含核酸与阳离子共聚物的复合物的纳米粒子及其制备方法、用于基因转移至细胞中的用途与流程

1.本发明涉及包含与所选的共聚物的核酸复合物的纳米粒子的生产和加工领域。这些复合物可有利地用于将核酸转移至细胞中。


背景技术：

2.ep1499358b1描述了核酸与ph敏感的聚丙烯酸酯的组合。没有公开纳米粒子的生产。该文献中描述的包含(甲基)丙烯酸的共聚物根据ph值而为阴离子性的。没有公开阳离子聚合物。
3.wo2018/130247a1公开了具有载体壳的纳米粒子，该载体壳由疏水壳聚合物、带电络合聚合物和亲水活性成分(包含核酸)组分组成。该文献中描述的系统由至少三种组分组成，具有疏水性和ph依赖性，分为两种不同的材料。该文件中描述的络合聚合物是具有胺官能团的水溶性直链聚合物，所有该聚合物在生理ph值下都是水溶性的。
4.一段时间以来，一直关注在阳离子聚合物作为基因递送载体上。阳离子基团如在侧链上的伯胺、仲胺和叔胺，例如在2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯(dmaema)中或在主链中，正如在直链聚乙烯亚胺(lpei)中发现的那样，它们可以通过静电相互作用结合和缩合遗传物质。这保护遗传物质例如不被核酸酶降解，同时允许它被转运到细胞中。通过将更多的疏水单元引入阳离子水溶性聚合物中，还可以提高基因递送的体外效率，尤其是通过改善与细胞膜的相互作用。
5.已知共聚物包含氨基以及疏水性结构单元。一个实例是聚合物e。这种共聚物用于生产口服药品的包衣。该包衣具有例如掩盖药品味道的作用。这是由2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯(dmaema)、甲基丙烯酸甲酯(mma)和甲基丙烯酸丁酯(bma)衍生的共聚物，也可称为甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物。
6.还已知使用甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物来提高lpei-dna复合物的转染效率(n.kanthamneini,b.yung,r.j.lee,anticancer research 36:81-86(2016))。该文献报道了与lpei(＝直链聚乙烯亚胺)络合的dna和作为添加剂的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物的组合，与单独的lpei相比为低n/p比，对dna基因表达产生协同效应。生产由lpei和(pegfp)-dna(＝编码增强型绿色荧光蛋白的质粒)组合而组成的纳米粒子。还生产了纳米粒子，其中添加甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物。甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物在纳米粒子总质量中的比例相对较低，小于16重量％。该文献报道不可能制备仅由甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物和(pegfp)dna组成的纳米粒子。该文献还指出，单独使用甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物作为阳离子聚合物(即没有lpei)不会引起基因表达。此外，该文献参考了描述在转染实验中使用dna和dmaema均聚物的纳米粒子的研究的早期文献。然而，这些系统的效率不如lpei。
7.在med.chem.commun.2015,6,691-701中，r.jain、p.dandekar、b.loretz、m.koch和c.m.lehr描述了甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物和sirna的纳米粒子。这些颗粒用于沉
默巨噬细胞中的治疗相关基因(基因沉默)。在这项工作中生产的纳米粒子对于结合sirna具有相对低的质量分数。所述的纳米粒子是使用有机溶剂分几步生产的。遗传物质被添加到成品纳米粒子中，因此遗传物质只能结合到纳米粒子的表面，其表现为随着遗传物质添加量的增加，zeta电位的降低和颗粒直径(z-平均值)的增加。载有sirna的阳离子共聚物用于促进sirna转移到巨噬细胞的细胞质中。通过使用高速均化器将在有机溶剂丙酮或乙酸乙酯中的阳离子共聚物溶液引入聚乙烯醇水溶液中以生产纳米粒子。需要稳定剂以确保纳米粒子具有足够的稳定性。代替保护胶体聚乙烯醇，表面活性剂也被用作稳定剂，例如维生素e-tpgs或泊洛沙姆(poloxamer)407。溶剂蒸发后，获得稳定的纳米粒子悬浮液，向其中添加pdna(puc18dna)，然后添加功能性sirna用于稳定。核酸因此可以结合到纳米粒子的表面(静电相互作用)并且形成纳米粒子的核-壳结构。此外，这些聚合物类颗粒含有保护胶体或表面活性剂用于稳定。然而，必须批判性地看待此类稳定剂的使用，因为颗粒特性会受到它们的影响，例如颗粒的表面电荷(或zeta电位)。例如，聚乙烯醇以及其他表面活性剂在高浓度下具有细胞破坏作用，因此导致生产的颗粒后续必须被纯化的情况。尽管也使用了pdna，但此工作并未描述或显示基因表达。
8.a.basarkar和j.singh(pharmaceutical research,vol.26,no.1,jan.2009,72-81)描述了由丙交酯-乙交酯共聚物和甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物的组合制成的纳米粒子。这些颗粒负载有编码小鼠白介素-10基因的质粒。通过将聚合物在有机溶剂二氯甲烷中的溶液引入用磷酸盐缓冲的水溶液中来生产纳米粒子。阳离子共聚物的比例最高为聚合物总量的50重量％。通过超声的声波震荡获得w/o乳液。向其中加入阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵(ctab)并再次进行超声处理，得到w/o/w乳液。蒸发有机溶剂，通过离心分离纳米粒子并除去过量的表面活性剂。然后将纳米粒子冷冻干燥。通过将完成的纳米粒子悬浮在质粒溶液中来负载质粒。核酸因此通过静电相互作用结合到纳米粒子的表面，并且形成纳米粒子的核-壳结构。此外，这些聚合物类的颗粒包含用于稳定的阳离子表面活性剂，该表面活性剂可以在颗粒表面诱导正电荷，从而有助于遗传物质的结合。
9.g.doerdelmann、d.kozlova和m.epple(j.mater.chem.b 2014,2,7123-7131)描述了一种ph-敏感的聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物，用作药物和基因跨细胞膜递送的有效试剂。它描述了直径小于200nm的水包油包水的乳液形式的磷酸钙/甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物纳米粒子系统。这些颗粒是通过使磷酸钙纳米粒子负载sirna来生产的，即痛过混合乳酸钙和磷酸氢铵的水溶液，并且在剧烈搅拌下将它们添加到抗egfp sirna的水溶液中。纳米粒子分散体由抗-egfp-sirna包裹的磷酸钙核心形成。然后通过将悬浮液添加到共聚物的二氯甲烷溶液中，将这些纳米粒子包封在甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物中。加入牛血清白蛋白(bsa)水溶液后，用超声波对其进行超声处理以形成初级w/o乳液。将其倒入加入聚乙烯醇作为分散剂的水中，并再次用超声波进行超声处理。剧烈搅拌3小时后，二氯甲烷蒸发，形成被甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物的壳体包围的具有磷酸钙/抗egfp-sirna的核壳结构的纳米粒子。
10.已知的颗粒包含甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物与核酸的组合，因此具有核-壳结构，其中核酸位于聚合物核或无机材料核的表面上，或者核酸被甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物包围，即未结合；或甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯共聚物与过量的lpei结合。这些已知的纳米粒子通常还含有表面活性剂或保护胶体作为稳定剂，该稳定剂可以影响电荷以及
遗传物质与细胞的相互作用。
11.现已令人惊奇地发现，可以生产含有核酸和选定的阳离子共聚物的复合物的纳米粒子，其中与通过已知方法生产的复合物相比，核酸通过阳离子共聚物更好地络合和缩合。这尤其表现为，与常规生产的纳米粒子相比，根据本发明生产的纳米粒子的颗粒直径更小，特别是具有高比例的遗传物质。


技术实现要素：

12.本发明的一个目的是提供具有紧凑和简单结构以及高含量的核酸-共聚物复合物的纳米粒子，并且其非常适合于核酸的基因递送。
13.本发明的另一个目的是提供核酸共聚物纳米粒子，优选其不含任何稳定剂。
14.本发明的另一个目的是提供纳米粒子生产方法，该方法不需要有机溶剂，可以简单、快速和可重复地进行，并且产生具有高基因递送效率的核酸-共聚物复合物。
15.本发明涉及纳米粒子，包含由核酸和含有式(ia)和(ib)的重复结构单元的阳离子共聚物形成的复合物，
[0016][0017]
其中，
[0018]
r1和r6相互独立地为氢、烷基或-coor9；
[0019]
r2和r7相互独立地为氢或烷基；
[0020]
r3选自-o-r
10-、-coo-r
10-、-conh-r
10-或-r
10-所组成的组；
[0021]
r4是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基或烷基芳基，
[0022]
r5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、烷基芳基或-(亚烷基-nh-)
m-烷基，或
[0023]
r4和r5与它们共有的氮原子一起形成杂环；
[0024]
r8选自由-o-r
11
、-coo-r
11
、-conh-r
11
或-r
11
所组成的组；
[0025]
r9和r
11
相互独立地为氢或一价有机基团；
[0026]r10
是二价有机基团；和
[0027]
m是1至5的整数，其要求是纳米粒子通过动态光散射确定的直径(z-平均值)小于或等于900nm，并且所述共聚物中的氮原子与所述核酸中的磷酸基团的摩尔比为1～200。
[0028]
在根据本发明的纳米粒子中，dna和/或rna及其修饰物可以用作核酸。
[0029]
可以使用任何类型的dna。实例为a-dna、b-dna、z-dna、mtdna、反义dna、细菌dna和病毒dna。
[0030]
也可以使用任何类型的rna。实例包含hnrna、mrna、trna、rrna、mtrna、snrna、snorna、scrna、sirna、mirna、反义rna、细菌rna和病毒rna。
[0031]
dna和rna的组合也可以用于根据本发明的复合物中。
[0032]
根据本发明的复合物中使用的阳离子共聚物是包含至少一种式(ia)的重复结构
单元的共聚物，其衍生自包含氨基的烯键不饱和单体，并且其包含至少一种式(ib)的重复结构单元，优选式(ib)的至少两种不同结构单元，其衍生自包含烃基的烯键不饱和单体。
[0033]
用于根据本发明的配合物的阳离子共聚物可以包含式(ia)的一种或多种不同重复结构单元。优选地，这些共聚物仅包含式(ia)一种类型的重复结构单元。
[0034]
用于根据本发明的配合物的阳离子共聚物可以包含式(ib)的一种或多种不同重复结构单元。优选地，除了式(ia)的重复结构单元之外，这些共聚物仅包含式(ib)的一种或两种不同类型的重复结构单元。
[0035]
除了式(ia)和(ib)的重复结构单元之外，用于根据本发明的配合物中使用的阳离子共聚物可以包含另外的式(ic)的重复结构单元：
[0036][0037]
其中，
[0038]r12
、r
13
和r
14
相互独立地为氢或烷基，优选为氢或c
1-c6烷基，特别优选为氢或甲基；和
[0039]
bg表示具有醚、酯、酰胺、硫化物、磷酸酯或二硫化物基团的二价有机桥连基团。
[0040]
根据本发明使用的共聚物中式(ic)结构单元的存在赋予其改善的生物降解性。
[0041]
衍生出式(ic)的重复结构单元的聚合物实例是聚酯、聚酰胺、聚醚、磷酸酯、硫化物或二硫化物，每个都具有两个带有烯键不饱和基团的端基，例如乙烯基或烯丙基。
[0042]
基团r1、r2、r
4-r7和r
12-r
14
可以表示烷基。这些通常是具有1～6个碳原子的烷基，该烷基可以是直链或支链的。优选甲基和乙基，特别是甲基。
[0043]
基团r4和r5可以表示环烷基。这些通常是具有5～6个环碳原子的环烷基。特别优选环己基。
[0044]
基团r4和r5可以表示芳基。这些通常是具有5～10个环碳原子的芳烃基团。优选苯基。
[0045]
基团r4和r5可以表示烷基芳基。这些通常是被一个或两个烷基取代的芳基。优选甲苯基。
[0046]
基团r4和r5可以表示芳烷基。这些通常是芳基通过亚烷基与分子的其余部分连接。优选苄基。
[0047]
r5也可以是式-(亚烷基-nh-)
m-烷基的基团。因此，亚烷基通常具有2～4个碳原子，并且可以是支链，或优选直链。烷基通常具有1～4个碳原子，并且优选乙基或甲基，特别是甲基。重复单元的数量以指数m来表示，为1～5，优选1～3。
[0048]
r4和r5还可以与它们共有的氮原子一起形成杂环。这些通常是总共有5至6个环原子的环，其中1个或2个环原子是杂原子，其余环原子是碳原子。环杂原子之一是氮原子。如果存在，另外的环杂原子是氮、氧或硫。
[0049]
r9和r
11
可以相互独立地为一价有机基团。这些是具有与其余分子建立连接的共价键的有机基团。一价有机基团通常是烷基、环烷基、芳基、烷基芳基或芳烷基。
[0050]r10
是二价有机基团。这些是具有与其余分子建立连接的两个共价键的有机基团。二价有机基团通常是亚烷基、环亚烷基、亚芳基、烷基亚芳基或亚芳烷基。
[0051]
优选地，使用如下共聚物，其中r1和r6相互独立地表示氢或c
1-c6烷基，特别是氢或甲基，并且非常特别优选是氢。
[0052]
优选地，使用如下共聚物，其中r2和r7相互独立地表示氢或c
1-c9烷基，特别是氢或c
1-c6烷基，特别优选氢或甲基，并且特别优选是甲基。
[0053]
优选地，使用如下共聚物，其中r3是式-o-r
10-、-coo-r
10-、-conh-r
10-或-r
10-的二价基团，并且r
10
选自由c
2-c
12
亚烷基、c
5-c7亚环烷基和c
6-c
10
亚芳基所组成的组，特别是c
2-c6亚烷基，非常特别地优选是亚乙基。
[0054]
优选地，使用如下共聚物，其中r4和r5相互独立地表示氢或c
1-c6烷基，特别是氢或甲基，并且非常特别地优选是甲基。
[0055]
优选地，使用如下共聚物，其中r8是式-o-r
11
、-coo-r
11
、-conh-r
11
或-r
11
的一价基团，并且r
11
是烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基或烷基芳基，特别是c
1-c6烷基、乙烯基、烯丙基、苯基、苄基或c
1-c6烷基苯基，非常特别地优选是c
1-c6烷基。
[0056]
特别优选地，使用如下共聚物，其中r8表示-coo-r
11
或-conh-r
11
，并且r
11
表示c
1-c6烷基、苯基、苄基或c
1-c6烷基苯基，非常特别地优选是c
1-c6烷基，并且极其优选是甲基、乙基、丙基和/或丁基。
[0057]
优选地，使用如下共聚物，其中r9和r
11
相互独立地表示烷基、环烷基、芳基、芳烷基或烷基芳基，特别是c
1-c6烷基、苯基、苄基或c
1-c6烷基苯基，并且非常特别地优选是c
1-c6烷基。
[0058]
优选地，使用如下共聚物，其中r
10
表示c
2-c
12
亚烷基、c
5-c7亚环烷基和c
6-c
10
亚芳基，特别是c
2-c6亚烷基，并且非常特别优选是亚乙基。
[0059]
特别优选地，使用包含式(ia)的重复结构单元和式(ib)的两种不同的重复结构单元的共聚物，其中r1和r6表示氢，r2和r7相互独立地是氢或甲基，特别是甲基，r3是-coo-r
10-，r
10
表示亚乙基，r4和r5相互独立地是c
1-c6烷基，特别是甲基，并且r8是-coo-r
11
，其中，在式(ib)的重复结构单元中，r
11
为c
1-c3烷基，特别是甲基，并且在式(ib)的另一种重复结构单元中，r
11
是c
4-c6烷基，特别是正丁基。
[0060]
假设根据本发明的致密纳米粒子包含分布在纳米粒子的整个体积上的核酸-共聚物复合物。与之前已知的具有明显的核-壳结构并且具有核酸-聚合物复合物集中于外壳中的纳米粒子相反，在根据本发明的纳米粒子中，核酸-共聚物复合物存在于纳米粒子的内部和外部区域。这样的纳米粒子在下文中也称为“多聚复合物”。
[0061]
根据本发明的纳米粒子的特征还在于高含量的核酸。基于纳米粒子的总质量，在根据本发明的纳米粒子中包含式(ia)和(ib)的重复结构单元的阳离子共聚物的重量比通常为15～99％，优选20～90％，特别是30～80％。
[0062]
根据本发明的纳米粒子可以通过它们的颗粒直径来表征。典型的颗粒直径(例如z平均值)在小于或等于900nm的范围内，优选小于或等于500nm，特别优选30nm至500nm，非常特别地优选40nm至250nm，尤其是50nm至200nm。为了本说明书的目的，使用马尔文纳米粒度电位仪(马尔文仪器，伍斯特郡，英国)通过动态光散射(dls)确定颗粒直径。相关函数(iso13321、iso22412)的累积量分析用于确定强度加权平均直径(例如z平均值)。对于颗粒
大小，假设超纯水的折射率为1.33，共聚物的折射率为1.59。
[0063]
颗粒直径也可以通过其他方法确定，例如通过纳米尺寸跟踪分析(nta)，或通过电子显微镜，例如使用透射电子显微镜或扫描电子显微镜。
[0064]
根据本发明优选纳米粒子的通过动态光散射(dls)测定的颗粒直径(z-平均值)在50至200nm范围内。
[0065]
根据本发明使用的阳离子共聚物和根据本发明的纳米粒子可以通过它们的多分散指数(或pdi)进一步表征。分子量的多分散性指数或pdi
mw
是聚合物分子量分布宽度的量度。多分散性指数或pdi
mw
是根据分子量分布的质量平均与数量平均的比值计算的。越大，分子量分布越宽。在分子量分布非常窄的情况下，pdi
mw
的值趋向于1。在分子量分布较宽的情况下，pdi
mw
的值明显大于1。
[0066]
另一方面，颗粒大小分布的多分散性指数pdi
tg
表示颗粒的颗粒大小分布的宽度。因此可以假定数值在0(单分散)和1(多分散)之间。为了本说明书的目的，使用马尔文纳米粒度电位仪(马尔文仪器，伍斯特郡，英国)通过动态光散射(dls)确定pdi
tg
的值。pdi
tg
是通过相关函数的累积量分析确定的。
[0067]
根据本发明的纳米粒子的颗粒大小分布的pdi
tg
值通常范围为0.05～0.4，优选为0.1～0.4，并且特别优选为0.1～0.3。
[0068]
根据本发明使用的阳离子共聚物的分子量分布的多分散指数通常范围为1.0～5.0，优选为1.01～2.6。
[0069]
根据本发明的纳米粒子可以通过它们对dna的转染效率来表征。为此，使包含选定的蛋白质编码dna(例如egfp编码dna)的纳米粒子与细胞接触预定时间，例如1小时，并进行培养。然后将细胞在不含纳米粒子的生长培养基中培养23小时，之后确定有多少细胞表达该选定的蛋白质。表达细胞的比例(指定为百分比)用于表示dna的转染效率。
[0070]
在培养1小时后，根据本发明的优选的纳米粒子表现出dna转染效率为15％～50％(活荧光细胞)，特别是20％～45％。
[0071]
根据本发明的纳米粒子可以通过它们的n/p比进一步表征。这是共聚物中的氮原子与核酸中的磷酸基团的摩尔比。
[0072]
根据本发明的纳米粒子中的n/p比可以在大范围内变化。通常，根据本发明的纳米粒子中的n/p比为1～200，优选为1～100，特别是1～50，特别优选为1～30，非常特别地优选为2.5～100，极其优选为5～50，最优选为5～30。
[0073]
根据本发明的优选纳米粒子具有40～250nm，特别是50～200nm的通过dls测定的直径(z-平均值)，以及0.1～0.3的颗粒直径的多分散指数。
[0074]
根据本发明的非常特别优选的纳米粒子具有40至250nm，特别在50至200nm的通过dls测定的直径(z-平均值)，和0.1至0.3的颗粒直径的多分散指数，和10至30的n/p比。
[0075]
基于总的阳离子共聚物，在根据本发明使用的阳离子共聚物中式(ia)的重复结构单元的摩尔比例通常为10％～75％，优选为15％～65％，非常优选为20％～55％。
[0076]
基于总的阳离子共聚物，在根据本发明使用的阳离子共聚物中式(ib)的重复结构单元的摩尔比例通常为90％～25％，优选为85％～45％，非常优选为80％～45％。
[0077]
基于总的阳离子共聚物，在根据本发明使用的阳离子共聚物中式(ic)的重复结构单元的摩尔比例通常为0～25％，优选为1～10％，非常优选为5～10％。
[0078]
优选地，根据本发明使用的纳米粒子不含任何赋形剂或添加剂，特别是无保护胶体和/或表面活性剂。
[0079]
在根据本发明的纳米粒子包含额外的聚合物或核酸与额外聚合物的额外配合物的情况下，例如核酸与lpei的复合物，除了上述的核酸-共聚物复合物之外，这些其他成分仅少量的存在，例如它们的重量比为15％以下，特别是小于5％。
[0080]
特别优选地，除了上述核酸共聚物复合物之外，根据本发明的纳米粒子不含任何核酸与其他聚合物的其他配合物。
[0081]
在本说明的上下文中，术语“粒子”[德语：teilchen/partikel：粒子]作为同义词使用。
[0082]
在本说明书的上下文中，“纳米粒子”被理解为是其直径(z-平均值)小于或等于900nm，并且可以由阳离子共聚物以及其与核酸的复合物或仅由该复合物组成的颗粒。它们通常以非常高的表面积与体积之比和因此具有非常高的化学反应性为特征。纳米粒子可以仅由上述阳离子共聚物和复合物或仅由复合物组成，或者还可以包含除共聚物和复合物之外的其他组分，例如活性剂或赋形剂或添加剂。
[0083]
在本说明书的上下文中，“共聚物”被理解以至少两种不同的特定单元(单体单元或重复单元)的重复为特征的上述有机化合物。共聚物通过具有共价键形成(聚合)的单体化学反应来产生，并通过连接聚合单元形成所谓的聚合物主链。其可以具有侧链，官能团可以位于该侧链上。根据浓度，一些共聚物具有疏水性并且可以在水性环境中形成纳米级结构(例如纳米粒子、胶束、囊泡)。共聚物由至少两种，优选三种不同的单体单元组成，它们可以统计学地排列，如梯度或交替排列。
[0084]
在本说明书的上下文中，“表面活性剂”被理解为非聚合物质或具有水溶性和水不溶性的物质的混合物，并且在水性介质中的生产和储存期间用于稳定颗粒。在颗粒的生产过程中，它们通常被添加到分散介质(例如水相)中，但也可以在它们生产之后加入以稳定所获得的分散体。例如，阳离子表面活性剂可以添加到纳米粒子的表面以改变它们的表面电荷，从而使核酸能够结合在表面上，例如通过涂覆ctab(溴化十六烷基三甲铵)。
[0085]
在本说明书的上下文中，“保护胶体”被理解为水溶性或水分散性聚合物或聚合物混合物，其在水性介质中的生产和储存期间用于稳定颗粒。在颗粒的生产过程中，它们通常被添加到分散介质(例如水相)中，但也可以在它们生产之后加入以稳定所获得的分散体。
[0086]
在本说明书的上下文中，“水溶性化合物”或“水溶性聚合物”被理解为在25℃和中性ph值下溶解至少1g/l水的化合物或聚合物。
[0087]
在本说明书的上下文中，“赋形剂和添加剂”被理解为添加到制剂中以赋予其某些附加特性和/或促进其加工的物质。赋形剂和添加剂的实例是示踪剂、造影剂、载体、填充剂、颜料、染料、香料、增滑剂、紫外线稳定剂、抗氧化剂或表面活性剂。特别地，“赋形剂和添加剂”被理解为任何药理学上可接受的和治疗上有用的物质，该物质不是药物活性剂，但可以与核酸一起配制在核酸-共聚物配合物中以影响，特别是改善纳米粒子的品质特性。优选地，赋形剂和/或添加剂对预期程序没有影响或没有显著影响或至少没有不良影响。
[0088]
在本说明书的上下文中，“基因递送”被理解为将核酸引入细胞并在细胞中释放它们的功能。
[0089]
根据本发明的纳米粒子可以作为粉末以固体形式存在，或者它们可以形成分散体
并分散在水性溶剂中，所述颗粒以固体形式存在于分散介质中。
[0090]
在优选的实施方案中，根据本发明的纳米粒子在水中或在缓冲水溶液中形成分散相。
[0091]
根据本发明使用的共聚物的溶解度可以受到合适单体的共聚合以及受到官能化的影响。这样的技术是本领域技术人员已知的。
[0092]
根据本发明的纳米粒子的比例在分散体中可以涵盖广泛的范围。通常，分散体中纳米粒子的重量比例为0.01％～20％，优选为0.05％～5％。
[0093]
根据本发明使用的有机共聚物可以涵盖广泛的摩尔质量范围。典型的摩尔质量(mn)范围为2,000～500,000g/mol，特别是5,000～50,000g/mol。这些摩尔质量可以通过溶解的共聚物的1h-nmr光谱测定。特别地，可以使用分析型超速离心机或色谱法，例如排阻色谱法，来确定摩尔质量。
[0094]
优选的有机共聚物具有在5,000～40,000g/mol范围内的平均摩尔质量(数均)，通过1h-nmr光谱或通过使用分析型超速离心机测定。
[0095]
根据本发明使用的阳离子共聚物可以使用常用的聚合方法制备。实例为物质聚合、溶液聚合或乳液或悬浮聚合。这些方法是本领域技术人员已知的。
[0096]
根据本发明的纳米粒子可以通过纳米沉淀制备。为此，将根据本发明使用的阳离子共聚物由于存在极性基团而根据ph值呈亲水性，该共聚物溶解在水或缓冲水溶液中。将水溶液的ph调节至3～6.5的值，例如通过使用醋酸盐缓冲液或另一种合适的缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液。此外，将核酸溶解在水中，由此优选将核酸水溶液的ph值优选地调节至6.5～8.5的值，特别优选调节至6.8～7.5的值。包含hepes、tris、bis-tris-丙烷或仅含盐的缓冲溶液特别适合此目的。合并两种溶液，由此选择核酸和阳离子共聚物的量，以此获得所需的n/p比。混合两种溶液后，搅拌混合物例如短的时间，例如2～20秒。这可以通过搅拌和/或涡旋来完成。优选地，在进一步使用之前将所得纳米粒子静置一段时间，例如5～20分钟，以允许聚合物和核酸之间的结合(下文称为“培养”)。根据本发明的纳米粒子以精细分散的形式沉淀在分散介质中。
[0097]
除了阳离子共聚物和核酸之外，在分散介质中的纳米沉淀过程中，可能存在一种或多种赋形剂和添加剂。或者，可以在核酸共聚物复合物分散在水相中之后，添加这些赋形剂和添加剂。
[0098]
水用作分散介质。可以向其中添加缓冲物质、盐、糖或酸和碱以调节所需的ph值或渗透压。
[0099]
本发明还涉及一种用于生产纳米粒子的方法，包括以下步骤：
[0100]
i)制备包含上述式(ia)和(ib)重复结构单元的阳离子共聚物的且ph为3～6.5的水溶液；
[0101]
ii)制备核酸水溶液；
[0102]
iii)将在步骤i)和ii)中所制备的两种溶液以选定的核酸与共聚物的数量比混合，以获得共聚物中的氮原子与核酸中的磷酸基团的所希望的摩尔n/p比，即n/p比值为1～200；
[0103]
iv)搅拌步骤iii)的混合物；以及
[0104]
v)随后视情况，培养所获得的混合物。
[0105]
根据本发明的方法的步骤i)的阳离子共聚物水溶液优选包含缓冲液，特别是醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液或其混合物。
[0106]
根据本发明的方法的步骤ii)中的核酸水溶液优选具有6.5～8.5，特别是6.8～7.5的ph值。
[0107]
根据本发明方法的步骤ii)中的核酸水溶液优选包含缓冲液，特别是hbg、hepes、bis-tris丙烷或tris缓冲液。
[0108]
根据本发明方法的步骤iv)中的搅拌优选通过搅拌或涡旋进行。该步骤的处理时间通常为1～60秒，特别是2～20秒。
[0109]
根据本发明方法的步骤v)中的培养通常通过简单地将所获得的混合物静置例如5至60分钟、优选5至20分钟的一段时间来进行。该混合物也可以在烘箱中培养，例如在30至80℃的温度下培养。
[0110]
纳米粒子与水相的分离可以多种方式实现。实例是离心、超滤或透析。然而，纳米粒子的分散体也可以优选在生产后直接使用，而无需进一步处理。
[0111]
通过过滤进行纯化可以从分散体中分离颗粒，例如聚集体，但也可以分离出过量的赋形剂或杂质。颗粒浓度可以由此改变。
[0112]
通过透析纯化可以将溶解的分子从分散体中分离。该方法在很大程度上与分散颗粒的颗粒大小无关。
[0113]
通过离心纯化也可以将溶解的分子从分散体中分离。然而，该方法也降低了分散颗粒的浓度。此外，只有具有较大直径纳米粒子的分散体，例如大于150nm，可以进行处理并且颗粒可能会受到影响。此外，以这种方式获得的颗粒进行再分散会造成困难。
[0114]
根据本发明的纳米粒子非常适合于细胞中的基因递送，即用于将核酸引入细胞中。为此，将包含核酸的纳米粒子添加到单个细胞、组织或细胞培养物中，并通过细胞吞噬现象被细胞吸收。令人惊奇的是，已经显示高含量的核酸可以通过根据本发明的纳米粒子转移到细胞中。可以使用包含相对低的阳离子共聚物含量的纳米粒子。
[0115]
因此，本发明还涉及一种将基因递送至细胞的方法，其包括以下步骤：
[0116]
a)使细胞与包含上述纳米粒子的水性悬浮液接触；以及
[0117]
b)随后培养。
[0118]
优选地，本发明涉及将基因递送至细胞的方法，其包括以下步骤：
[0119]
c)在生物反应器或培养箱中提供细胞培养物；
[0120]
d)添加包含上述纳米粒子的水性悬浮液；
[0121]
e)将水性悬浮液分布在细胞培养物中；以及
[0122]
f)随后培养。
[0123]
根据本发明的基因递送方法可以使用多种细胞进行，例如通过使用单细胞、组织或细胞培养物。
[0124]
因此，根据本发明的纳米粒子可以与原核细胞、与来自真核细胞的组织或与细胞培养物结合。这些可以是植物细胞或优选动物细胞，包括人类细胞。
[0125]
根据本发明纳米粒子的应用可以发生在体内，例如在皮肤下或肌肉中，或者该应用也可以发生在体外，例如与免疫细胞，如在car-t疗法中。它也可以是rna疫苗接种或免
疫。
[0126]
在本说明书的上下文中，“细胞”被理解为有机体的最小生命单位。它们可以是单细胞或多细胞生物的细胞，可能起源于原核生物或真核生物。细胞可以是微生物或单细胞。细胞可以是原核、植物或动物来源的，或者也可以来源于真菌。优选地，使用真核细胞，特别是最初从组织中分离、可以永久培养的真核细胞，即永生化细胞。
[0127]
在本说明书的上下文中，“组织”被理解为分化细胞的集合，包含它们的细胞外基质。
[0128]
在本说明书的上下文中，“细胞培养物”是指细胞和细胞培养基的组合，其中细胞培养在生物体外的细胞培养基中。为此，使用细胞系，即可以在培养过程中分裂的组织类型的细胞。永生化(永生)细胞系和原代细胞(原代培养)均可培养。原代培养通常被理解为是指直接从组织获得的非永生化细胞培养。
[0129]
在本说明书的上下文中，“细胞培养基”或“营养培养基”被理解为是指用作细胞培养平台的水性体系。这些体系包含细胞生长和生存所需的所有物质。
[0130]
除了细胞和所需的营养物之外，细胞培养基还可以包含血清。优选地，细胞培养基包含血清或蛋白质和生长因子。
[0131]
在本说明书的上下文中，“血清”被理解为是指血液血清或免疫血清。血液血清因此被理解为血液的液体部分，当血液样本被离心时作为上清液获得。该上清液包含除凝血消耗的凝血因子外的所有自然溶解在血液中的物质。因此，血液血清对应于减去凝血因子的血浆。免疫血清被理解为从免疫哺乳动物的血液血清中获得的特异性抗体的纯化物。
[0132]
本说明书上下文中的血清通常是指来自脊椎动物的血清，特别是来自小牛、母牛、公牛、马或人的血清。
[0133]
根据本发明使用的细胞培养物可以根据标准方法生产和培养。
[0134]
例如，可以从各种组织中创建原代培养物，例如从单个器官的组织，例如皮肤、心脏、肾脏或肝脏，或来自肿瘤组织。组织细胞可以通过本身已知的方法分离，例如通过蛋白酶处理，降解维持细胞结合的蛋白质。在可能合适的情况下，通过添加生长因子，或在细胞类型生长不良的情况下，使用饲养细胞、基底膜样基质或重组细胞外基质成分，来特异性刺激某些细胞类型分裂。根据本发明使用的细胞也可以通过引入质粒作为载体进行遗传修饰。
[0135]
根据本发明使用的细胞可能具有有限的使用寿命或者它们可以是具有无限分裂能力的永生细胞系。这些可能是由随机突变产生的，例如在肿瘤细胞中，或通过靶向修饰，例如通过端粒酶基因的人工表达。
[0136]
根据本发明使用的细胞可以是贴壁细胞(在表面上生长)，例如成纤维细胞、内皮细胞或软骨细胞，或者它们可以是在营养培养基中自由漂浮生长的悬浮细胞，例如淋巴细胞。
[0137]
根据培养的单个细胞，来选择培养条件和细胞培养基。因此，不同的细胞类型优选不同的营养培养基，这些营养培养基是专门组成的。例如，建立不同的ph值并且各个营养培养基可以包含各种浓度的多种氨基酸和/或其他营养物。
[0138]
根据本发明转染的细胞可用于多种领域，例如生物技术、研究或医学。这可能涉及(重组)蛋白质的生产、病毒和/或病毒颗粒的生产、代谢研究、分裂研究和其他细胞过程的
研究。此外，根据本发明转染的细胞可用作测试系统，例如在研究物质对细胞特性如信号转导或毒性的影响。优选用于根据本发明转染细胞生产的其他细胞是干细胞。这些已知是可以分化成多种细胞类型或组织的体细胞。
[0139]
本发明还涉及上述纳米粒子将基因递送到细胞中的用途，即用于将核酸引入细胞中的用途。
具体实施方式
[0140]
以下实施例说明本发明而不限制本发明。
[0141]
以下描述了通过raft聚合合成聚合物，该聚合物与市售产品e100相当。研究聚合物对核酸结合的适用性，并描述核酸包封和配制的新方法。
[0142]
缩写
[0143]
实施例中使用了以下缩写：
[0144]
cpaetc：4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸
[0145]
nbma：甲基丙烯酸正丁酯
[0146]
mma：甲基丙烯酸甲酯
[0147]
dmaema：2-(n,n-二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯
[0148]
acva：4,4'-偶氮双-(4-氰基戊酸)
[0149]
dmac-sec：使用二甲基乙酰胺 0.21％ licl作为洗脱剂的排阻色谱法
[0150]
cta：链转移剂
[0151]
pdna：megfp-n1质粒(编码egfp)；pkmyc质粒(对照质粒)
[0152]
hepes：2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸
[0153]
hbg：具有hepes缓冲的5％葡萄糖溶液
[0154]
dmem：杜氏改良伊格尔培养基
[0155]
hbss：根据汉克斯(hanks)的盐溶液
[0156]
fbs：胎牛血清
[0157]
egfp：增强型绿色荧光蛋白
[0158]
lpei：线性聚乙烯亚胺
[0159]
pdmaema：均聚2-(n,n-二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯
[0160]
pbmd：nbma-st-mma-st-dmaema共聚物(st＝统计学分布)
[0161]
pdi：使用马尔文纳米粒度电位仪(马尔文仪器，伍斯特郡，英国)通过dls应用相关函数(iso13321、iso22412)的累积量分析确定多分散指数。
[0162]
rfi：相对荧光强度
[0163]
ctrl：以仅用hbg缓冲液而非共聚物处理的细胞形式为对照
[0164]
e100：e100(粉末状)
[0165]
材料和方法
[0166]
后续实验中使用了以下材料：
[0167]
e100：粉末形式的e100
[0168]
pdna(egfp，pkmyc)：megfp-n1质粒(编码egfp)，pkmyc质粒(对照质粒，不编码荧光蛋白)
[0169]
细胞：人胚肾(hek)细胞，特别是hek293t细胞系。
[0170]
琼脂糖：琼脂糖-hr 级别
[0171]
raft聚合过程中产生的聚合物的分子量计算
[0172]
单体转化率(p)是通过将乙烯基谱带(5.5-6.3ppm)的积分与外部参考(1,3,5-三烷，5.14ppm)聚合前(t＝0)和聚合后(t＝final)比较，由1h-nmr数据计算得出。然后使用以下公式计算理论数均摩尔质量(m
n,th
)：
[0173]mn,th
＝(([m]0*p*mm)/[cta]0) m
cta
[0174]
其中[m]0和[cta]0分别为单体和cta的初始浓度，mm和m
cta
分别为单体和cta的分子量，p为单体转化为cta的转化率。
[0175]
聚合物和纳米粒子聚合物颗粒或纳米粒子dna-聚合物复合物的生产和表征
[0176]
实施例1a：通过raft聚合(st＝统计学分布)合成(nbma-st-mma-st-dmaema)共聚物(pbmd)
[0177]
cpaetc(130.7mg，4.96
×
10-4
mol)、nbma(3.5265g，2.48
×
10-2
mol)、mma(2.5218g，2.52
×
10-2
mol)、dmaema(7.8165g，4.97
×
10-2
mol)、1,4-二烷(6.2113g)、1.0重量％的acva在1,4-二烷的溶液(1.436g，14.36mgacva，5.12
×
10-5
mol)和1,3,5-三烷(外nmr标准，23.7mg)被引入配备有磁力搅拌器的20ml微波小瓶中。通过用氩气鼓泡10分钟使溶液脱氧。将小瓶密封，置于70使油浴中并搅拌21小时，在预定时间取样用于1h-nmr和dmac-sec分析。聚合物从thf中沉淀三次到冷己烷中，并减压干燥，得到黄色固体。dmac-sec：m
n,sec
＝25.1kg mol-1
，
[0178]
实施例1b：raft聚合合成dmaema均聚物
[0179]
cpaetc(50.0mg，1.9
×
10-4
mol)、dmaema(4.54g，2.88
×
10-2
mol)、1,4-二烷(2.5g)、1.0重量％的acva在1,4-二烷的溶液(426mg，1.5
×
10-5
mol)和1,3,5-三烷(外nmr标准，21mg)被引入具有磁力搅拌器的20ml微波小瓶中。将小瓶密封，通过用氩气鼓泡约10分钟使溶液脱氧。将小瓶置于设定为70使的油浴中并搅拌7小时，在预定时间取样用于1h-nmr和chcl
3-sec分析。聚合物从thf中沉淀三次到冷己烷中，并减压干燥，得到黄色固体。chcl
3-sec：m
n,sec
＝14.2kgmol-1
，
[0180]
图1a显示共聚物e100的结构。
[0181]
图1b显示根据实施例1a的raft聚合表示的共聚物的结构。
[0182]
图2显示通过排阻色谱法(sec)测定，共聚物e100和根据实施例1a的raft聚合表示的共聚物的分子量分布。
[0183]
实施例v1：纳米粒子的形成和与pdna的络合作用(非根据本发明)
[0184]
为了形成纳米粒子，将实施例1中生产的共聚物溶解在2.5ml的丙酮(2mgml-1
)中。将聚合物溶液手动滴入5ml超纯水中，将所得纳米粒子悬浮液以800rpm搅拌过夜，以除去有机溶剂，并在4拌下储存直至使用。为了达到相应的n/p比，在丙酮相和随后的纳米粒子形成期间，该形成过程中以不同浓度添加pdna，或者将在不同浓度的pdna添加到最终颗粒悬浮液中。
[0185]
实施例2：纳米粒子共聚物-核酸复合物的形成(根据本发明)
[0186]
根据实施例1生产的共聚物储备溶液通过溶解在0.2m醋酸盐缓冲液(ph5.8)中制备。将pdna、sirna或mrna溶解在超纯水中。为了生产核酸-聚合物复合物，在hbg缓冲液(20mm hepes、5％葡萄糖(w/v)、ph7.4)或在20mm hepes缓冲液中制备不同稀释度的共聚物以及核酸，以达到各自的n/p比(共聚物中的氮原子与核酸中的磷酸基团的摩尔比)。将共聚物溶液和核酸溶液混合后，立即将混合物涡旋10秒。在使用前，将所得共聚物-核酸配合物在室温下培养至少15分钟。
[0187]
图3示意性地显示由根据实施例1a(dmaema:bma:mma＝2:1:1)的共聚物在纳米粒子中形成核酸-共聚物复合物。
[0188]
阳离子和疏水共聚物的使用导致遗传物质的结合、稳定和保护；稳定的纳米粒子的形成；对竞争性聚阴离子的稳定性，以及被细胞摄取后引起内体释放。
[0189]
实施例3：表征纳米粒子和纳米粒子共聚物-pdna复合物的一般规则
[0190]
实施例3a：通过动态或电泳光散射(dls，纳米粒度电位仪，马尔文仪器，伍斯特郡，英国)确定纳米粒子和pdna-共聚物复合物的直径(z-平均值)和zeta电位。对于大小的测定，假设超纯水的折射率为1.33，共聚物的折射率为1.59。在有机溶剂存在下通过沉淀产生的纳米粒子的zeta电位在相同样品上测定。
[0191]
实施例3b：凝胶阻滞分析
[0192]
通过琼脂糖凝胶电泳测定不同n/p比下pdna的结合能力。如实施例v1和2中的pdna-聚合物复合物所述制备样品，在用溴化乙锭(etbr，0.1μg ml-1
)染色的1％琼脂糖凝胶上以80v运行1.5小时，并使用凝胶成像仪(red
tm
成像系统，alpha innotech公司，卡森多夫，德国)成像。
[0193]
实施例3c：溴化乙锭结合试验(eba)和肝素释放试验(hra)
[0194]
通过使用溴化乙锭结合试验和肝素释放试验，研究纳米粒子共聚物-pdna配合物的pdna络合作用和稳定性。
[0195]
为此，将浓度为15μg ml-1
的pdna与溴化乙锭一起培养10分钟。将聚合物储备溶液在黑色96孔板(nunc，thermo fisher)中稀释，以调整n/p比为1～50。然后加入pdna并将纳米粒子共聚物-pdna配合物在37℃下培养15分钟。在λ
ex
＝525nm/λ
em
＝605nm测量溴化乙锭的荧光强度。不含共聚物的pdna定义为100％游离dna。通过逐渐加入肝素和测量由此产生的溴化乙锭荧光强度变化来研究复合dna的释放。通过在不同ph值的相应缓冲液(醋酸盐缓冲液ph5和5.8，以及hbg缓冲液ph6.5；7和7.4)中进行实验，研究ph值对pdna结合和pdna释放的影响。
[0196]
实施例3d：用egfp pdna转染hek293t细胞
[0197]
hek293t细胞系在杜氏改良伊格尔培养基(dmem、1g l-1
葡萄糖、10％(v/v)fbs、100g ml-1
青霉素/链霉素)中于37℃的5％加湿co2气氛中培养。对于转染实验，将0.2*106细胞/毫升的细胞接种到24孔板的500μl dmem中，补充10mm hepes，然后放置24小时进行恢复。处理前1小时，将处理介质替换为450μl的新鲜dmem(10mm hepes)。使用编码egfp的egfp pdna或不编码荧光蛋白的pkmyc pdna作为阴性对照，如实施例2中所述新鲜制备纳米粒子共聚物-pdna复合物。用50μl具有指定n/p比和pdna浓度的纳米粒子共聚物-pdna复合物的分散液或hbg缓冲液作为对照(ctrl)处理细胞，并培养1或4小时。然后去除上清液，通过对照培养并培养。然后去除上清液，用新鲜的dmem(10mm hepes)代替，并将细胞进一步培养最
多24小时。培养后，通过胰蛋白酶-edta分离细胞，重新悬浮于hbss(2％fbs(v/v)、20mm hepes)中，并使用流式细胞仪(cytoflex s，beckmann coulter，ca，u.s.a.)测量荧光。通过488nm激发和610nm发射测量(带通滤波器610/20)分析活细胞的egfp表达。通过选通阴性对照来鉴定荧光细胞。
[0198]
实施例3e：使用抗egfp sirna敲掉hek-gfp细胞中的gfp
[0199]
hek-gfp细胞系在杜氏改良伊格尔培养基(dmem、1g l-1
葡萄糖、10％(v/v)fbs、100g ml-1
青霉素/链霉素)中于37素的5％加湿co2气氛中培养。对于转染实验，将0.1*106细胞/毫升的细胞接种到24孔板的500μl dmem中，补充10mm hepes，然后放置24小时进行恢复。处理前1小时，将处理介质替换为450μl的新鲜dmem(10mm hepes)。如实施例2中所述共聚物-sirna配合物是新鲜制备。用50μl新鲜制备的复合物处理细胞。具有不针对gfp和hbg缓冲液的sirna的复合物用作阴性对照。用共聚物-sirna复合物处理72小时后，去除上清液并用胰蛋白酶-edta分离细胞。在hbss(2％ fbs(v/v)、20mm hepes)中重新悬浮后，通过流式细胞术在488nm的激发波长在525nm(带通滤波器525/40)下分析细胞。
[0200]
实施例3f：用gfp mrna转染hek293t细胞
[0201]
hek293t细胞系在杜氏改良伊格尔培养基(dmem、1g l-1
葡萄糖、10％(v/v)fbs、100g ml-1
青霉素/链霉素)中于37℃的5％加湿co2气氛中培养。对于转染实验，将0.2*106细胞/毫升的细胞接种到24孔板的500μl dmem中，补充10mm hepes，然后放置24小时进行恢复。处理前1小时，将处理介质替换为450μl的新鲜dmem(10mm hepes)。如实施例2中所述共聚物-mrna复合物是新鲜制备。将50μl的共聚物-mrna复合物添加到细胞中并培养4小时。然后，除去上清液，并将细胞进一步培养2小时或20小时。培养后，除去上清液，使用胰蛋白酶-edta将细胞分离，并重新悬浮于hbss(2％ fbs(v/v)、20mm hepes)中。随后，通过流式细胞术分析细胞的荧光。为此，使用488nm的激发波长，并在525nm处测量发射(带通滤波器525/40)。
[0202]
实施例3g：测试确定生存能力
[0203]
对于细胞毒性试验，将hek293t细胞以0.2
×
106细胞/毫升(hek293t)的密度接种到500μl dmem(10mm hepes)的24孔板中，并培养24小时以使其恢复。如实施例2所述添加50μl纳米粒子共聚物-pdna配合物以测试浓度范围0.25～1.5gml-1
的pdna。
[0204]
将细胞与纳米粒子共聚物-pdna复合物培养1小时或4小时。然后，去除上清液，并用500μl新鲜dmem(10m hepes)代替。处理后24小时，去除上清液，并用dmem培养基稀释的10％(v/v)(invitrogen，ca，u.s.a.)溶液替代。将细胞培养45分钟，并将上清液转移至96孔板(100μl每孔)以测定荧光强度(λ
ex
560nm，λ
em
590nm)。hbg缓冲液处理的细胞用作对照，相对于缓冲液对照并在减去空白对照(不含细胞的)后，计算存活率。
[0205]
纳米粒子聚合物颗粒和纳米粒子dna-聚合物配合物的研究
[0206]
遗传物质的结合是基因传递过程中的关键步骤，因为遗传物质必须克服细胞外和细胞内障碍以到达其靶细胞。阳离子聚合物的包封和络合作用例如能够防止血液中的核酸酶并穿过细胞膜(此方面请参见h.yin,r.l.kanasty,a.a.eltoukhy,a.j.vegas,j.r.dorkin,d.g.anderson,nat rev genet 2014,15,541-555)。
[0207]
实施例4：聚合物中pdna的结合能力和形成的复合物中pdna的释放实验
[0208]
图4描述关于聚合物中dna结合能力和从形成的复合物中pdna释放的实验结果。
[0209]
图4a显示在ph 7.4的hbg缓冲液中，对dna-聚合物配合物进行溴化乙锭结合试验(eba)的结果。检测dna-ipel复合物、dna-pdmaema复合物和dna-pbmd复合物。
[0210]
遗传物质的结合对其在基因递送中的应用至关重要。因此，通过琼脂糖凝胶电泳在不同的n/p比下，研究聚合物的pdna结合能力。图4b显示不同n/p比下dna-pbmd配合物的琼脂糖凝胶电泳测试结果。
[0211]
图4c-4e显示在ph范围5至7.4，对ph依赖性dna结合和dna释放的肝素释放试验(hra)的结果。检测dna-ipel复合物、dna-pdmaema复合物和dna-pbmd复合物。
[0212]
图4b中所示的测试证实了pdna在n/p比率高于1时完全结合。dna-聚合物的相互作用可以进一步表征为溴化乙锭可逆地嵌入到dna中。当将其嵌入pdna时，可以观察到强烈的荧光。然而，这会由于聚合物和遗传物质(eba)之间的相互作用而降低。测试在ph 7.4和n/p比为1～50下进行，以研究增加聚合物量对配合物形成的影响。除pbmd聚合物外，对lpei和pdmaema均聚物进行研究(图4a)。后者由与pbmd聚合物相同数量的阳离子基团组成，以评估pbmd聚合物中疏水侧链的影响。据观察，相对荧光强度(rfi)随着n/p比的增加而降低，在n/p比为10时达到平稳(图4a)。lpei显示最低的平稳值，其次是pdmaema(13％相比42％)，而pbmd仅将rfi降低至72％。由于电泳测试显示n/p高于1的dna完全结合，这些差异可能是由于dna缩合的差异以及因此不同包封的复合物，这可能导致etbr置换的不同水平。因此，可以假设与lpei和pdmaema相比，pbmd聚合物形成密度较低的dna-共聚物复合物。
[0213]
为了研究复合物在相关生理ph范围内的稳定性，在5(内体)至7.4(血液)的ph值下检测复合物的解离。将具有n/p比为20的预制dna-共聚物复合物与量增多的肝素作为竞争性聚阴离子一起培养，并测量荧光强度。解离并因此从复合物中释放pdna，导致etbr的重新嵌入。对于所有聚合物，观察到在添加肝素之前环境ph值对复合物形成有影响。对于lpei(上图4c)，在相对较低的肝素浓度(20u ml-1
)下，观察到显著的etbr置换和随后的pdna释放。在较低的ph值下形成的pdna复合物需要添加稍微少的肝素来释放pdna，但在高肝素浓度(100u/ml)下，pdna在所有ph值下完全释放。一般而言，与lpei相比，从pdmaema复合物释放的pdna需要更高量的肝素(图4d中部)并且受环境ph的影响更强。在低ph值(5和5.8)下，100u/ml肝素导致pdna完全释放，而ph值在6.5以上，仅释放66至79％。pbmd共聚物(下图4e)显示出更明显的ph依赖行为。添加肝素前的rfi值的范围为27％～60％，并且在ph值为5～5.8时更低。仅在ph5时观察到整个pdna的释放，并随着ph的增加而逐渐减少。在中性ph值下，添加肝素后rfi略有下降，表明在竞争性聚阴离子存在的情况下，pdna的络合作用甚至更强。一般来说，lpei几乎不受ph的影响，而对初始rfi值和随后的pdna释放，pdmaema和pbmd共聚物分别显示出对ph的微弱和最强影响。
[0214]
这些结果表明pka值和共聚物的疏水性对pdna结合、复合物中的排列和随后的pdna释放的影响。对于lpei，文献中表明的pka值为8.5，而pdmaema具有约7.5的pka。对于pbmd，只能确定表观pka为6.8，因为聚合物在滴定期间在此ph范围内沉淀。
[0215]
当由这些pka值计算电荷百分比时，在整个测试的ph范围内计算出lpei的电荷水平为100％～90％，而pdmaema显示从ph 5时的100％下降至ph7.4时的56％。当使用表观pka值计算pbmd的电荷水平时，效果更加明显(ph5时为98％，ph 7.4时为20％)。随着聚合物中电荷水平和阳离子基团数量的减少，亲水基团与疏水基团的比例发生变化，导致额外的疏
水相互作用和配合物中的不同排列，从而改变dna的释放行为。这种作用在pbmd共聚物中得到了最清楚的说明，其中nbma和mma单元的额外疏水侧链通过强疏水相互作用促进络合稳定性，尤其是在中性ph值下(参见e.j.adolph,c.e.nelson,t.a.werfel,r.guo,j.m.davidson,s.a.guelcher,c.l.duvall,j.mater chem b 2014,2,8154-8164)。因此，pbmd共聚物显示出作为基因递送载体的高潜力，因为在血流的中性ph值下的高稳定性和防止解离有利于配合物的系统应用。
[0216]
实施例5：pdna的络合作用实验
[0217]
图5和图6描述了不同聚合物中pdna络合作用和纳米粒子形成的实验结果。
[0218]
图5a示意性地显示通过由溶剂蒸发技术的纳米沉淀形成纳米粒子。
[0219]
图5b的左侧显示了从丙酮-水混合物中沉淀的e100纳米粒子的电子显微照片(扫描电子显微镜，sem)。
[0220]
图5b的右侧显示了从丙酮-水混合物中沉淀的pbmd共聚物的纳米粒子的电子显微照片(扫描电子显微镜，sem)。
[0221]
图6示意性地显示了根据所使用的配制方法形成pbmd与pdna的纳米粒子dna复合物。图6的左侧显示了由溶剂蒸发技术与不同的pdna添加(过程中和过程后添加)技术结合的纳米沉淀。图6的右侧显示了用于pdna络合作用的水基无溶剂的ph依赖性配方。获得的纳米粒子通过动态光散射进行表征。
[0222]
上部的图7a显示了pbmd共聚物和pdna在不同n/p比下从丙酮或水溶液中沉淀生产的纳米粒子的直径(z-平均值)。中间的图7b显示了pbmd共聚物和pdna在不同n/p比下从丙酮或水溶液中沉淀生产的纳米粒子直径的pdi值。下部的图7c显示了通过溶剂蒸发技术从丙酮中产生的pbmd共聚物和pdna的纳米粒子的表面电荷(zeta电位)。
[0223]
图7d的左侧两个图显示了在pdna存在的情况下，通过从丙酮中进行纳米沉淀以生产两种不同n/p比的pbmd共聚物的纳米粒子的电子显微照片(扫描电子显微镜，sem)。右图7d显示了通过从水溶液中纳米沉淀生产的pbmd共聚物的纳米粒子的电子显微照片(低温透射电子显微镜，cryo-tem)。
[0224]
由于pbmd共聚物显示出与pdna结合的高潜力和在血液的ph值下的高络合稳定性，该共聚物被用于开发用于包封pdna的稳定制剂。研究三种不同的配制方法。常用的添加dna的纳米沉淀:
[0225]
a)为了最终的纳米粒子悬浮液或
[0226]
b)在配制过程中与以下c)相比
[0227]
c)通过溶解在酸性缓冲液作为ph依赖性水基纳米沉淀中的聚合物的dna的络合作用。
[0228]
纳米沉淀是广泛使用的聚合物纳米粒子制剂的方法，该方法允许轻松调整纳米粒子大小和各种成分的络合作用。pbmd共聚物的纳米沉淀不添加pdna，获得颗粒直径约为125nm(n/p比为0)，表面带正电荷( 55mv)(参见图7c)。预计纳米粒子的表面正电荷应促进pdna与颗粒表面的结合和络合作用。将pdna添加到预先配制的带正电荷的纳米粒子(np pdna)中，通常会导致纳米粒子的大小和多分散性增加(图7a和7b)。只有在研究的最低和最高n/p比(n/p 5和n/p 100)，才发现大小低于200nm且具有可接受的pdi值(pdi《0.250)的纳米粒子。颗粒的表面电荷随着dna量的增加而减少，并在n/p 10处变为负值(图7c)。这些结
果表明，预先配制的纳米粒子(np pdna)对pdna具有有限的结合能力，并且在络合作用中不会完全凝聚pdna。dna与溶解在丙酮中的聚合物的预培养和随后在水中的纳米沉淀(np(pdna))导致纳米粒子大小和均匀性的类似n/p比依赖趋势。有趣的是，与np pdna制剂相比，zeta电位保持在正值范围内。一般来说，通过在加工中添加pdna获得的颗粒比之后添加pdna获得的粒子显示出略小的z平均值。这可能是由于在纳米沉淀处理中，pdna与溶解的聚合物链的相互作用得到改善。总的来说，这种配制方法没有显著改善dna包封，并且络合pdna的量导致大小范围低于200nm的稳定纳米粒子具有低多分散性，这仅限于相对高的n/p比(n/p100)。
[0229]
除了上述聚合物pdmaema、lpei和pbmd共聚物之外，共聚物e100也用于纳米粒子形成和pdna的络合作用。
[0230]
基于用于纳米沉淀的聚合物和有机溶剂的配制方法和相关配制方法原则上是已知的(参见r.jain,p.dandekar,b.loretz,m.koch,c.-m.lehr,medchemcomm 2015,6,691-701；n.kanthamneni,b.yung,r.j.lee,anticancer research 2016,36,81-85；m.gargouri,a.sapin,s.bouali,p.becuwe,j.merlin,p.maincent,technology in cancer research&treatment 2009,8,433-443)。
[0231]
根据本发明，提供新的无有机溶剂、水基的配制方法，其灵感来自dna与水溶性聚合物的联合络合。由于dmaema基团的质子化，此处使用的e100共聚物和通过raft生产的pbmd共聚物在酸性条件下是可溶的。
[0232]
为实施根据本发明的方法，在与pdna混合之前使用乙酸钠缓冲液(ph5.8)溶解共聚物。这种配制方法导致纳米粒子在100nm范围内，在更高的n/p比下直径减小，并且对于所有测试的n/p比，pdi值约为0.25(参见图7a和7b)。总体而言，使用这种配制方法获得的n/p比要低很多，表明pbmd共聚物对pdna的络合和缩合作用更好。这可能是由于溶解在醋酸盐缓冲液中时聚合物的电荷分数较高，因此pdna的络合和缩合作用更好。低n/p比是基因递送的优选。在较低的n/p比下，可以使用更少量的共聚物，由于共聚物浓度降低，从而导致更有效的基因递送和更低的潜在毒性。由于复合物制剂符合这些标准，因此与np pdna制剂相比，该制剂进行体外转染测试。np(pdna)制剂没有进一步研究，因为配制过程中的失败和强烈聚集，低n/p比在体外实验(10和20)测试中无法生产。
[0233]
实施例6：hek293t细胞中pdna转染效率实验
[0234]
图8、9和10描述pdna-共聚物复合物在细胞中转染效率的实验结果。
[0235]
图8a显示配制方法及其通过流式细胞术测量转染效率的比较。
[0236]
图8b描述通过荧光显微镜获得的结果。
[0237]
图8c描述pbmd共聚物的复合物中n/p比和pdna浓度的优化结果。
[0238]
图9描述lpei与pdna的复合物转染实验的结果。
[0239]
图10描述pdna与pbmd共聚物以及多种市售聚合物如100的配合物的转染实验的结果。
[0240]
通过将编码egfp的pdna转移到hek293t细胞中并在24小时后测量egfp表达，研究在纳米粒子生成后，通过添加pdna制备的ph依赖性制剂的转染效率。该制剂的转染效率通过在纳米粒子生成后添加pdna来确定。在共聚物的无毒区域(图8a)中测试了两种不同的n/p比。使用的复合物是通过从丙酮中沉淀纳米粒子然后添加pdna生成的(图8a和c的右侧部
分)，并且它是通过在pdna存在的情况下从酸性水溶液中沉淀纳米粒子生成的(图8a左侧部分)。还使用了含有不同fcs水平的两种不同培养基。一种培养基含有10％的fcs和另一种培养基是血清-减少的(opti-mem，2％fcs)。图8a每个部分的左侧两列描述含血清培养基中的结果；图8a每个部分的右侧两列描述无血清培养基中的结果。
[0241]
图8b显示1 23小时培养时间(无样品)后或4 20小时培养时间(样品)后，转染细胞的荧光显微镜检查。使用的复合物是通过从丙酮中沉淀纳米粒子，然后添加pdna来生成的(图8b的底行)，并且它是通过在pdna存在的情况下从酸性水溶液中沉淀纳米粒子生成的(图8b的中间行)。在每种情况下使用n/p比为20。
[0242]
此外，图8b的第一行显示呈现出如下结果，即显示接受hbg缓冲液而不是纳米粒子或复合物的细胞作为实验中的内部对照(ctrl)。
[0243]
一般而言，两种制剂，即通过从丙酮中沉淀生产和通过从酸性水溶液中沉淀生产，在血清-减少条件下和更高n/p比下显示hek293t细胞中具有更高的转染效率。与从丙酮中沉淀生产的制剂相比，ph依赖性制剂显示出更高和更一致的转染效率。这可能是由于在dls测量(图7a和7b)中，加工后通过添加pdna制剂形成聚集体具有大于500nm的颗粒直径以及更高的多分散性。因此，制剂中不同物种的沉降取决于它们的大小，导致细胞摄取和转染效率的变化。
[0244]
ph依赖性制剂导致纳米粒子在大小变化较小，而不会形成聚集体。这可能导致更受控地摄取到细胞中和更一致的转染率。
[0245]
由于ph依赖性制剂产生的颗粒具有优选的n/p比、大小和均匀性，因此对该制剂进行进一步研究并对转染效率进行优化。为高转染效率优化pbmd-共聚物复合物转染过程中的条件，同时保持高细胞活力。此外，还要确定共聚物和pdna的最小量。研究了不同的pdna浓度，将n/p比保持在20，因为这被发现是最佳的(参见图8c的左半部分)。随后，通过改变n/p比(参见图8c的右半部分)进一步优化理想的pdna浓度(0.5mgml-1
)。
[0246]
将图8c的结果与由p-dna和lpei作为金标准形成的复合物进行了比较(见图9)。总的来说，与用pdna和lpei形成的复合物相比，用pbmd共聚物形成的复合物在较低pdna浓度和较短的培养时间下显示出高转染效率。
[0247]
在研究的浓度和n/p比范围内，与p-dna和lpei复合物相比，4小时的培养时间导致pdna和pbmd共聚物的复合物的转染效率更高，但也导致在较高聚合物浓度下(＝较大的n/p比)细胞活力降低(参见图8c和9)。当pdna浓度增加时(从8.59％在0.25μg ml-1
至64.3％在1.5μg ml-1
，培养时间为4小时)，观察到转染效率增加(参见图8c的左侧部分)。在恒定的pdna浓度下增加n/p比会导致更高的效率(参见图8c的右侧部分)，但会导致细胞脱落和细胞死亡的增加。因此，选择0.5μg ml-1
在n/p比为20，作为pbmd共聚物复合物有效转染pdna的理想条件。
[0248]
与金标准lpei相比，pdna浓度可降低至0.5μg ml-1
，其在培养1小时后仍会产生22.5％的荧光细胞，而在如此短的培养时间和本研究的pdna浓度范围(0.5至5μg ml-1
)中lpei是不可能的(参见图8c的左侧部分和图9)。为获得更高的转染效率，要么必须增加pdna浓度，要么需要高达24小时的培养时间(见图9)。即使在非常高的pdna浓度5μg ml-1
和24小时的培养时间下，pdmaema显示几乎没有转染。这些结果支持疏水侧链对作为基因递送载体的阳离子聚合物在体外性能影响的假设。
[0249]
图10显示pdna与pbmd共聚物、与pdmaema均聚物和与商业聚合物e100、viromer red和lpei的复合物的转染效率。
[0250]
pbmd和e100的制剂是通过在pdna存在的情况下从酸性水溶液中沉淀而生产的。通过流式细胞术测量转染后hek293t细胞中egfp的表达。hek293t细胞在n/p比20和pdna浓度0.5μg ml-1
下进行转染。
[0251]
pdna-pbdm配合物制剂技术进一步应用于商业聚合物e100，并在优化的转染条件下进行研究。此外，将转染效率与商业转染剂viromer red进行比较。总体而言，ph依赖性制剂适用于商业聚合物e100，其在培养1小时后显示出与pdna-pbmd-共聚物复合物相当的转染效率，但在培养4小时后显示出略低的转染效率。这可能是由于pbmd共聚物中的dmaema含量略高。更高的阳离子含量将导致dna结合更高和膜活性增加。
[0252]
两种共聚物在性能上都明显优于商业转染剂viromer red和lpei。
[0253]
图11描述sirna配合物在细胞中转染效率的实验结果。
[0254]
为了确定敲落效率，将抗gfp sirna引入hek-gfp细胞中，显示通过从酸性水溶液中沉淀生产的共聚物-sirna复合物稳定表达gfp。将培养72小时后的敲落效率与金标准lipofectamine进行比较。仅用hbg缓冲液处理的细胞用作对照。与对照(100％)相比，lipofectamine和共聚物-sirna复合物均显示荧光细胞(gfp阳性细胞)数量减少。共聚物-sirna复合物显示gfp阳性细胞在n/p比为10时减少至42.9％，在n/p比为5时进一步减少至25.2％。lipofectamine结果为减少至8.6％。因此，pbmd共聚物也显示出将sirna引入细胞的高潜力，其仍然可以通过转染条件的进一步优化来提高，如培养时间、n/p比和sirna的量。
[0255]
图12描述mrna复合物在细胞中转染效率的实验结果。
[0256]
遗传物质和共聚物的复合物沉淀也应用于共聚物-mrna复合物的生产。这些复合物的转染效率通过将gfp mrna引入hek293t细胞来确定。测试不同n/p比(5、10、20)和mrna浓度(0.25至0.75μg ml-1
)。细胞与复合物培养4小时。处理开始后6小时和24小时，通过流式细胞术中的荧光测量确定gfp表达。将共聚物-mrna复合物的转染效率与市售的vimerer red进行比较，后者是为mrna的转染而开发的，在文献中显示出高效率。仅用hbg缓冲液或不含共聚物的mrna培养的细胞，用作阴性对照。viromer red和共聚物-mrna复合物均导致hek293t细胞中mrna浓度依赖性gfp表达。更高的mrna浓度导致更高的表达水平，而共聚物-mrna复合物中n/p比的增加也导致表达水平的增加。viromer red在mrna浓度为0.75μg ml-1
和培养时间为24小时显示出最高的转染效率(55.8％)。n/p比为20且mrna浓度为0.75μg ml-1
(73.1％)的共聚物-mrna复合物培养24小时后，实现最高转染效率。因此，除了将pdna和sirna引入细胞，pbmd共聚物也显示出将mrna引入细胞的高潜力。
[0257]
图13a-13c描述具有不同分子量的不同pbmd共聚物的合成和表征结果。
[0258]
它们显示了用于生产pbmd共聚物的合成路线(在实施例1a，图13a中描述)以及通过类似于实施例1a的raft聚合制备的共聚物的分子量分布和多分散性，如通过排阻色谱法(sec)测定(图13b和13c)。
[0259]
图14显示pdna与不同分子量的pbmd共聚物的复合物在hek293t细胞中的转染效
率。
[0260]
在pbmd182共聚物的优化条件下，在hek293t细胞中研究pbmd聚合物文库的转染效率。egfp-pdna与溶解在醋酸盐缓冲液中的共聚物络合，并与细胞一起培养1小时或4小时。总体而言，pbmd文库中的所有共聚物-pdna复合物在hek293t细胞中显示出转染效率。结果表明dmaema的摩尔质量和摩尔含量对转染效率有明显影响。根据培养时间，分子量大于15kda且摩尔dmaema含量为50％的共聚物-pdna复合物显示转染效率为18％或更高。在与共聚物-pdna复合物(34.6％)培养4小时后，pbmd182共聚物(根据实施例1a制备的共聚物)达到最高转染效率。与具有50％摩尔dmaema含量的聚合物相比，具有dmaema摩尔含量为40％且摩尔质量大于15kda的pbmd185(40％)共聚物显示相对略低的转染效率(培养1小时后为13％，培养4小时后为21.7％)。因此，共聚物-pdna复合物的形成也可以转移到不同摩尔质量的聚合物中。