一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法与流程

技术特征：
1.一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：包括以下主要步骤：(1)基于靶向诊断基因设计一轮pcr扩增引物，一轮pcr扩增引物包括dna扩增引物组和rna扩增引物组；其中dna扩增引物组的序列为seq id no.1～seq id no.94，rna扩增引物组的序列为seq id no.95～seq id no.154；(2)取待测样品，分别进行dna提取、rna提取，得到样品dna和样品rna；(3)一轮pcr扩增：取样品dna，利用dna扩增引物组进行dna扩增捕获，得到dna捕获产物，片段分选纯化，得到带磁珠的重悬dna捕获产物；取样品rna，利用rna扩增引物组进行rna扩增捕获，得到rna捕获产物，片段分选纯化，得到带磁珠的重悬rna捕获产物；(4)二轮pcr扩增：取带磁珠的重悬dna捕获产物、带磁珠的重悬rna捕获产物，混合合并，得到混合捕获产物，进行二轮pcr扩增，分选纯化，得到二轮扩增产物；(5)对二轮扩增产物进行高通量测序，获得靶向诊断基因的序列信息，将靶向诊断基因的序列信息与正常基因序列信息、对比，分析基因变异情况。2.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述靶向诊断基因包括egfr、erbb2、braf、kras、nras、pik3ca、met、c-kit、pdgfra、akt1、alk、ros1、ret、ntrk1、ntrk2、ntrk3。3.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(1)中，dna扩增引物组包括：针对nras基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.1～seq id no.2，下游引物的序列为seq id no.3～seq id no.4；针对kras基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq idno.5～seq id no.7，下游引物的序列为seq id no.8～seq id no.10；针对akt1基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.11，下游引物的序列为seq id no.12；针对erbb2基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.13～seq id no.16，下游引物的序列为seq id no.17～seq id no.20；针对pik3ca基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.21～seq id no.23，下游引物的序列为seq id no.24～seq id no.26；针对pdgfra基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.27～seq id no.28，下游引物的序列为seq id no.29～seq id no.30；针对c-kit基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.31～seq id no.34，下游引物的序列为seq id no.35～seq id no.38；针对egfr基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.39～seq id no.42，下游引物的序列为seq id no.43～seq id no.46；针对met基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.47～seq id no.50，下游引物的序列为seq id no.51～seq id no.54；针对braf基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.55，下游引物的序列为seq id no.56；针对ntrk1基因、ntrk2基因、ntrk3基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为
seq id no.57～seq id no.61，下游引物的序列为seq id no.62～seq id no.66；针对alk基因、ros1基因、ret基因设计的dna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.67～seq id no.83，下游引物的序列为seq id no.84～seq id no.94。4.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(1)中，rna扩增引物组包括：针对ntrk1基因、ntrk2基因、ntrk3基因设计的rna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.95～seq id no.103，下游引物的序列为seq id no.104～seq id no.111；针对alk基因、ros1基因、ret基因设计的rna扩增引物，其中上游引物的序列为seq id no.112～seq id no.141，下游引物的序列为seq id no.142～seq id no.154。5.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(3)中，二轮pcr扩增时采用二轮上游引物和二轮下游引物，其中二轮上游引物的序列为seq id no.155，二轮下游引物的序列为seq id no.156。6.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(3)中，dna扩增捕获时采用30μl的pcr反应体系，该pcr反应体系包括以下组分：8μl的dna扩增引物组混合物，12μl的样品dna，10μl的3x酶混合物；dna扩增捕获程序为：95℃，3min，95℃，30sec，60℃，4min，20个循环，72℃，4min；rna扩增捕获时采用30μl的pcr反应体系，该pcr反应体系包括以下组分：10μl的rna扩增引物组混合物，10μl的样品rna逆转录产物，10μl的3x酶混合物，2μl的无核酸水；rna扩增捕获程序为：95℃，3min，95℃，30sec，56℃，4min，20个循环，72℃，4min。7.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(4)中，二轮pcr扩增体系包括以下组分：30μl的混合捕获产物，17μl的3x酶混合物，1.25μl的二轮上游引物、1.25μl的二轮下游引物；二轮pcr扩增程序为：95℃，3min，95℃，15sec，58℃，15sec，72℃，30sec，10个循环，72℃，4min。8.根据权利要求1所述的一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，其特征在于：步骤(3)中，片段分选纯化步骤为：s1：取磁珠，室温平衡30～40min，加入浓度为75％的乙醇溶液，混匀，得到纯化磁珠；s2：取dna捕获产物或rna捕获产物，与纯化磁珠混合，室温孵育5min，离心后置于磁力架上，分离5～6min，待溶液澄清后移除上清；s3：加入新鲜的浓度为75％乙醇，漂洗磁珠，室温孵育30sec，移除上清；s4：重复s3步骤2～3次，空气干燥0～5min，取下，加入双蒸水，吹打混匀重悬磁珠，得到带磁珠的重悬dna捕获产物或带磁珠的重悬rna捕获产物；片段纯化分选时，dna捕获产物与纯化磁珠的体积比为1∶1.5；rna捕获产物与纯化磁珠的体积比为1∶1。9.一种用于高通量测序检测肺癌基因变异的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒根据权利要求1～8中任一项所述的文库构建方法检测肺癌基因变异情况。10.根据权利要求9所述的一种用于高通量测序检测肺癌基因变异的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括提取试剂盒模块、扩增捕获试剂盒模块、接头测序试剂盒模块、阳性质控品和阴性质控品；
其中提取试剂盒模块用于提取样品dna和样品rna；扩增捕获试剂盒模块用于一轮pcr扩增捕获，纯化后得到dna捕获产物和rna捕获产物；接头测序试剂盒模块用于二轮pcr扩增引入标签序列，可根据对应的测序平台选择测序引物和接头试剂。

技术总结
本发明公开了一种高通量测序检测肺癌基因变异的文库构建方法，该方法可以通过检测石蜡包埋组织或石蜡切片，新鲜病理组织，血浆、胸水、腹水、脑脊液等样本，一次性全面捕获NSCLC相关的16个具有明确分子靶标意义的基因突变信息(点突变，短片段插入缺失，拷贝数变异和融合基因)，尤其针对融合基因突变检测，基于DNA RNA联合检测，可以更好的找到对应的靶药突变信息，使精准治疗达到最好效果。使精准治疗达到最好效果。使精准治疗达到最好效果。


技术研发人员：吕小星 张剑 袁萌 伍炜康 叶丽曼 何璐 霍然
受保护的技术使用者：武汉弘康健基因诊断技术有限公司
技术研发日：2022.07.20
技术公布日：2023/3/10