一种贝类抗菌肽B2-α及其应用

一种贝类抗菌肽b2-α
及其应用
技术领域
1.本发明属于应用海洋生物技术领域，具体涉及一种贝类抗菌肽b2-α及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)是一类广泛存在于自然界生物体内的小分子多肽物质，对多种细菌、真菌、病毒和寄生虫均具有较好的抑制或者杀伤作用。抗菌肽具有广谱抗菌活性、不易产生耐药性、无残留等特点，是一种潜在的优质抗生素替代品。
3.贻贝抗菌肽因其抗菌活性强，分子多样性丰富而成为海洋生物抗菌肽研究的重要物种。厚壳贻贝（mytilus coruscus）是西太平洋主要的贻贝优势物种，也是我国东海海域最重要的养殖贝类，具有重要经济价值和研究价值。厚壳贻贝具有较强的环境适应性和疾病耐受性，其中抗菌肽分子对厚壳贻贝的免疫防御具有重要意义。通过对贻贝基因组和多肽组测序，结合大规模筛选技术，可以获得结构新颖的抗菌肽，对于抗菌剂和抗菌药物等领域有广阔的应用前景。


技术实现要素：

4.为了弥补现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种贝类抗菌肽b2-α，所述贝类抗菌肽b2-α的氨基酸序列具体为：ser-cys-his-lys-trp-cys-val-arg-trp，如seq id no.1所示。
5.具体的，本发明的贝类抗菌肽b2-α的分子量为1245.49da，等电点为8.94。
6.本发明的第二个目的在于提供上述贝类抗菌肽b2-α在水产饲料添加剂中的应用。
7.本发明的第三个目的在于提供上述贝类抗菌肽b2-α在制备抗细菌类药物中的应用。
8.具体的，所述细菌包括革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌包括巨大芽孢杆菌、金黃葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
9.本发明的第四个目的在于提供一种抗细菌药物，含有上述的贝类抗菌肽b2-α作为活性成分。
10.与现有技术相比，本发明有以下优点：经实施例验证，本发明的贝类抗菌肽b2-α具有较强的抑菌活性，同时溶血活性低，无细胞毒性，稳定性高，具有较好的优势；与许多已知的海洋动物抗菌肽相比，贝类抗菌肽b2-α抗菌效果好，抗菌谱广，具有极大的使用价值，在开发制备抗菌剂方面具有较好的应用；贝类抗菌肽b2-α来源于水产双壳贝类，既可以应用于水产作为饲料添加剂，也可以研制成为抗菌剂和抗菌药物等，因此具有广泛的应用前景。
附图说明
11.图1为本发明贝类抗菌肽b2-α的结构图；图2为本发明固相化学合成贝类抗菌肽b2-α粗品的hplc纯化与分子量质谱鉴定图
像；图3为本发明贝类抗菌肽b2-α抑菌活性表；图4为本发明贝类抗菌肽b2-α对绵羊红细胞的溶血活性测试值；图5为本发明通过mtt法测定贝类抗菌肽b2-α对hek293t的细胞毒性值。
具体实施方式
12.为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合具体实施例以及附图，对本发明一种贝类抗菌肽b2-α及其应用做进一步详细的描述。
13.实施例一：贝类抗菌肽b2-α的获取s1.从厚壳贻贝基因组中筛选具有防御素结构特征的序列，通过生物信息学技术对其序列进行结构与功能预测，在此基础上筛选其结构中与抗菌活性相关的功能肽段，通过结构比较，获得最优化的肽段序列；s2.根据所获得的肽段序列，采用固相化学合成手段获得多肽片段的样品，利用生长曲线抑制法开展肽段的功能分析，判断肽段的抑菌谱，并深入研究其抗菌活性机理。
14.如图1所示，本发明的贝类抗菌肽b2-α有9个氨基酸残基，其含有seq id no.1所示的氨基酸序列，该氨基酸序列具体为：ser-cys-his-lys-trp-cys-val-arg-trp，核苷酸序列为：agttgtcataagtggtgtgtacgctgg，氨基酸序列的单字母缩写的序列为schkwcvrw，贝类抗菌肽b2-α的分子量为1245.49da，等电点为8.94。
15.实施例二：采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上贝类抗菌肽b2-α，贝类抗菌肽b2-α对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抗菌效果。
16.具体的，贝类抗菌肽b2-α的固相合成如下：根据设计的氨基酸序列：leu-arg-cys-his-phe-trp-cys-arg-ser，用固相合成法得到粗多肽，多肽固相化学合成在十二通道半自动多肽合成仪上合成，合成方向为从羧基端向氨基端；将合成后的线性多肽粗品以高效液相色谱仪进行分离纯化，鉴定其纯度。
17.具体的检测条件为：（1）色谱条件为：色谱柱为 c8 反相柱 (4.6
×
250 mm， 5 μm)，洗脱液分别为a液：含0.1%tfa的纯水，b液：含0.1%tfa的乙腈，洗脱梯度为20 min内b液比例由30%上升到65%，20.1min时，流动相a的比例变为100％，流动相b的比例变为0％，以1ml/min的流速进行30min的分离，采用紫外检测器进行检测，检测波长为220 nm，收集洗脱目标峰开展质谱分析；采用质谱对合成后的多肽纯品进行分子量鉴定。（2）质谱检测条件为:气动辅助电喷雾离子化(esi)，毛细管电压为 2.5 kv，检测器电压为 1.5 kv，离子源温度为450 ℃；离子检测方式为选择性离子检测，离子极性为正离子。
18.采用固相多肽合成策略，完成对贝类抗菌肽b2-α的化学合成，合成产物的纯化与鉴定结果分别见图。由图2可见，贝类抗菌肽b2-α合成后经高效液相色谱纯化，其纯度达到90%以上；质谱鉴定结果表明，合成的贝类抗菌肽b2-α分子量为分子量为1245.60d, 与理论分子量1245.49 d一致。
19.实施例三：贝类抗菌肽b2-α的抗菌活性检测
本实施例中所涉及到的菌株有包括革兰氏阳性菌：哈维氏弧菌（vibrio harveyi）、溶藻弧菌（vibrio alginolytica）、副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）、河流弧菌（vibrio fluvialis），革兰氏阴性菌：巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）、金黃葡萄球菌（staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（sarcina lutea）、蜡状芽孢杆菌（bacillus cereus）。
20.试验采用二倍梯度稀释的方法，测定最小抑菌浓度即能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。
21.mic值测定：准备好新鲜菌液，使用紫外分光光度计检测菌液的od600，按照1od600＝1
×
109cfu/ml，用新鲜lb液体培养基将上述菌液浓度稀释调整至2
×
10
5 cfu/ml。之后预先在无菌的96孔板中加入100μl生理盐水，在第一孔内加入待测样品，依次对待测样品进行二倍梯度稀释，再在每孔内加入100μl浓度为2
×
105cfu/ml的菌液，用移液枪将其吹打混匀，混匀后置于37℃恒温培养箱中过夜培养，最后用酶标仪检测菌液在600nm处的光吸收值，以检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度的平均值作为最小抑菌浓度，即mic值。
22.经验证贝类抗菌肽b2-α的抑菌活性如图3所示，其mic值在3.9-250μμ之间。
23.实施例四：贝类抗菌肽b2-α溶血率测定抑制细菌繁殖性能测定：s1.取绵羊血，离心 (1000
ꢀ×
g，10min，4℃)收集红细胞，以pbs缓冲液 (ph 7.4)洗涤3次，之后以pbs缓冲液 (ph 7.4)重悬细胞制备成1% 红细胞悬浮液；s2.合成贝类抗菌肽b2-α以pbs缓冲液(ph 7.4)配置成1 mm浓度，按照1:9比例分别加入抗菌肽溶液和红细胞悬浮液，抗菌肽终浓度分别为100、 50、 25、 12.50、 6.25、 3.13、 1.56 及0.78 μμ浓度梯度，以 pbs缓冲液(含0 μμ抗菌肽)为阴性对照，以 triton x-100为阳性对照；s3.37 ℃培养4 h后取出，经离心 (1000
ꢀ×
g，10 min，4℃)后，上清液转移至96孔板，以酶标仪于波长405 nm处测定吸光度；s4.抗菌肽溶血率按照（检测孔od
405
－阴性孔od
405
）/（阳性孔od
405
－阴性孔od
405
）
×
100%进行计算。
24.如图4所示，抗菌肽溶液与绵羊红细胞悬浮液经孵育， od
405
检测结果表明，与对照组相比，不同浓度的贝类抗菌肽b2-α均未能导致红细胞发生明显溶血现象， 不同浓度的贝类抗菌肽b2-α其溶血率均小于5%。
25.实施例五：贝类抗菌肽b2-α细胞毒性测定使用人胚肾细胞株hek293t测定细胞毒性，具体包括：s1.待细胞生长状态良好且密度长至瓶底的80%时，弃去培养基，用无菌的pbs洗涤3次，随后用胰酶对贴壁细胞进行消化，终止后加入新鲜的含10�s的dmem培养基吹吸混匀，并将细胞悬液浓度调整至5
×
105个ml，实验采用无菌96孔板，在各孔内加入上述细胞悬液200μl，放入细胞培养箱中过夜培养；s2.次日，加入不同浓度的待测样品，浓度涕度设置为500μm、250μm、125μm、62.5μm、31.3μm、15.6μm、7.8μm、3.9μm，每个浓度3个重复，对照组使用相同体积的无菌pbs，随后
放入37℃、5%co2的恒温培养箱中继续培养24小时；s3.在每个子孔内加入5mg/ml的mtt溶液10μl，在避光条件下放入培养箱中继续培养4小时；s4.最后，小心吸取并弃去孔中液体，加入dmso(dimethylsulfoxide)1o0μl，将96孔板放在摇床上缓慢摇晃10分钟待结晶溶解，用酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值。结果如图5所示，贝类抗菌肽b2-α无细胞毒性。
26.通过附图1-5以及上述实施例可知，采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上贝类抗菌肽b2-α，贝类抗菌肽b2-α对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抗菌效果。此外，贝类抗菌肽 b2-α对正常哺乳动物红细胞不具有细胞毒性作用；与许多已知的海洋动物抗菌肽相比，b2-α抗菌效果好、抗菌谱广、具有极大的使用价值，在开发制备抗菌剂方面具有较好的应用。本发明依据厚壳贻贝氨基酸序列，人工合成了一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽，该抗菌肽来源于水产双壳贝类，既可以应用于水产作为饲料添加剂，也可以研制成为抗菌剂和抗菌药物等，因此具有广泛的应用前景。
27.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。