一种混合盐纳米铝佐剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及疫苗佐剂制备领域，更确切地说，它涉及一种混合盐纳米铝佐剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.铝佐剂作为人或动物疫苗佐剂已得到广泛的应用，它能增强机体对抗原的特异性免疫应答，从而诱导持久且强烈的抗体免疫反应。铝佐剂主要由铝盐组成，主要包括：氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和混合盐铝佐剂，其中氢氧化铝应用最为广泛。
3.有效的t细胞免疫应答，是实现高效肿瘤免疫治疗的重要前提。尽管铝佐剂能够有效辅助抗原诱导抗体免疫应答，但无法诱导t细胞免疫应答，这导致其肿瘤免疫治疗中的应用十分有限。不仅如此，现有的铝佐剂仅用于抗原递送，尚无直接用于肿瘤免疫微环境调控的先例。研究发现，部分金属离子如mg2 等能够发挥一定的佐剂作用，在激活瘤内免疫细胞中发挥重要作用。同时，中和肿瘤中过度累积的乳酸，同样能够激活瘤内免疫细胞。由于铝佐剂种类的多样性，特别是混合盐铝佐剂尚无明确定义，这位新型铝佐剂的开发及应用提供了极大的契机。
4.近年来，纳米技术与材料的发展为铝佐剂的升级改造提供了重要新思路。目前商业化铝佐剂主要包括两类，即：由invivogen公司生产alhydrogel(主要成分为氢氧化铝，主要成分与临床铝佐剂一致)和thermofisher公司生产的imject alum(主要成分为氢氧化镁和氢氧化铝)，两者均只能诱导抗体免疫应答。尽管研究表明imject alum作为肿瘤疫苗佐剂时无法诱导有效的t细胞免疫应答，但imject alum较alhydrogel更易诱导t辅助1型免疫应答，而这十分有利于机体诱导t细胞免疫应答。这或许与imject alum中含有有利于t细胞激活的mg2 相关。此外，由于氢氧化镁的加入，imject alum呈弱碱性，这或将有利于imject alum直接中和肿瘤中累积的乳酸，并释放出mg2 来激活瘤内t细胞。然而，imject alum呈大颗粒团簇状(约8μm)，这对于其肿瘤浸润能力和在肿瘤内的快速分布有极大影响。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供了一种混合盐纳米铝佐剂及其制备方法和应用。该方法是一种使所得阐明结构均一、粒径分布均匀、成本低、安全性高，质量可靠的纳米铝佐剂的制备方法。使用该方法制备的混合盐纳米铝佐剂能够直接中和酸性肿瘤组织、激活肿瘤内t细胞、并诱导个性化抗肿瘤免疫应答。
6.第一方面，提供了一种混合盐纳米铝佐剂的制备方法，包括：
7.s1、将摩尔比为2-4:1的镁盐和铝盐混合溶液，快速加入到处于剧烈搅拌状态的氢氧化钠溶液，并在室温下继续搅拌5-10分钟，获得氢氧化镁与氢氧化铝的混合沉淀物；
8.s2、采用固液分离方法收集所述混合沉淀物，并使用超纯水洗涤并重悬，直至悬浊液ph处于中性或弱碱性；
9.s3、在室温下使所述混合沉淀物自水解获得混合盐纳米铝佐剂，或使用水热釜进
alum的x-射线衍射扫描结果示意图；
29.图3是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及商业化铝佐剂alhydrogel和imject alum的粒径分布测试结果示意图；
30.图4是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及商业化铝佐剂alhydrogel和imject alum的表面电位测试结果示意图；
31.图5是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及商业化铝佐剂alhydrogel和imject alum的溶液ph示意图；
32.图6是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂的对不同肿瘤细胞毒性测试结果；
33.图7是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂干预肿瘤细胞自噬相关蛋白lc3b和p62表达的检测结果；
34.图8是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂在不同注射方式下对肿瘤ph的影响检测结果；
35.图9是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂(白色荧光)在不同注射方式下在肿瘤中滞留能力的检测结果；
36.图10是本发明提供的混合盐纳米铝佐剂在不同注射方式下对肿瘤生长抑制的检测结果；
37.图11是本发明提供的本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及商业化铝佐剂alhydrogel和imject alum对肿瘤生长抑制的检测结果；
38.图12是本发明提供的本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及商业化铝佐剂alhydrogel和imject alum在使用瘤旁注射方式对肿瘤处理后，肿瘤内毒性t细胞(cd3 cd8 )的水平变化及瘤内t细胞激活(cd3 nkg2d )的情况；
39.图13是本发明提供的本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及其与免疫调节分子cpg或化学药物mtx组合后，在使用瘤旁注射方式对肿瘤处理时对肿瘤的抑制情况；
40.图14是本发明提供的本发明提供的混合盐纳米铝佐剂及其与免疫调节分子cpg或化学药物mtx组合后，在使用瘤旁注射方式对肿瘤处理后，小鼠体内诱导抗原特异性抗肿瘤毒性t细胞水平的变化情况。
具体实施方式
41.下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
42.实施例1：
43.一种混合盐纳米铝佐剂的制备方法，包括：
44.s1、将摩尔比为2-4:1的镁盐和铝盐混合溶液，快速加入到处于剧烈搅拌状态的氢氧化钠溶液，并在室温下继续搅拌5-10分钟，获得氢氧化镁与氢氧化铝的混合沉淀物；
45.s2、采用固液分离方法收集混合沉淀物，并使用超纯水洗涤并重悬，直至悬浊液ph处于中性或弱碱性(ph为7-9之间)；
46.s3、在室温下使混合沉淀物自水解获得混合盐纳米铝佐剂，或使用水热釜进行水热处理获得混合盐纳米铝佐剂。
47.s1中，镁盐和铝盐的阴离子相同，镁盐和铝盐包括氯盐、硝酸盐、碳酸盐、磷酸盐或硫酸盐。也就是说，镁盐和铝盐可以为不同的阴离子盐，如氯盐、硝酸盐、碳酸盐、磷酸盐或硫酸盐等，但在同一反应中，应使用阴离子相同的镁盐和铝盐。
48.在本发明中，由于所述镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液接触即可产生铝佐剂沉淀，因此，对所述镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液的用量没有特别要求，只要所述镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液接触后，产生铝佐剂沉淀即可，为了充分利用原料，优选情况下，s1中，分别以(mg
2
al
3
)和oh-计，镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液的用量的摩尔比为1:1.5-2.0，比如为1:1.5。
49.在本发明中，由于镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液解除即可形成纳米铝佐剂沉淀，因此，所述镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液的浓度和体积可以是任意的，只要满足上述用量要求即可，为了充分利用原料便于操作，s1中，镁盐浓度可以为0.7m，铝盐浓度为0.3m，总体积为10ml，氢氧化钠溶液的浓度可以为0.45m。
50.s2中，固液分离方法包括：静止法、离心法和过滤法；在采用离心法时，离心力不小于4750g，并且使用超纯水洗涤2遍。
51.s3中，使用室温法处理由镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液接触所获得的沉淀物来获得混合盐纳米铝佐剂时，应预先使用搅拌、晃荡或超声分散的方法，使沉淀物充分重悬在超纯水中，其中超纯水的体积没有明确限制，为了便于操作，使用40ml超纯水充分重悬沉淀物后，静置或使用摇床晃荡或使用搅拌器搅拌沉淀物悬浊液48h，获得混合盐纳米铝佐剂。
52.在本发明中，使用水热法处理由镁盐和铝盐的水溶液与氢氧化钠溶液接触所获得的沉淀物来获得混合盐纳米铝佐剂时，应预先使用搅拌、晃荡或超声分散的方法，使沉淀物充分重悬在超纯水中，其中超纯水的体积没有明确限制，水热温度设置在温度在60-150℃间，反应时间在2h-16h间，为了便于操作，使用40ml超纯水充分重悬沉淀物后，使用水热釜在℃下对沉淀物悬浊液水热处理4h，获得纳米铝佐剂。
53.上述反应器可以为本领域所公知的各种反应器。例如玻璃仪器，反应釜等。
54.实施例2：
55.一种混合盐纳米铝佐剂作为抗酸剂和mg
2
补充剂，经局部注射后，激活肿瘤免疫微环境并抑制实体瘤生长的应用。
56.本发明制备的混合盐纳米铝佐剂适用于各种实体瘤，这指的肿瘤为具有明确实体的肿瘤组织，包括黑色素瘤、结肠癌、肝癌、乳腺癌等，局部注射方式包括：瘤内注射，瘤旁注射，远端注射(距离肿瘤边缘1-2cm处)。
57.采用本发明中的混合盐纳米铝佐剂对实体瘤进行局部注射，与商业化铝佐剂alhydrogel或imject alum相比，能够明显中和肿瘤酸性、抑制肿瘤生长。
58.实施例3：
59.一种混合盐纳米铝佐剂作为药物载体来递送化学药物或免疫调节分子，经局部注射后，杀伤肿瘤并诱导个性化抗肿瘤免疫应答诱导的应用。
60.本发明所设计的化学药物包括但不限于甲氨蝶呤、5氟尿嘧啶等，免疫调节分子包括但不限于cpg。
61.采用本发明中混合盐纳米铝佐剂与化学药物或免疫调节分子组合的新制剂，对实
体瘤进行局部注射，能明显抑制实体瘤生长，并诱导个性化抗肿瘤免疫应答。
62.实施例4：
63.称取一定量的mgcl2·
6η2o和alcl3·
6η2o，溶于超纯水中，配制成10ml镁离子和铝离子浓度为0.7mol/l和0.3mol/l的水溶液；称取一定量的naoh，溶于蒸馏水中，得40ml 0.45mol/l的naoh水溶液。将40ml氢氧化钠溶液预置于烧瓶中，并使用磁力搅拌器进行高速搅拌，随后使用注射器快速将mgcl2·
6η2o和alcl3·
6η2o溶液注射进氢氧化钠溶液，室温搅拌10分钟。收集混悬液，使用4750g的离心力收集铝佐剂沉淀物，并使用超纯水洗涤2遍。将沉淀分散于40ml超纯水中，使用水热釜进在100℃下水热处理4h，得到混合盐纳米铝佐剂。采用透射电镜测定样品的粒子形态，其结果见图1，从图1中可以看出，相对于商业化铝佐剂alhydrogel和imject alum，本发明获得的混合盐纳米铝佐剂为六边形颗粒，大小均一，分散均匀；采用x-射线衍射扫描，测定混合盐纳米铝佐剂的晶体类型为层状晶体结构，其结果见图2；采用纳米粒度与电动电位(zeta电位)分析仪测定样品的表面电荷，本发明获得的混合盐纳米铝佐剂粒径均匀分布在50-150nm，其结果见图3；本发明所得的混合盐纳米铝佐剂在水溶液中的表面电荷为 33.4mv，其结果见图4；采用ph计对样品的水溶液ph进行测定，当本发明获得的混合盐纳米铝佐剂浓度为0.5-1mg/ml时，其在水溶液中的ph达到8.0-8.5，其结果见图5。
64.实施例5：
65.将本发明制备的混合盐纳米铝佐剂与肿瘤细胞与正常共同孵育，评估混合盐纳米铝佐剂对细胞的生理作用，其结果见图6，不同细胞与浓度为5-1000μg/ml的混合盐纳米铝佐剂孵育时，混合盐纳米铝佐剂在较低浓度如62.5μg/ml时即对结肠癌细胞和黑色素瘤细胞具有明显的细胞毒性；而对正常细胞如树突状细胞、巨噬细胞和内皮细胞，混合盐纳米铝佐剂在250μg/ml及以下的浓度时，均未对细胞造成明显的细胞毒性。本发明的进一步的研究发现，本发明混合盐纳米铝佐剂能够有效阻断肿瘤细胞的自噬通路，并造成肿瘤细胞中自噬阻断标志蛋白lc3-ii和p62水平上升，其结果见图7，表明本发明混合盐纳米铝佐剂通过特异性阻断肿瘤细胞自噬途径，能够诱导抑制肿瘤细胞生长并导致其死亡。
66.实施例6：
67.取1mg本发明制备的混合盐纳米铝佐剂，通过局部注射的方式，即：瘤内注射，瘤旁注射和远端注射(注射点距离肿瘤边缘0.5-2cm，本实施例中选用1cm)，注射到肿瘤体积约为100mm3的黑色素瘤小鼠体内后，在第1、7和14天使用snarf-1荧光定量法检测小鼠肿瘤的ph，其结果见图8，从图8中可以看出，采用瘤内注射的纳米铝佐剂在1天内，可以将肿瘤ph提升至中性，但持续能力较差；采用瘤周注射的混合盐纳米铝佐剂，能够在14天内持续中和并维持肿瘤组织ph接近中性；采用远端注射的纳米铝佐剂，同样能够提高肿瘤ph，但对肿瘤组织ph的中和能力较瘤旁注射差。进一步地，使用荧光素标记本发明混合盐纳米铝佐剂并观察采用瘤旁注射时，其在肿瘤组织中的分布，发现本发明混合盐纳米铝佐剂在注射后1天时主要分布在肿瘤周围，并在随后的14天内缓慢浸润至肿瘤内部，其结果见图9。更进一步地，取1mg本发明制备的纳米铝佐剂，采用瘤内注射、瘤旁注射和远端注射(距离肿瘤边缘1cm)的方式注射到肿瘤体积约为100mm3的黑色素瘤小鼠体内后，在随后的10天每隔两天使用游标卡尺测量肿瘤尺寸并计算肿瘤体积(体积＝0.5
×
长
×
宽2)，其结果见图10，从图10中可以看出，瘤旁注射混合盐纳米铝佐剂最有效地抑制实体黑色素瘤的生长，在第18天时对肿
瘤的抑制率达到87％，而此时瘤内注射和远端注射的方式下混合盐纳米铝佐剂对肿瘤的抑制率分别仅有50％和52％。
68.实施例7：
69.取1mg本发明制备的混合盐纳米铝佐剂和商业铝佐剂alhydrogel,imject alum，采用瘤旁注射的方式注射到肿瘤体积约为100mm3的黑色素瘤小鼠体内后，在随后的10天每隔两天使用游标卡尺测量肿瘤尺寸并计算肿瘤体积(体积＝0.5
×
长
×
宽2)，其结果见图11，从图11中可以看出，本发明制备的混合盐纳米铝佐剂最有效地抑制实体黑色素瘤的生长，且在第18天时，本发明混合盐纳米铝佐剂对肿瘤的抑制率达到91％，而此时alhydrogel和imject alum对肿瘤的抑制率仅有1.5％和60％；采用流式免疫分析报告对肿瘤组织中的t细胞进行分析，其结果见图12，从图12中可以看出，向瘤旁注射本发明制备的混合盐纳米铝佐剂，显著提高了cd3

cd8

t细胞对肿瘤组织的浸润，且nkg2d标志在t细胞表面的表达明显升高，表明本发明制备的混合盐纳米铝佐剂在采用瘤旁注射时能够最有效地募集t细胞至肿瘤并通过提高nkg2d表达来激活瘤内t细胞。
70.实施例8：
71.取1mg本发明制备的混合盐纳米铝佐剂，分别与化学药mtx(10-50μg/mg纳米铝佐剂，本实例选用10μg/mg纳米铝佐剂，用于肿瘤杀伤)和免疫调节分子cpg(10-100μg/mg纳米铝佐剂，本实例选用10μg/mg纳米铝佐剂，用于诱导个性化抗肿瘤免疫应答)混合，通过静电作用吸附上述分子，随后采用远端注射的方式对肿瘤体积约为100mm3的黑色素瘤小鼠进行处理，其结果见图13，如图13所示，在第12天和第16天对小鼠进行瘤旁处置，各实验组名称代表两次处置所使用的药物种类，以纳米铝佐剂/mtx 纳米铝佐剂/cpg为例，表明在第12天时在距离小鼠肿瘤边缘1cm处注射纳米铝佐剂/mtx，第16天时在距离小鼠肿瘤边缘1cm处注射纳米铝佐剂/cpg。从图13中可以看出，纳米铝佐剂/mtx 纳米铝佐剂/cpg组合对肿瘤的抑制效率最高，在第18天时，对肿瘤的抑制率达到87％，而此时纳米铝佐剂 纳米铝佐剂和纳米铝佐剂 纳米铝佐剂/cpg组合对肿瘤的抑制率分别只有52％和68％。进一步，使用流式检测技术分析小鼠脾脏中针对黑色素瘤经典抗原trp2的特异性毒性t细胞水平，其结果如图14所示，纳米铝佐剂/mtx 纳米铝佐剂/cpg最高效地在小鼠体内诱导了trp2特异性抗肿瘤t细胞。这些结果表明，本发明开发的纳米铝佐剂/mtx能够有效杀伤肿瘤细胞并促使其释放抗原，纳米铝佐剂/cpg则能够有效捕获这些抗原，并原位诱导个性化抗肿瘤免疫应答。
72.综上所述，本发明通过将与imject alum组分完全一致的氢氧化镁和氢氧化铝混合物进行水解处理，得到一种与imject alum化学组成完全一致，但具有晶体结构明确且纳米尺度在50-200nm范围内的纳米铝佐剂。这种混合盐纳米铝佐剂，能够更容易地浸润到肿瘤组织中，中和肿瘤中过度积累的乳酸，并直接激活瘤内t细胞，从而达到高效的肿瘤新辅助治疗。