高唾液酸化IGG的制备和纯化的制作方法

技术特征：
1.一种产生纯化的高唾液酸化igg(hsigg)组合物的方法，其中所述hsigg上大于75％的支链fc聚糖在α1，3分支和α1，6分支两者上具有唾液酸，所述方法包括：(a)提供包含hsigg以及st6gal或其酶活性部分的hsigg组合物；(b)将所述组合物稀释在约50mm、约ph 4.5的柠檬酸盐缓冲液中，从而产生缓冲抗体组合物；(c)在结合所述hsigg以及所述st6gal或其酶活性部分的条件下，将所述缓冲抗体组合物施加到包括具有磺酸官能团的树脂的色谱柱；以及(d)从所述柱选择性地洗脱所述igg，从而产生纯化的hsigg组合物，其中所述hsigg上大于75％的所述支链fc聚糖在α1，3分支和α1，6分支两者上具有唾液酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中提供hsigg组合物的所述步骤包括提供包含hsigg的组合物，以及将所述组合物以约1∶1稀释度稀释在5x pbs中。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述cex柱包括具有so
3-官能团的树脂。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中选择性地洗脱所述hsigg包括在包含约400mm或更多nacl的缓冲液中进行洗脱。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述缓冲液是约50mm和约ph 4.5的柠檬酸盐缓冲液。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除(a)和(b)之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的除步骤(a)和(b)之外的单个深层过滤步骤。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述附加深层过滤步骤在步骤(a)与(c)之间进行。9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除所述单个深层过滤步骤之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的病毒灭活步骤。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述施加通过1、2或3次施加间隔开。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(e)重复一次或多次。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)以为或约为1、2、3、4、5或6分钟的停留时间进行。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在步骤(e)之后的以下步骤中的一者或多者：(f)蓝色染料色谱，(g)de垫过滤步骤，(h)深层过滤步骤，或(g)ps20掺入和过滤步骤。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化的hsigg组合物包含来自步骤(a)的所述组合物的80％、85％、90％或95％或更多量的未纯化的hsigg。16.在一些实施方案中，所述纯化的hsigg组合物包含100ppm、90ppm、80ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm或30ppm或更少的st6gal或其酶活性部分。17.一种产生纯化的高唾液酸化igg(hsigg)组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供包含hsigg以及st6gal或其酶活性部分的hsigg组合物；(b)将所述组合物稀释在适合与所述柱一起使用的缓冲液中，从而产生缓冲抗体组合物；(c)在允许80％或更多的所述hsigg流通但允许仅100ppm或更少的所述st6或其酶活性部分流通的条件下，将所述缓冲抗体组合物施加到蓝色染料柱，例如本文所述的蓝色柱，从而产生纯化的hsigg。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述蓝色染料色谱柱是trisacryl blue(tabs)柱，并且适合与所述柱一起使用的所述缓冲液是含有约800mm nacl的约100mm、约ph 4.5的柠檬酸盐缓冲液。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述蓝色染料色谱柱是capto
tm
blue或capto
tm
blue hs柱，并且所述缓冲液是含有约800mm nac1的约250mm、约ph 4.5的甘氨酸。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中提供hsigg组合物的所述步骤包括提供包含hsigg的组合物，以及将所述组合物以约1∶1稀释度稀释在5x pbs中。21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除(a)和(b)之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。22.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的除步骤(a)和(b)之外的单个深层过滤步骤。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述附加过滤步骤在步骤(a)与(c)之间进行。24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述方法不包括在进行步骤(c)之前的除所述单个深层过滤步骤之外的任何附加过滤、分馏或纯化步骤。25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(c)之前的病毒灭活步骤。26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述施加通过1、2或3次施加间隔开。27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中步骤(c)以为或约为1、2、3、4、5或6分钟的停留时间进行。28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，还包括在步骤(e)之后的以下步骤中的一者或多者：(f)蓝色染料色谱，(g)de垫过滤步骤，(h)深层过滤步骤，或(g)ps20掺入和过滤步骤。29.一种产生高唾液酸化igg(hsigg)组合物的方法，所述方法包括：(a)提供hsigg；(b)通过添加饱和硫酸铵溶液使所述hsigg沉淀，从而产生沉淀的hsigg溶液；以及(c)分离所述沉淀的hsigg，从而产生纯化的hsigg组合物。30.根据权利要求29所述的方法，其中分离所述沉淀的hsigg包括过滤和/或离心。31.一种产生高唾液酸化igg(hsigg)的方法，所述方法包括：(a)提供混合igg抗体；(b)在包含凸1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)或其酶活性部分以及udp-gal或其盐的反应混合物中孵育所述混合igg抗体；以及
(c)在包含st6gal或其酶活性部分以及cmp-nana或其盐的反应混合物中孵育所述半乳糖基化igg抗体；(d)根据权利要求1至30中任一项所述的方法纯化所述hsigg。32.一种制备高唾液酸化igg(hsigg)的方法，所述方法包括：(a)提供混合igg抗体；(b)在包含β1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)或其酶活性部分、udp-gal或其盐、st6gal或其酶活性部分以及cmp-nana或其盐的反应混合物中孵育所述混合igg抗体；以及(c)根据权利要求1至30中任一项所述的方法纯化所述hsigg，从而产生所述hsigg制剂。33.一种制备高唾液酸化igg(hsigg)的方法，所述方法包括：(a)提供混合igg抗体；(b)在包含凸1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)或其酶活性部分以及udp-gal或其盐的半乳糖基化反应混合物中孵育所述混合igg抗体，从而产生半乳糖基化igg抗体；(c)将st6gal或其酶活性部分以及cmp-nana或其盐添加到所述半乳糖基化反应混合物中，以产生唾液酸化反应混合物；(d)孵育所述唾液酸化反应混合物；以及(e)根据权利要求1至30中任一项所述的方法纯化所述hsigg，从而产生hsigg。34.一种制备纯化的高唾液酸化igg(hsigg)组合物的方法，所述方法包括：(a)提供igg抗体混合物；(b)在包含β1，4-半乳糖基转移酶i(β4galt)或其酶活性部分和udp-gal的反应混合物中孵育所述igg抗体混合物，以产生半乳糖基化igg抗体；(c)在包含st6gal或其酶活性部分和cmp-nana的第二反应混合物中孵育所述半乳糖基化igg抗体，以产生hsigg混合物；(d)在结合igg抗体的条件下将所述hsigg混合物施加到蛋白质a柱；以及(e)从所述蛋白质a柱洗脱hsigg。35.根据权利要求34所述的方法，还包括(f)使用三丙烯酰基蓝色柱进一步纯化步骤(e)中产生的所述hsigg。36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中步骤(e)包括用包含甘氨酸的缓冲液洗脱所述hsigg。37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中在步骤(d)与步骤(e)之间用乙酸盐缓冲液洗涤所述蛋白质a柱。38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中在将步骤(e)中产生的hsigg施加到所述三丙烯酰基蓝色柱之前改变其ph和盐含量。39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中步骤(f)包括用高盐缓冲液洗脱所述hsigg。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述高盐缓冲液包括2m nacl。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述高盐缓冲液包括2m kcl42.根据权利要求38所述的方法，其中步骤(e)中产生的所述hsigg改变为0.4m nacl并且ph 4.5。
43.一种制备高唾液酸化igg(hsigg)的方法，所述方法包括：(a)提供igg抗体混合物；(b)在包含凸1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)或其酶活性部分、udp-gal、st6ga1或其酶活性部分和cmp-nana的反应混合物中孵育所述igg抗体混合物，从而产生hsigg制剂；(d)在结合igg抗体的条件下将所述hsigg制剂施加到蛋白质a柱；以及(e)从所述蛋白质a柱洗脱所述hsigg。44.根据权利要求31至43中任一项所述的方法，其中所述b4galt或其酶活性部分为至少90％相同的seq id no：12或seq id no：13，并且所述st6gal或其酶活性部分包含为至少90％相同的seq id no：19或seq id no：20的氨基酸序列。45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igg抗体包括从至少1000个供体中分离的igg抗体。46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igg抗体的至少70％w/w是igg1抗体。47.根据权利要求45所述的方法，其中所述供体受试者的至少90％已经暴露于病毒。48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供igg抗体混合物的所述步骤包括：(a)提供来自至少1000个人类受试者的混合血浆；以及(b)从所述混合血浆中分离igg抗体混合物。49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从静脉内免疫球蛋白中分离所述igg抗体混合物。50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述igg抗体混合物是静脉内免疫球蛋白。51.根据权利要求48所述的方法，其中从所述混合血浆中分离igg抗体混合物的所述步骤包括乙醇沉淀或辛酸沉淀。52.根据权利要求48所述的方法，其中从所述混合血浆中分离igg抗体混合物的所述步骤包括将igg抗体结合到离子交换柱，以及从所述离子交换柱洗脱所述igg抗体。53.一种制备纯化的高唾液酸化(hsigg)组合物的方法，所述方法包括：(a)提供igg抗体混合物；(b)在包含凸1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)或其酶活性部分和udp-gal的反应混合物中孵育所述igg抗体混合物，以产生半乳糖基化igg抗体；(c)在包含st6gal或其酶活性部分和cmp-nana的反应混合物中孵育所述半乳糖基化igg抗体，以产生hsigg组合物；以及(d)从所述hsigg组合物中分离b4galt或其酶活性部分以及st6gal或其酶活性部分。54.根据权利要求24所述的方法，还包括从所述hsigg组合物中分离b4galt或其酶活性部分以及st6gal或其酶活性部分中的一者或两者。55.一种制备高唾液酸化(hsigg)的方法，所述方法包括：(a)提供igg抗体混合物；(b)在包含凸1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)或其酶活性部分、udp-gal、st6gal或其酶活性部分和cmp-nana的反应混合物中孵育所述igg抗体混合物，从而产生hsigg制剂；以及(c)从所述hsigg制剂中分离hsigg，以及从所述hsigg制剂中分离b4galt或其酶活性部
分以及st6gal或其酶活性部分。56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg上约60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述支链聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg上约80％或85％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg的fab结构域上至少60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述支链聚糖在α1，3臂和α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。59.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg上至少80％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。60.根据权利要求28所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。61.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg上至少85％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。62.根据权利要求30所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。63.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg上至少90％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。64.根据权利要求32所述的方法，其中在纯化之前，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。65.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg上约60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述支链聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg上约80％或85％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％、75％、80％或85％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。68.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg上至少80％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。69.根据权利要求28所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。70.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg上至少85％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。
71.根据权利要求30所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。72.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg上至少90％的所述支链fc聚糖在所述α1，3分支和所述α1，6分支两者上具有唾液酸。73.根据权利要求32所述的方法，其中在纯化之后，所述hsigg的所述fab结构域上至少60％、65％、70％的所述支链聚糖在所述α1，3臂和所述α1，6臂两者上具有通过neuac-α2，6-gal末端键连接的唾液酸。74.根据前述权利要求中任一项所述，还包括在色谱步骤之后分析一种或多种igg亚类的量。

技术总结
本发明描述了用于制备以及纯化高唾液酸化IgG的方法。化IgG的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：动量制药公司
技术研发日：2021.05.19
技术公布日：2023/2/23