用于眼科用途的新型药物递送系统的制作方法

1.本发明涉及持续释放的眼用制剂领域，用于将活性成分递送至眼表面，特别是用于治疗角膜的病变。


背景技术：

2.药物作为滴眼液的局部滴注是治疗大多数前眼部分(anterior ocular segment)疾病的优选和常规途径。
3.然而，这种施用方式非常低效，并且特征为生物利用度非常低。滴注后，泪液的流动在几分钟内将药物从眼表面移至鼻泪管，因此，大部分药物通过鼻泪管排出丢失。只有施用药物总量的5％可以在足够长的时间中与眼表面接触以发挥治疗效果。
4.这需要频繁施用大量的药物，患者的依从性非常低，并且导致有效剂量不准确。
5.为了在眼的前表面获得有效的药物浓度和停留时间，已使用泪点塞(punctal plug)，从而减少了施用的剂量和频率。这些是插入眼的泪管以阻塞管道的小型医疗装置，从而防止液体从眼中排出。然而，患者有可能不能很好地耐受泪点塞，引起并发症，如泪溢、异物感、感染、化脓性肉芽肿、泪小管(punctal canalicular)糜烂、泪囊炎和过敏症状增加。
6.另一种替代方案是研发持续释放的递送系统，延长药物在眼前节在角膜的停留时间，如粘性溶液、粘膜粘附材料或药物包被的角膜接触镜。
7.例如，us20040241207公开了含有包埋的药物纳米颗粒的角膜接触镜，当将镜片应用于眼时，药物纳米颗粒通过角膜接触镜扩散到镜片后的泪膜中。
8.然而，角膜接触镜或其他人造聚合物的不便之处在于它们会触发患者的免疫反应。
9.除上述之外，眼的生理屏障进一步降低了药物的生物利用度，这极大地限制了在角膜内层的药物浓度。特别地，角膜上皮是亲脂性的并且在细胞之间存在紧密连接，这导致药物分子，特别是亲水性药物分子的渗透受限。
10.因此，需要研发一种生物相容的、非免疫原性的递送系统，其解决上述问题并且允许在眼前部在足够长的时间段中都获得足够浓度的药物分子。


技术实现要素：

11.本发明人已经出人意料地发现，可以使用含有药物活性分子的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)微粒将角膜基质功能化，并且用于将这些分子控释递送至眼的前部。
12.因此，本发明的第一个目的是一种适用于眼科用途的药物递送系统，其包含脱细胞的角膜基质(corneal stroma)支架，所述角膜基质支架具有分散在和/或结合到表面的微粒，所述微粒含有至少一种分散在基体(matrix)中的药物活性分子，所述基体具有含有至少70％的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)的组合物。
13.本发明的第二个目的是用于制造根据本发明的第一个目的的药物递送系统的方
法。
14.本发明的第三个目的是用于治疗眼前部病变的药物活性分子，其中所述药物活性分子通过根据本发明第一个目的的药物递送系统的方式进行施用。
15.本发明的第四个目的是用于治疗眼前部病变的方法，包括通过根据本发明第一个目的的药物递送系统的方式进行施用药物活性分子。
附图说明
16.图1表示透射电子显微镜(tem)图像，显示未经处理的透镜(lenticule)(图a)和使用0.1％的sds脱细胞后的透镜(图b)，如实施例2所述。
17.图2显示了通过共聚焦显微镜获得的透镜图像，如实施例5所述。具体而言，图a显示了3d重建，其显示fluo-mp(浅灰色点)在透镜中的表面定位；图b显示了二维图像，其显示fluo-mp分布(浅灰色点)在胶原纤维(深灰色)之间。
18.图3显示了rhngf从透镜释放的体外动力学，如实施例6中所测量。图表显示了从预先包含在透镜中的加载plga-mp释放的rhngf的累积。
具体实施方式
19.本发明的第一个目的是药物递送系统，其包含脱细胞的角膜基质支架，所述角膜基质支架具有分散在和/或结合到表面的微粒，所述微粒含有至少一种分散在基体中的药物活性分子，所述基体具有含有至少70％w/w的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)的组合物。
20.根据本发明的一个优选的实施方案，根据本发明的第一个目的的角膜基质支架是从待治疗患者的角膜或从供体获得的移植物。
21.例如，所述角膜基质可以从接受屈光眼手术，优选接受屈光透镜摘除术(extraction)(relex)或飞秒透镜摘除术(flex)的供体获得。或者，角膜基质可以来自尸体供体。
22.根据本发明的另一个优选的实施方案，所述角膜基质支架是体外获得的工程化的角膜基质支架。
23.优选地，所述角膜基质支架是角膜基质透镜。
24.优选地，所述角膜基质透镜的厚度在80μm至300μm之间，优选在100μm至150μm之间和/或直径在4mm至9mm之间，优选在5mm至8mm之间，更优选在6mm至7mm之间。
25.优选地，所述角膜基质支架是无细胞的。
26.在基质中没有细胞使得基质是免疫原性相容性的，并且在支架中产生掺入微粒的孔。
27.根据一个优选的实施方案，所述微粒分散在脱细胞的角膜基质支架内。
28.根据一个优选的实施方案，所述微粒既分散在脱细胞的角膜基质支架内又结合到其表面。
29.优选地，根据本发明第一目的的药物递送系统的所述基体包含至少75％(w/w)、优选80％(w/w)、更优选85％(w/w)的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)。
30.优选地，所述基体包含在85％(w/w)至95％(w/w)之间，更优选89％(w/w)的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)。
31.根据一个特别优选的实施方案，所述plga具有共聚物组合物(composition)，其由乳酸和羟基乙酸组成，所述乳酸在50％(w/w)至75％(w/w)之间，优选75％(w/w)，所述羟基乙酸在50％(w/w)至25％(w/w)之间，优选25％(w/w)。
32.根据另一个优选的实施方案，也结合前述实施方案，所述plga是无定形的。
33.根据另一个优选的实施方案，也结合前述实施方案，所述plga的分子量在4000-15000g/mol之间。
34.特别适用于本发明的药物递送系统的plga是例如，以商品名rg752h销售的产品(聚(d，l-乳酸羟基乙酸共聚物))。
35.优选地，除了plga之外，所述基体还包含一种或多种选自聚乙二醇、白蛋白和/或海藻糖的附加成分，所述聚乙二醇优选低分子量级的聚乙二醇，更优选peg400，所述白蛋白优选人血清白蛋白(hsa)。优选地，所述基体具有由plga、peg400、hsa和海藻糖组成的组合物，其中plga以总组合物的至少70％w/w的量存在。
36.根据本发明的一个优选的实施方案，所述微粒由所述基体和分散在其中的至少一种药物活性分子组成。
37.优选地，为了既获得药物活性分子有效掺入或结合至角膜基质支架中，又获得药物活性分子合适的释放速率，微粒的粒径分布通过激光衍射技术测量为在1μm至15μm之间，优选在1.5μm至10μm之间，更优选在1.9μm至7μm之间。优选地，所述粒径使用粒径分析仪mastersizer 2000以hydro 2000μp湿样品分散单位(malvern panalytical)进行测量。
38.根据本发明的药物递送系统能够以控制的速率释放药物活性分子，优选持续至少一个月的时间。
39.优选地，所述药物活性分子是蛋白或肽。
40.所述蛋白可以是天然来源的或合成产生的，优选其是重组蛋白。
41.根据一个优选的实施方案，所述药物活性分子是生长因子或生长因子模拟肽或蛋白。更优选地，所述药物活性分子是神经营养素(neurotrophin)或神经营养素模拟肽或蛋白。
42.根据本发明，术语“神经营养素”是指作为神经元生长促进因子的蛋白，包括重组蛋白。这些包括神经生长因子(ngf)、脑源性神经营养因子(bdnf)、神经营养素-3(nt-3)和神经营养素-4(nt-4)；术语“神经营养素模拟肽或蛋白”指能够作为一种或多种神经营养素受体的激动剂发挥作用的任何天然或合成来源的肽或蛋白。例如，相对于天然野生型神经营养素，神经营养素模拟蛋白可以是具有突变或截短但仍然能够激活一种或多种神经营养素受体的蛋白。模拟肽可以是线性或环状肽。
43.根据本发明的特别优选的药物活性分子是神经生长因子和神经生长因子模拟肽或蛋白。所述神经生长因子优选为人神经生长因子，更优选为重组人神经生长因子。
44.分散在微粒基体中的药物活性分子的量将根据所需的待施用至眼前部的剂量而变化。优选地，当所述药物活性分子是神经生长因子时，其包含在所述微粒基体中含有的量为每mg在30ng至100ng之间，优选在50ng至90ng之间，更优选在60ng至80ng之间。
45.根据本发明，表述“具有结合到表面的微粒的脱细胞的角膜基质支架”是指微粒通过可以是各种类型的引力保持并保留在脱细胞的角膜基质支架的表面上。
46.本发明的第二个目的是用于制备如上所述的药物递送系统的方法，包括以下步
骤：
47.a.获得如上所述的角膜基质支架，优选从如上所述的供体角膜获得角膜基质透镜；
48.b.如果存在细胞物质，将其从所述支架去除，从而获得脱细胞的角膜基质支架；
49.c.将所述脱细胞的角膜基质支架孵育在微粒的悬浮液中，所述微粒含有至少一种分散在基体中的药物活性分子，所述基体具有包含至少70％(w/w)的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)的组合物，如上所述。
50.优选地，在步骤a中的所述角膜基质支架是角膜基质透镜，其厚度在80μm至300μm之间，优选在100μm至150μm之间和/或直径在4mm至9mm之间，优选在5mm至8mm之间，更优选在6mm至7mm之间。
51.优选地，在根据本发明的上述方法的步骤b中，将所述细胞物质去除以获得在所述角膜基质支架中的残余细胞量低于0.5重量％，更优选无细胞透镜。
52.优选地，通过在表面活性剂溶液中孵育透镜来去除所述细胞物质。根据一个优选的实施方案，所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(sds)，优选浓度在0.05％至0.2％之间，更优选为0.1％。
53.为了从透镜中有效去除细胞成分，使用表面活性剂溶液进行的孵育应该持续至少20小时，优选至少24小时。
54.当角膜基质支架为角膜基质透镜时，在步骤b中获得的脱细胞透镜可以在从供体中摘除之后立即与微粒一起孵育。
55.更优选地，将步骤b中获得的脱细胞透镜进行脱水并在室温下储存直至使用。根据这种实施方案，上述方法进一步包括在步骤b之后且在步骤c之前的步骤b'，其中将脱细胞透镜脱水，优选通过在50℃至70℃之间，优选在55℃和65℃之间，更优选60℃的温度处理1至3小时，优选2小时。
56.脱细胞透镜的脱水是特别有利的，因为其极大地增加微粒掺入基质的能力。
57.在步骤c中，角膜基质支架与微粒悬浮液一起孵育，优选在室温下进行。
58.优选地，所述孵育进行时间在1至5小时之间，优选3小时。
59.根据本发明的方法的步骤c的微粒通过以下步骤获得：
60.a.制备含有药物活性成分和聚乳酸羟基乙酸共聚物的水/油乳液。
61.b.制备含有聚乙烯醇的水溶液，其中掺杂与步骤a的油相所用的相同的有机溶剂。
62.c.将a和b中制备的乳液和溶液混合并均质化，从而获得水/油/水乳液。
63.d.蒸发有机溶剂，从而获得微粒沉淀；
64.e.将沉淀的微粒回收并洗涤；
65.f.将微粒冷冻干燥。
66.优选地，在步骤a中，聚乳酸羟基乙酸共聚物存在的浓度是在10％至30％w/v之间，优选在15％至25％w/v之间，更优选在18％至22％w/v之间。
67.优选地，步骤a中的所述油相是乙酸乙酯。
68.优选地，在步骤b中，水溶液中聚乙烯醇的浓度在0.5％至2％w/v之间，优选为1％w/v。
69.用根据本发明的第二个目的的方法获得的药物递送系统具有根据本发明的第一
个目的的所有特征。
70.如将在实施例6中表明的，根据本发明的药物递送装置能够在至少一个月的时间段中以受控的速率从包含在角膜基质支架的微粒中释放药物活性分子。
71.根据本发明的递送系统可以有利地用于将药物活性分子递送至眼前节。
72.根据待治疗的具体病理，对患者的施用可以使用不同方式进行。
73.例如，如果药物活性分子必须在角膜内层发挥其活性，则可以将递送系统移植进患者眼中通过外科手术产生(例如，通过飞秒激光的方式形成)的基质内袋中。或者，递送系统可以应用至角膜表面。
74.递送系统中的活性分子将以恒定速率释放，从而在整个治疗过程中维持作用部位的有效浓度。
75.根据本发明的递送系统具有高度生物相容性和非免疫原性，因此被患者很好地耐受。
76.因此，本发明的第三个目的是如上所述的药物活性分子，其用于治疗眼病变，优选眼前部的病变，其中所述药物活性分子在根据本发明的第一个目的的药物递送系统中施用。
77.本发明的第四个目的是用于治疗眼病变的方法，优选用于治疗眼前部病变的方法，包括在根据本发明第一个目的的药物递送系统中施用药物活性分子。
78.实验部分
79.实施例1：
80.载有rhngf的微粒的制备
81.根据下述方法制备由载有rhngf的聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)基体形成的微粒。
82.在制剂缓冲液(50mm磷酸二氢钠一水合物，100mm氯化钠，ph 7.2)中配制0.85mg/ml的rhngf溶液。
83.制备水溶液w1，其含有150μl的上述制备的rhngf溶液、6.01mg人血清白蛋白(hsa)和150μl的聚乙二醇400(peg400)(比率为1:40:1v/w/v)。
84.然后，将150μl的溶液w1添加到7.5ml的溶液o中，其含有20％w/v的plga(rg752h)的乙酸乙酯溶液，通过均质器ultraturrax t25 basic(ika)，使用8g探针，在17400rpm中均质化3分钟。
85.将所得的乳液(w1/o)快速加入到30ml的水溶液w2中，其含有掺杂900μl乙酸乙酯的1％w/v聚乙烯醇(pva)(40-88)，并再次以12000rpm均质化30分钟。在室温，将所得的双乳液(double emulsion)(w1/o/w2)用水冲洗管并回收材料，使用顶置式搅拌器rw20d(ika)(带有ptfe涂层的2叶片螺旋桨式搅拌器)，以500rpm搅拌3小时以蒸发有机溶剂并沉淀微粒。将悬浮液收集在两个50ml聚丙烯管(eppendorf lobind protein)中，并在4℃以7400rpm离心15分钟。通过在4℃下以7000rpm离心15分钟将微粒分离，并使用50ml的milliq水洗涤6次。然后，将微粒重新悬浮在海藻糖2％w/v的水溶液中。将所得的混悬液移至iso玻璃型硅化1级小瓶中，并在-80℃冷冻，然后冻干。使用这种方法生产的微粒显示出超过73％的包封效率(encapsulation efficiency)(55.5ng rhngf/mg微粒vs理论值的76ng rhngf/mg微粒)，粒径分布在1.9μm至6.9μm之间，使用分析仪mastersizer2000
(malvern)使用hydro 2000μp湿样品分散法进行测量。
86.微粒的最终组合物包含89％w/w的plga。
87.实施例2：
88.脱水、脱细胞透镜的制备
89.根据sekundo w、kunert ks、blum m.br j ophthalmol.2011；95:335
–
339中描述的方法，通过smile手术(小切口透镜摘除术(small incision lenticule extraction))获得厚度在100μm至150μm之间的人角膜透镜，冷冻保存直至进一步处理。
90.随后，根据以下方法制备透镜以用于功能化。
91.将透镜解冻，通过在sds 0.1％溶液中在r.t孵育24小时以去除透镜的细胞成分，随后在pbs中洗涤3次(每次24小时)。
92.如图1所示，其显示了通过透射电子显微镜术(tem)分析在用sds溶液处理之前的透镜(图a)，和处理之后细胞成分被完全去除的透镜(图b)。
93.然后，通过在60℃处理2小时，使得脱细胞的角膜透镜脱水并在室温下储存直至使用。
94.实施例3：
95.透镜的功能化
96.在实施例1中制备的载有rhngf的微粒用于功能化在实施例2中获得的脱水、脱细胞透镜。
97.具体而言，将实施例1中获得的20mg微粒悬浮于0.175ml的0.9％nacl中，在获得的悬浮液中加入1个透镜，在r.t中孵育3小时，以200rpm进行轨道振荡。
98.然后，将透镜从悬浮液中取出，并在0.4ml的0.9％ nacl中洗涤10次(上下)。
99.实施例4：
100.功能化透镜的分析
101.如实施例3所述制备的功能化透镜通过与0.2ml的5mg/ml胶原酶ia的pbs溶液(含有100mg/l的ca
2
/mg
2
)在37℃孵育30分钟进行裂解，执行该步骤以特异性裂解保留已释放的rhngf(上清液)和完整的rhngf-mp(沉淀)的透镜。将裂解的样品在4℃中以8000rpm离心10分钟。
102.通过离心获得的上清液相含有微粒已释放的rhngf，而沉淀相含有完整的mp。
103.收集上清液相并立即将其储存在-20
°
直至分析。
104.剩余的沉淀对应于透镜通过裂解释放的完整微粒，用0.05ml乙酸乙酯处理以裂解mp的plga壳，并添加含有100mg/l ca
2
/mg
2
的pbs以安全提取rhngf。将样品以8000rpm离心5分钟并收集水相(沉淀相)。
105.将上清液和沉淀相分别在含有100mg/l ca
2
/mg
2
的pbs中以1:3进行稀释，并通过elisa测定法进行分析以检测rhng的浓度。
106.上清液相含有mp已经释放的rhngf，而沉淀相含有完整的mp。
107.从分析三个透镜获得的结果如下表1所示
108.表1：
[0109][0110]
获得的结果表明，释放的rhngf与微粒中包含的rhngf之间的比率在不同的透镜中具有高度可重复性。
[0111]
实施例5：
[0112]
rhngf-mp在透镜中的分布
[0113]
荧光plga微粒(fluo-mp)(由s.i.c.提供#lgfg5000)用于测试微粒与透镜的相互作用。
[0114]
将5mg的fluo-mp以0.175ml、0.9％悬浮，在获得的悬浮液中加入1个透镜，在r.t中孵育3小时，以200rpm进行轨道振荡。
[0115]
然后，将透镜从悬浮液中取出，并在0.4ml的0.9％ nacl中洗涤10次(上下)。
[0116]
为评价在透镜中fluo-mp的结合或包含、以及fluo-mp的位置，使用以下报告的操作方案通过免疫荧光对透镜中的胶原蛋白进行染色。
[0117]
将透镜固定在4％多聚甲醛中10分钟，在1
×
pbs中洗涤3次，5分钟，然后与在含有1％bsa的1
×
pbs中制备的抗胶原蛋白i一抗(abcam，目录号ab34710)溶液一起孵育1小时。然后，在1
×
pbs中再次洗涤3次，5分钟，与在含有1％bsa的1
×
pbs中制备的抗兔cy3二抗(jackson immunoreasearch，laboratories，目录号111-165-144))溶液一起孵育1小时，在1
×
pbs中洗涤3次，5分钟。
[0118]
最后，将免疫染色的透镜封在盖玻片上，并通过lms-800zeiss共聚焦显微镜进行分析。
[0119]
获得的数据如图2所示，表明微粒主要结合在透镜表面。
[0120]
实施例6：
[0121]
从透镜中包含的mp释放rhngf的体外动力学
[0122]
采用以下方法进行评价从功能化透镜中释放rhngf的体外动力学。
[0123]
将如实施例3所述获得的功能化透镜孵育在含有0.150ml的pbs的管中，在37℃以80rpm进行轨道振荡(lobind管用于保存rhngf)。
[0124]
时间点设置在t＝0、2、4或24小时和t＝2、5、7、9、12、14、16、19、21、23或25天。
[0125]
在每个时间点，将透镜从初始管中取出并移至含有0.150ml的pbs的新管中，在37℃中以80rpm轨道振荡再次孵育。
[0126]
每个样品立即储存在-20℃中；
[0127]
1个月后，在不稀释的情况下，通过elisa测定法分析样品以评估如题的rhngf。
[0128]
如图3所示，从透镜中包含的mp中释放rhngf持续约一个月。特别地，神经营养素在前24小时迅速释放，并且持续保持释放直至实验结束。