用；（a）itgyap-aβ
1-42
的分子对接示意图；（b）itgyap-aβ
1-42
的分子对接空间结构图；（c）ltgyap
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接示意图；
（d）ltgyap
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接空间结构图；（e）itgypa
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接示意图；（f）itgypa
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接空间结构图；（g）ltgypa
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接示意图；（h）ltgypa
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接空间结构图。
具体实施方式
15.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
16.实施例一 人参肽单体的制备（1）粉碎酶解用粉碎机将人参须根粉碎成粉末，并过30目筛。称取一定量的人参粉末放入锥形瓶中，并按1:10（m/v）的比例加入蒸馏水，并用1 m的naoh将ph调节至8.0。然后将样品放入50℃水浴锅中预热10 min，按1:50（v/v）的比例加入碱性蛋白酶，随后将锥形瓶放入50℃震荡水浴锅中进行酶解反应。反应过程中，酶解液的ph值会随酶解时间的延长而降低，因此每隔20 min向酶解液中补加一定量的1 m的naoh溶液，使溶液ph保持在8.0，直至ph值不再改变，酶解反应结束。将锥形瓶放在95℃水浴中加热10 min使酶失活，待酶解液冷却后用1 m的hcl将ph调节至7.0，7000 rpm离心15 min，收集上清液，依次用滤纸、1
ꢀµ
m、0.45
ꢀµ
m、0.22
ꢀµ
m的滤膜进行过滤，随后将滤液进行冷冻干燥，得到人参肽混合物（gfreh）。
17.（2）层析离子交换层析是按照被分离物质在一定ph条件下所带电荷不同而进行分离的方法。分离条件：离子交换层析柱直径为2.0 cm，长度为20 cm，层析柱为deae sephadex a-25，洗脱液为10 mm tris-hcl缓冲液（ph=9.0）。将gfreh用超纯水进行溶解，用缓冲液洗脱平衡柱料至基线平稳无明显吸收峰后再进行上样，洗脱液为0-5 m nacl溶液，洗脱速度为1 ml/min，蛋白检测波长为220 nm，待出现洗脱峰时收集洗脱液，然后将洗脱液冷冻干燥并进行体外抗氧化活性的检测。如图1中a-c所示，gfreh经过离子交换层析，得到三种组分，其中fraction
ꢀⅱ
的抗氧化活性最高，收集fraction
ꢀⅱ
进行下一步实验。
18.采用凝胶过滤层析的方法对fraction
ꢀⅱ
进行分离。分离条件：凝胶色谱柱直径为2.0 cm，长度为100 cm，层析柱为sephadex g-10，洗脱液为高纯水，洗脱流速为0.5 ml/min，蛋白检测波长为220 nm。将抗氧化活性最高的组fraction
ꢀⅱ
配制成水溶液进行上样，并用高纯水进行洗脱，待出现洗脱峰时收集洗脱液，然后将洗脱液冷冻干燥并进行体外抗氧化活性的检测。如图1中d-f所示，fraction
ꢀⅱ
经过凝胶过滤层析，得到两种组分，其中fraction 1的抗氧化活性最高，收集fraction 1，进行下一步实验。
19.用高分辨液相色谱质谱联用仪（hrlc-ms）agilent1290-bruker microtof qii将经过离子层析后抗氧化活性最高的组分经进行结构鉴定。色谱柱是agilent反向c18柱（2.7
ꢀµ
m，2.1
×
150 mm），洗脱液为含0.1%甲酸超纯水和含0.1%甲酸的乙腈，洗脱梯度从15%乙腈到90% 乙腈，洗脱流速为0.7 ml/min, 洗脱时间为6 min，使用电喷雾离子源（esi），正离子检测模式，离子源温度为200℃，碰撞能量为10 ev，扫描范围为50-1500 m/z。如图2中a-d依次为fraction 1流经液相进入质谱的流总离子峰图；人参肽单体的一级质谱图；人参肽单体的二级质谱图；人参肽单体的氨基酸顺序图。
20.人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa对羟自由基和超氧阴离子自由基的
清除能力。图3中a显示四种人参肽单体对羟基自由基的清除率均在80%左右，b显示四种人参肽单体对超氧阴离子的清除率均在95%左右。
21.实施例二 利用硫黄素t染色法检测aβ
1-42
的体外聚集取适量的aβ
1-42
的hfip溶液，通过氮气去除hfip溶剂，用pbs溶液将aβ
1-42
肽完全溶解，并配制成5、10和15
ꢀµ
m的溶液，37℃孵育96 h，而后将aβ
1-42
溶液与硫黄素t（终浓度为50 μm）混合，并进行荧光测量（激发波长440 nm，发射波长480 nm）以确定最适aβ
1-42
溶液浓度。然后将aβ
1-42
与人参肽单体按15:0、15:1和15:5（μm）的比例溶解于pbs缓冲液中，置于37℃恒温振荡器中孵育96 h后，加入硫黄素t溶液，进行荧光测量。
22.如图4中a所示，与对照组相比，随着aβ
1-42
浓度的增加，荧光强度增强，当aβ
1-42
的浓度为15
ꢀµ
m时，荧光强度和对照组差别显著，因此选择15
ꢀµ
m作为后续实验浓度。如图4中b-e所示，与ctrl组相比，不加人参肽单体的aβ
1-42
组荧光强度显著增强，而人参肽单体的加入显著降低了荧光强度，且随着人参肽单体浓度的增加，荧光强度降低效果越明显（图4中b-e），这说明了人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa、ltgypa在体外可以明显抑制aβ
1-42
的聚集。
23.实施例三 人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa对aβ
1-42
诱导的神经细胞损伤的影响将细胞按照每孔5
×
103个/孔的密度接种到含完全培养基的96孔板中，置于37℃的二氧化碳培养箱中培养24 h，弃去培养基，分别用不同浓度（1、5、10、15
ꢀµ
m）的aβ
1-42
寡聚体处理细胞24 h，然后向每孔中加入10
ꢀµ
l（5 mg/ml）的mtt溶液，置于37℃细胞培养箱中培养4 h。弃去上清，向每个孔中加入150
ꢀµ
l二甲基亚砜（dmso）溶液，使用酶标仪在492 nm处测定吸光度，并计算其细胞存活率。按照上述方法分别用不同浓度的人参肽单体（0.1、1、10和100
ꢀµ
m）处理细胞，检测人参肽单体对细胞的毒性。然后按照上述方法，用不同浓度的人参肽单体预处理细胞4 h，然后用5
ꢀµ
m的aβ
1-42
寡聚体处理细胞24 h，测定细胞存活率。
24.细胞存活率计算：；如图5中a所示，随着aβ
1-42
给药浓度的增加，sh-sy5y细胞受到aβ
1-42
寡聚体的损伤作用，细胞存活率呈剂量依赖性下降，当aβ
1-42
的给药浓度为1、5、10、15
ꢀµ
m时，细胞存活率分别为79.30%
±
2.57、50.54%
±
3.00、37.02%
±
3.18和30.89%
±
3.42（n=5）。当给药浓度为5
ꢀµ
m时，细胞存活率接近ic50值，因此后续细胞实验中aβ
1-42
的最适建模浓度为5
ꢀµ
m。图5中b所示，人参肽单体单独给药时细胞毒性。单独给药aβ
1-42
寡聚体时细胞存活率仅为ctrl组的50%，而在给药不同浓度的itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa预处理4 h后，能够显著抑制由aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞凋亡，提高细胞的存活率，且细胞存活率随人参肽单体浓度的升高而升高。当人参肽单体的给药浓度为40
ꢀµ
m时，细胞存活率分别为82.05
±
2.14、84.62%
±
1.96、86.26%
±
2.53和83.89%
±
1.61（图5中c-f）。该结果表明，人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa对aβ
1-42
寡聚体诱导的sh-sy5y细胞损伤具神经保护作用。
25.实施例四 人参肽单体对神经细胞ca
2
内流的影响将sh-sy5y细胞以3
×
104个/孔的密度接种于24孔板中培养24 h，弃去培养基，然后用不同浓度（10、20、40
ꢀµ
m）的人参肽单体预处理细胞4 h，然后弃去人参肽溶液，加入5
ꢀµ
m的aβ
1-42
，继续培养24 h，弃去培养基，向每孔中加入终浓度为5
ꢀµ
m的fluo-4 am探针，37℃培养箱避光孵育30 min，最后用pbs洗3次去除多余的探针，立即用荧光显微镜进行拍照，并用imagej进行定量分析。
26.如图6中a所示，ctrl组细胞没有给药aβ
1-42
寡聚体，细胞状态良好，绿色荧光较弱。在给药aβ
1-42
寡聚体组中，细胞表现出强烈的荧光，说明细胞受到aβ
1-42
寡聚体的诱导损伤，细胞膜遭到破坏，使得ca
2
内流，细胞内ca
2
超载。而经过给药不同浓度（10、20和40
ꢀµ
m）的人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa预处理细胞4 h后，细胞内的绿色荧光强度有了不同程度的减弱，表明了人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和itgyap处理后细胞内ca
2
的含量显著降低，人参肽单体可以抑制由aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞损伤和细胞内ca
2
超载。然后我们使用imagej软件对sh-sy5y细胞内的绿色荧光强度进行了量化（图6中b-e）。以上结果说明了人参肽单体可以逆转由aβ
1-42
寡聚体诱导的神经细胞损伤和细胞ca
2
内流。
27.实施例五 人参肽单体对神经细胞线粒体膜电位的影响将sh-sy5y细胞以3
×
104个/孔的密度接种于24孔板中培养24 h，弃去培养基，然后用不同浓度（10、20、40
ꢀµ
m）的人参肽单体预处理细胞4 h，然后弃去人参肽溶液，加入5
ꢀµ
m的aβ
1-42
，继续培养24 h，按照碧云天试剂盒检测说明向每孔加入终浓度为10
ꢀµ
g的jc-1探针，37℃孵育染色。20 min后，用pbs洗3次，立即用荧光显微镜拍照，并用imagej进行定量分析。
28.如图7中a-d所示，ctrl组细胞用aβ
1-42
寡聚体处理，细胞状态良好，线粒体膜电位正常，jc-1以聚合物形式存在，形成较强的红色荧光。在给药aβ
1-42
寡聚体组中，红色荧光减弱，绿色荧光显著增强，说明jc-1以单体形式存在，线粒体膜电位降低，当细胞受到aβ
1-42
寡聚体的诱导损伤时，线粒体遭到破坏，线粒体膜电位下降。而经过给药不同浓度（10、20和40
ꢀµ
m）的人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa预处理细胞4 h后，细胞内的红色荧光强度增强，绿色荧光强度显著减弱，表明人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa预处理4 h后细胞线粒体膜电位明显恢复，人参肽单体可以抑制由aβ
1-42
寡聚体诱导的细胞损伤和线粒体膜电位下降。然后使用imagej软件对sh-sy5y细胞内的红色荧光和绿色荧光强度进行了定量分析（图7中e-h）。以上结果说明了人参肽单体可以有效抑制aβ
1-42
寡聚体诱导的sh-sy5y细胞线粒体膜电位下降。
29.实施例六 人参肽单体对神经细胞内ros水平的影响将sh-sy5y细胞以3
×
104个/孔的密度接种于24孔板中培养24 h，弃去培养基，然后用不同浓度（10、20、40
ꢀµ
m）的人参肽单体预处理细胞4 h，然后弃去人参肽溶液，加入5
ꢀµ
m的aβ
1-42
，继续培养24 h，然后按照ros试剂盒检测说明每孔加入终浓度为10
ꢀµ
m的dcfh-da探针，37℃孵育染色15 min，最后用pbs洗涤3次，立即用荧光显微镜拍照，后收集细胞用流式细胞仪进行荧光定量。
30.如图8中a所示，ctrl组细胞未经药物处理，细胞内没有出现强烈的绿色荧光，说明细胞状态正常，胞内ros含量相对较低。单独给药aβ
1-42
寡聚体后，细胞呈现强烈的绿色荧光，表明进入细胞的dcfh-da被胞内的ros氧化成了具有绿色荧光的dcf，与ctrl组相比，单独给药aβ
1-42
寡聚体的细胞内ros含量显著升高。而经过给药不同浓度（10、20和40
ꢀµ
m）的人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa预处理细胞4 h后，细胞内的绿色荧光强度明显减弱，说明人参肽单体可以显著抑制由aβ
1-42
寡聚体所诱导的神经细胞内ros的过量累积。
然后，使用流式细胞仪对sh-sy5y细胞内的ros含量进行了分析和定量（图8中b-f，结果与荧光显微镜图像相一致。以上结果表明了人参肽单体可以有效抑制aβ
1-42
寡聚体诱导的sh-sy5y细胞内ros过度累积。
31.实施例七 人参肽单体对aβ
1-42
诱导的神经细胞损伤的影响将sh-sy5y细胞以2
×
105个/孔的密度接种于六孔板中，于37℃二氧化碳培养箱中进行培养。待24 h后用不同浓度（10、20、40
ꢀµ
m）的人参肽单体预处理4 h，然后加入5
ꢀµ
m的aβ
1-42
处理24 h。向每孔中加入hoechst 33342染料，37℃培养箱中孵育20 min，然后用pbs洗3次，在荧光显微下通过荧光观察细胞核形态，并用imagej进行定量。
32.如图9中a所示，ctrl组细胞没有用aβ
1-42
寡聚体处理，细胞表现出均匀的蓝色，说明细胞状态良好；在用aβ
1-42
寡聚体处理组中，细胞内出现强烈的颗粒块状荧光，说明细胞发生凋亡。而经过给药不同浓度（10、20和40
ꢀµ
m）的人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa预处理细胞4 h后，细胞内的颗粒块状荧光明显减少。imagej荧光定量（图9中b-e）分析结果表明，与ctrl组相比，aβ
1-42
寡聚体荧光强度显著增强，而给药不同浓度的itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa时，可以使荧光强度显著下降。这些结果表明人参肽单体可以降低aβ
1-42
寡聚体对sh-sy5y神经细胞的刺激，抑制由此引起的细胞凋亡，对神经细胞具有保护作用。
33.实施例八 人参肽单体对线虫瘫痪率的影响将同步化后l3期的转基因线虫cl4176分别转移到对照组和给药组的ngm培养基上，23℃培养36 h后开始统计线虫的瘫痪条数。线虫能够进行rolling运动的视为正常状态；触碰线虫身体时，只有头部可以摆动而不能再做rolling运动且不能移动的视为瘫痪；线虫身体僵直，触碰没有应激反应的视为死亡。
34.如图10所示，在未处理的对照组中，线虫在第4天和第5天的瘫痪率均在50%以上。相比之下，aβ
1-42
诱导的瘫痪率随着单体肽浓度的增加而降低，人参肽单体的最高浓度为200
ꢀµ
m，线虫的瘫痪率显着降低。与对照组相比，200
ꢀµ
m的itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa处理的cl4176线虫，身体瘫痪率在第4天和第5天的分别降低了23.67%和26%、30%和33.33%、15%和18.55%、30%和30%。这些结果表明，人参肽单体可以降低cl4176线虫体内aβ
1-42
诱导的毒性，从而减少了线虫瘫痪。
35.实施例九 人参肽单体对线虫体内ros水平的影响将同步化后l3期的转基因线虫cl4176分成对照组和给药组，16℃培养36 h后，把各组线虫转移到23℃再培养36 h，然后收集线虫，用m9缓冲液清洗3次去除线虫表面的大肠杆菌，再将线虫转移至含有m9缓冲液的黑色96孔板中，加入dcfh-da染料，使其终浓度为50
ꢀµ
m，40 min后用荧光酶标仪检测其荧光强度。
36.如图11所示，与未用人参肽单体处理的表达aβ
1-42
的对照组线虫相比，用200
ꢀµ
m的itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa处理使线虫体内的ros含量分别降低了21.32%、20.7%、19.22%和20.47%。这些结果表明，人参肽单体可以降低aβ
1-42
诱导的cl4176线虫体内的ros含量。
37.实施例十 人参肽单体对线虫寿命的影响将同步化后l3期的转基因线虫cl4176分成对照组和给药组，23℃培养箱培养，每两天更换一次培养基，观察线虫存活情况，并记录线虫存活、死亡及丢失的数量，直到所有
线虫死亡，实验结束。
38.如图12所示，与ctrl组相比，所有给药itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa的线虫的生存曲线显著右移。统计结果显示10
ꢀµ
m、100
ꢀµ
m和200
ꢀµ
m的itgyap分别将线虫的平均寿命延长了19.59%、42.40%和50.00%；不同浓度的人参肽单体ltgyap分别将线虫的平均寿命延长了13.54%、25.42%和41.63%；人参肽单体itgypa分别将线虫的平均寿命延长了38.77%、42.33%和50.14%；人参肽单体ltgypa分别将线虫的平均寿命延长了21.61%、24.03%和36.24%，以上实验结果说明了itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa可以显著延长线虫的寿命。
39.实施例十一 人参肽单体对线虫产卵数的影响将同步化后l3期的转基因线虫cl4176转移到对照组和给药组的ngm培养基上，每个板5条线虫，每组3个平行，待线虫进入产卵期每天转移线虫到新的ngm板上，并记录原培养板上线虫卵的数量，直到线虫停止产卵。
40.如图13所示，分别给药200
ꢀµ
m的itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa时，线虫的日产卵数会有不同程度的增加，对其总产卵数进行统计，与ctrl组相比，四种肽分别使产卵数增加了191、277、187和216颗。
41.实施例十二 人参肽单体对线虫体内aβ沉积的影响将同步化后l3期的转基因线虫cl4176分为对照组和给药组，后放入23℃培养箱中培养120 h，然后用m9缓冲液清洗3次，1000 rpm离心1 min使线虫沉降。用4%多聚甲醛/pbs溶液（ph 7.4）在4℃冰箱中固定过夜，后用预冷的pbs缓冲液冲洗3次。37℃条件下，把线虫置于通透液（含1% triton x-100、5% β-巯基乙醇、125 mm tris，ph 7.4）中通透24 h，pbst缓冲液冲洗3次。然后用0.125%的硫黄素t/50%乙醇溶液染色2 min，按浓度为50%、75%和100%乙醇梯度进行冲洗。在激光共聚焦显微镜下观察线虫头部aβ沉积情况，然后用imagej软件对绿色荧光进行了定量分析，如图14所示，ctrl组没有喂食人参肽单体，线虫头部有明显的aβ斑块，而分别喂食人参肽单体itgyap，ltgyap，itgypa和ltgypa组线虫头部aβ斑块的沉积明显减少。imagej软件分析结果同样表明了人参肽单体可以显著抑制线虫头部aβ斑块的沉积。
42.实施例十三 分子对接分析分子对接是一种强大的计算方法，已被用于预测受体和配体之间的相互作用能。人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa的3d结构通过chemdraw 20.0软件完成，aβ
1-42
蛋白的晶体结构从数据库rscb protein data bank（pdb，pdb id：1iyt）下载。人参肽单体itgyap、ltgyap、itgypa和ltgypa与aβ
1-42
的分子对接通过autodock vina1.5.7软件完成，然后使用pymol 2.4.0得到复合物结构，最后通过discovery studio 2019对图像进行可视化处理。
43.如图15所示，itgyap
‑ꢀ
aβ
1-42
、ltgyap
‑ꢀ
aβ
1-42
、itgypa
‑ꢀ
aβ
1-42
和ltgypa
‑ꢀ
aβ
1-42
的分子对接结果如图15中a-h所示，结合能分别为-5.5、-5.7、-5.2、-5.2 kcal/mol。图15中a和b显示itgyap通过与gln15/lys16形成两个分子间氢键以及和val18/phe19之间的疏水作用结合在aβ
1-42
分子上。图15中c和d显示ltgyap通过与ala21/glu22/gly25/ser26形成氢键以及和his13/lys16/leu17之间的疏水作用结合在aβ
1-42
分子上。图15中e和f显示itgypa是通过与leu17/ala21/glu22之间形成氢键以及和val18/leu34之间形成的疏水作用与aβ
1-42
分子相互结合的。图15中g和h显示ltgypa通过与leu17/ala21/glu22之间形成氢键以及和
val18/leu34之间形成的疏水作用结合在aβ
1-42
分子上。
44.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
45.说明书核苷酸或氨基酸序列表
；