用于实时PCR检测的多色系统的制作方法

用于实时pcr检测的多色系统
技术领域
1.本发明构思涉及一种用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统。本发明构思进一步涉及一种包括该系统的装置。


背景技术：

2.聚合酶链反应(pcr)通常用于dna的合成或复制。可以通过跟随与dna的量成比例的荧光信号来监测反应的进展。长度和序列不同的dna片段可以在相同的热过程中扩增，这被称为多重化。每个片段可以与不同的荧光波长相关联，并且可以使用单个或多个激发波长。
3.多重pcr实现荧光团在不同波长下的激发和检测是个问题。
4.pcr的其他问题与反应容器中反应的不均匀和反应液体中空气气泡的形成相关联。
5.对于具有多个反应室或多个反应液滴的用于pcr的微流体系统，需要有效地确定反应是在哪个室或液滴中发生的。
6.因此，需要能够处理和监测多重反应、也具有多个反应室的小型化pcr系统。进一步的需要包括在微流体pcr系统中检测空气气泡，这可能导致反应的终止或系统中的流体输送的中断。pcr系统的其他故障(例如，与加热循环或试剂供应有关的故障)对于检测是成问题的，并且典型地需要中断pcr。
7.在微小液滴中进行pcr的小型化系统中，需要对液滴的有效计数。而且，在多个平行反应隔室的情况下，需要有效地确定哪个隔室包括活性反应。解决方案可以基于使用标准荧光显微镜和多色荧光团，这些系统庞大且不适合小型化装置，并且进一步要求在过滤介质之间进行机械切换以处理多色荧光团，因此导致耗时且不连续的检测。


技术实现要素：

8.根据本发明构思的第一方面，提供了一种用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统，该系统包括：
9.通过第一激发光滤光片照射该微流体反应器的第一光源，该第一光源提供第一激发波长范围的光，该第一激发波长范围的光适于激发该微流体反应器中的第一荧光团，由此由该第一荧光团发射第一发射波长范围的荧光；
10.通过第二激发光滤光片照射该微流体反应器的第二光源，该第二光源提供第二激发波长范围的光，该第二激发波长范围的光适于激发该微流体反应器中的第二荧光团，由此由该第二荧光团发射第二发射波长范围的荧光；
11.第一发射滤光片，该第一发射滤光片适于透射该第一发射波长范围的荧光并且阻挡该第二发射波长范围的荧光，
12.第二发射滤光片，该第二发射滤光片适于透射该第二发射波长范围的荧光并且阻挡该第一发射波长范围的荧光；
13.第一成像光学器件，该第一成像光学器件适于通过透射通过该第一发射滤光片的该第一发射波长范围的荧光将该微流体反应器成像到第一成像表面上，由此在该第一成像表面上的图像指示该pcr反应的与该第一荧光团相关联的第一反应参数；以及
14.第二成像光学器件，该第二成像光学器件适于通过透射通过该第二发射滤光片的该第二发射波长范围的荧光将该微流体反应器成像到第二图像表面上，由此监测该pcr反应的与该第二荧光团相关联的第二反应参数。
15.根据本发明构思的第二方面，提供了一种包括根据第一方面的系统的装置。
附图说明
16.通过参照附图进行的以下说明性且非限制性的详细描述，将更好地理解本发明构思的以上及附加的目的、特征和优点。在附图中，除非另有说明，否则相同的附图标记将用于相同的元件。
17.图1是用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统的示意图示。
18.图2是用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统的实施例的示意图示。
19.图3是用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统的实施例的示意图示。
20.图4是用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统的实施例的示意图示。
21.图5是用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统的实施例的示意图示，展示了光源、滤光片和光学器件的不同定位。
具体实施方式
22.鉴于上文，将令人期望的是实现用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统，这些系统不受制于与现有技术相关联的问题。本发明构思的目的是解决这种问题并提供与现有技术相关的至少一个问题或需要的解决方案。可以从下文中理解进一步的和替代性的目的。
23.本文中涉及本发明构思的一个发明方面的披露内容总体上可以进一步涉及本发明构思的一个或多个其他方面。
24.根据本发明构思的第一方面，提供了一种用于监测微流体反应器中的pcr反应的系统，该系统包括：
25.通过第一激发光滤光片照射该微流体反应器的第一光源，该第一光源提供第一激发波长范围的光，该第一激发波长范围的光适于激发该微流体反应器中的第一荧光团，由此由该第一荧光团发射第一发射波长范围的荧光；
26.通过第二激发光滤光片照射该微流体反应器的第二光源，该第二光源提供第二激发波长范围的光，该第二激发波长范围的光适于激发该微流体反应器中的第二荧光团，由此由该第二荧光团发射第二发射波长范围的荧光；
27.第一发射滤光片，该第一发射滤光片适于透射该第一发射波长范围的荧光并且阻挡该第二发射波长范围的荧光，
28.第二发射滤光片，该第二发射滤光片适于透射该第二发射波长范围的荧光并且阻挡该第一发射波长范围的荧光；
29.第一成像光学器件，该第一成像光学器件适于通过透射通过该第一发射滤光片的
该第一发射波长范围的荧光将该微流体反应器成像到第一成像表面上，由此在该第一成像表面上的图像指示该pcr反应的与该第一荧光团相关联的第一反应参数；以及
30.第二成像光学器件，该第二成像光学器件适于通过透射通过该第二发射滤光片的该第二发射波长范围的荧光将该微流体反应器成像到第二图像表面上，由此监测该pcr反应的与该第二荧光团相关联的第二反应参数。
31.包括相应地与第一激发光滤光片和第二激发光滤光片相关联的第一光源和第二光源的系统允许在两个不同波长下连续且同时地照射微流体反应器，并且由此连续且同时地激发两种不同类型的荧光团。
32.该系统进一步包括第一发射滤光片和第二发射滤光片，允许连续且同时地透射来自这两种类型的荧光团的激发光。
33.相应地与第一激发光滤光片和第二激发光滤光片相关联的第一光源和第二光源相应地与第一发射滤光片和第二发射滤光片的组合使得能够同时有效且连续地监测两种类型的荧光团，并且由此能够连续且独立地监测例如两个反应参数或两种反应。提供多个光源而不是一个光源允许多个荧光团与该系统一起使用，而无需在不同的激发光滤光片之间进行切换。因此，允许了连续且并行地监测多于一个荧光团或反应参数。
34.与发射波长之一相关联的各个成像光学器件允许在成像表面上空间上分离地成像每种类型的荧光团。
35.成像表面使得能够监测来自pcr反应的空间信息。例如，可以监测微流体系统反应是在哪些位置发生的。空间信息连同用荧光检测可获得的定量分析允许在微流体反应器的空间上不同的位置处进行定量分析。
36.因此，该系统允许同时且连续地分析多个反应参数，每个反应参数与一种类型的荧光团相关，具有与微流体系统的位置相关的空间信息。因此，例如，即使对于多重pcr，也可以识别在系统中的何处发生了特异性pcr反应。进一步地，pcr反应中的变化可以与例如可用荧光团识别的反应参数(比如温度、反应物浓度或ph)的变化相关联。
37.该第一成像表面和该第二成像表面可以各自相应地对应于单个图像传感器的第一部分和第二部分，或者相应地对应于第一图像传感器和第二图像传感器，其中，该图像传感器的该第一部分和该第二部分、或者该第一图像传感器和该第二图像传感器各自适于提供对应成像表面的图像的数字表示。因此，可以有效地监测每种类型的荧光团。进一步地，对于每个荧光团可以获得单独的成像。
38.该单个图像传感器或者该第一图像传感器和该第二图像传感器可以是任何合适的图像传感器，比如本领域已知的用于感测图像的图像传感器。例如，该图像传感器可以是从由cmos成像传感器、scmos成像传感器和ccd传感器组成的组中选择的类型。
39.该单个图像传感器可以与两个或更多个成像像素相关联；并且该第一图像传感器和该第二图像传感器可以各自与一个或多个成像像素相关联。因此，可以实现该第一激发波长与该第二激发波长之间的分辨率。
40.该微流体反应器可以进一步包括用于输送例如反应物、反应产物、缓冲剂、流体、添加剂、以及清洁流体的微流体通道。可以通过主动泵或被动泵适当地布置液体到该系统、从该系统以及在该系统内的致动，这些泵可以进一步被整合在该系统中或可连接到该系统。
41.该第一光源和该第二光源可以被布置成连续地提供光，由此允许连续地监测该第一反应参数和该第二反应参数。
42.该第一光源和该第二光源以及任何可选的和附加的光源可以是led类型或宽光谱类型的。
43.应当理解，利用包括这些滤光片和该第一成像光学器件和该第二成像光学器件以及该第一成像表面和该第二成像表面的所述系统，可以用第一发射波长和第二发射波长连续且并行地照射微流体反应器。由此，不需要在激发光滤光片之间进行切换。进一步地，可以实现pcr反应的连续监测和微流体反应器的空间成像。由此，本发明的实施例可以受益于pcr反应的连续监测。
44.连续地提供光旨在描述光源不会频频开启和关闭。光源可以在监测开始和结束时开启和关闭，并且光源可以在分析或pcr反应的时段期间关闭，并且仍然被认为是连续的，如在本文中所使用的。通过本实施例，可以实现使第一光源和第二光源同时或并行地开启。
45.该第一光源和该第二光源、该第一发射滤光片和该第二发射滤光片、以及该第一成像光学器件和该第二成像光学器件可以被布置成与该微流体反应器的同一侧相对。因此，该系统可以以紧凑方式提供，并且提供荧光的高效成像，同时减少来自激发光或杂散光的干扰。
46.该第一荧光团和该第二荧光团可以被选择成使得该第一发射波长范围与该第二发射波长范围不重叠。由此可以避免或减少检测干扰。
47.该微流体反应器可以包括半透明壁部分，该半透明壁部分被布置成允许该微流体反应器的至少一部分的成像。由此，例如，有效地促进了关于pcr反应的空间信息。
48.该半透明壁部分对于包括该第一激发波长和该第二激发波长以及该第一发射波长和该第二发射波长的波长间隔可以是半透明的。
49.该第一发射滤光片可以进一步适于阻挡在该第一发射波长范围之外的光，并且该第二发射滤光片可以进一步适于阻挡在该第二发射波长范围之外的光。
50.该第一荧光团可以与在该pcr反应中产生的dna相关联，由此在该第一成像表面上的图像指示产生的dna的量。例如，该第一荧光团可以是结合到dna的荧光标记。
51.在若干不同dna序列的pcr期间，比如在多重pcr期间，该第一荧光团可以与第一dna序列相关联。第二荧光团或第三荧光团可以与第二dna序列或另一反应参数相关联。由此，使得能够在pcr期间监测不同dna序列的产生。
52.该第一反应参数和该第二反应参数可以是不同的并且可以各自选自由以下各项组成的组：在该微流体反应器中的温度、产生的dna的量、反应物的量以及ph。应当理解的是，技术人员也可以将该系统应用于其他参数。这些反应参数中的至少一个反应参数可以是产生的dna的量。
53.作为温度的反应参数可以通过例如温度敏感或随温度而变的荧光团来实现。
54.作为ph的反应参数可以通过例如ph敏感或随ph而变的荧光团来实现。
55.该系统可以进一步包括第一激发光学器件和第二激发光学器件，其中，该第一激发光学器件被布置成将光从该第一光源传递至该第一激发光滤光片，并且该第二激发光学器件被布置成将光从该第二光源传递至该第二激发光滤光片。
56.该激发光学器件和该成像光学器件可以各自包括一个布置，该布置包括一个或多
个透镜。
57.该系统可以进一步包括：通过第三激发光滤光片照射该微流体反应器的第三光源，该第三光源提供第三激发波长范围的光，该第三激发波长范围的光适于激发该微流体反应器中的第三荧光团，由此由该第三荧光团发射第三发射波长范围的荧光；
58.第三发射滤光片，该第三发射滤光片适于透射该第三发射波长范围的荧光并且阻挡该第一发射波长范围的荧光和该第二发射波长范围的荧光；以及
59.第三成像光学器件，该第三成像光学器件适于通过透射通过该第三发射滤光片的该第三发射波长范围的荧光将该微流体反应器成像到第三成像表面上，由此在该第三成像表面上的图像指示该pcr反应的与该第三荧光团相关联的第三反应参数，
60.其中，该第一发射滤光片和该第二发射滤光片进一步适于阻挡该第三发射波长范围的荧光。
61.该系统可以进一步包括第四至第十或更多光源、发射滤光片和成像光学器件，由此允许另外监测第四至第十或更多反应参数。
62.在具有包括多于第一光源和第二光源(比如附加的第三光源或另外第四至第十或更多光源)的系统的实施例中，该系统进一步包括单独地与每个光源相关联的光学器件、滤光片和荧光团，类似于第一光源和第二光源以及以上关于第三光源的描述。
63.该系统的第一和第二或更多荧光团可以是不同的，因为它们各自与彼此不同的激发波长和发射波长相关联。多于一种不同的荧光团(比如第一荧光团和第二荧光团)可以是单个结构(比如分子或粒子)的一部分(比如结合至单个结构)。
64.该微流体反应器可以包括第一反应隔室和第二反应隔室。
65.该微流体反应器可以包括第一反应隔室和第二反应隔室，其中，该第一成像光学器件进一步适于将该第一反应隔室成像在该第一成像表面上，并且该第二成像光学器件进一步适于将该第二反应隔室成像在该第二成像表面上。因此，可以监测单独的隔室中的平行反应。可以同时监测微流体装置上的反应隔室阵列。
66.该反应隔室可以是例如池、孔、室或通道。
67.该系统可以进一步包括处理装置。该处理装置可以用于温度控制该微流体反应器、控制这些光源和/或控制图像捕获。该处理装置还可以用于处理数据和/或将数据传递至监测装置。
68.根据本发明构思的第二方面，提供了一种包括根据第一方面的系统的装置。
69.第二方面总体上可以具有与第一方面相同的特征和优点。为了避免不适当的重复，由此参考以上同样适用于该装置的部分。还应注意，除非另有明确说明，否则发明构思涉及所有可能的特征的组合。
70.现在将参考附图在下文中对示例性实施例进行更全面的描述。然而，这些发明构思可以通过许多不同的形式来实施，并且不应该被解释为局限于本文阐述的实施例；相反，提供这些实施例以便获得彻底性和完整性，并且向技术人员充分传达发明构思的范围。
71.图1示意性地展示了用于监测微流体反应器2中的pcr反应的系统1。系统1包括通过第一激发光滤光片6照射微流体反应器2的第一光源4，该第一光源提供第一激发波长范围8的光，该第一激发波长范围的光适于激发微流体反应器2中的第一荧光团(未展示)，由此由第一荧光团发射第一发射波长范围10的荧光。第二光源14通过第二激发光滤光片16照
射微流体反应器2，该第二光源提供第二激发波长范围18的光，该第二激发波长范围的光适于激发微流体反应器2中的第二荧光团，由此由第二荧光团发射第二发射波长范围20的荧光。第一发射滤光片30适于透射第一发射波长范围10的荧光并且阻挡第二发射波长范围20的荧光。第二发射滤光片40适于透射第二发射波长范围20的荧光并且阻挡第一发射波长范围10的荧光。第一成像光学器件32适于通过透射通过第一发射滤光片30的第一发射波长范围10的荧光将微流体反应器2成像到第一成像表面34上，由此在第一成像表面34上的图像指示pcr反应的与第一荧光团相关联的第一反应参数。第二成像光学器件42适于通过透射通过第二发射滤光片40的第二发射波长范围20的荧光将微流体反应器2成像到第二图像表面44上，由此监测pcr反应的与第二荧光团相关联的第二反应参数。
72.为了改善对系统1的理解，在图1中已通过箭头示意性地展示了激发光和发射光，尽管这些箭头可能不对应或展示光的真实光束宽度或行为。
73.尽管第一图像表面34和第二图像表面44可以被看做(如图1中所展示的)单独的表面，但它们可以是单个图像传感器的部分或对应于单独的传感器。
74.激发波长范围的光谱可以不与发射波长范围的光谱重叠。由此，可以减少或避免由杂散光或不与发射相关联的光引起的成像干扰。
75.该系统可以进一步包括加热布置(未展示)，该加热布置被配置成加热该微流体反应器或该微流体反应器的一个或多个部分。由此可以实现用于pct反应的加热循环。
76.虽然图1中未展示，但pcr反应可以在多个微流体隔室(比如阵列)中进行。利用本发明构思的系统，可以有效地确定该多个隔室中的哪些反应隔室包括进展的或主动的pcr反应。微流体隔室可以是微液滴，并且该系统可以包括微液滴阵列。
77.图2示意性地展示了用于监测多重pcr的系统1的使用。在所展示的示例中，复制了两种类型的dna分子(例如，长度和或/序列不同)：由实线展示的第一dna 50和由虚线展示的第二dna 52。在示例中，在微流体反应器2的微流体反应隔室中同时对第一dna 50和第二dna 52进行pcr。该示例的反应隔室是微流体芯片上的隔室。为了改善清楚性，没有展示流体、单体以及用于这些反应的任何其他合适的添加剂。第一dna 50与第一荧光团54相关联，并且第二dna 52与第二荧光团56相关联。进一步展示的是第一光源4和第二光源14，这些光源相应地通过第一激发光滤光片6和第二激发光滤光片16照射微流体反应器2。在示例中，由这些光源提供的第一激发波长范围8和第二激发波长范围18的光通过半透明底部部分58照射整个反应室，由此整个微流体反应器2中的荧光团54、56被光照射。第一荧光团54和第二荧光团56以及第一激发光滤光片4和第二激发光滤光片14被选择成使得荧光团被光激发，从而导致相应地由第一荧光团54和第二荧光团56发射第一发射波长范围10和第二发射波长范围20的荧光。荧光团54、56的发射光在示例中与所产生的第一dna 50和第二dna 52的浓度相关联，因此可以确定浓度。为了确定浓度，例如可以使用标准曲线。发射光的至少一部分将通过底部部分58照出，并且由此，第一发射波长范围10和第二发射波长范围20的荧光将到达第一发射滤光片30和第二发射滤光片40，基于荧光团的已知数据，该第一发射滤光片和该第二发射滤光片相应地适于透射第一发射波长范围10和第二发射波长范围20的荧光。光源、荧光团和滤光片被进一步选择成使得激发光不与发射光重叠。发射光的至少部分由此到达第一发射滤光片30和第二发射滤光片40，该第一发射滤光片和该第二发射滤光片适于相应地透射第一发射波长范围和第二发射波长范围的荧光，并且相应地阻挡第二
发射波长范围和第一发射波长范围的荧光。因此，透射光随后到达第一成像光学器件32和第二成像光学器件42，该第一成像光学器件和该第二成像光学器件将微流体反应器成像到第一成像表面34和第二成像表面44上。由此，来自整个微流体反应器2的第一荧光团54的荧光将被成像在第一图像传感器60的第一成像表面34上，并且来自整个微流体反应器2的第二荧光团56的荧光将被成像在第二图像传感器62的第二成像表面44上，其中，各个传感器适于提供对应成像表面的图像的数字表示。第一图像传感器和第二图像传感器各自与一个或多个成像像素(例如，最高达一百、一千或数百万像素)相关联。由此，荧光团以及因此间接的dna被可视化的反应室的图像可以被提供具有足以提供空间信息(举例而言)的分辨率。例如，可以可视化或确定芯片pcr反应的哪些部分是活性的或非活性的。这与确定反应参数(比如温度和/或ph)的可能性相结合，使得能够在pcr反应的活性或进展与温度或ph之间进行关联。进一步地，对于包括多个反应位置(比如反应隔室、通道或微液滴)的微流体反应器2，多个像素所允许的空间信息可以提供关于各反应位置中的活性的信息。在图2中进一步展示的是处理装置100，该处理装置可以连接至根据发明构思的系统1或包括在该系统中，例如用于对微流体反应器2进行温度控制、控制光源和/或控制图像捕获。
78.在参考图2展示的示例中，被包括在微流体反应器2上的单个反应隔室被展示为包括正在被监测的pcr反应。在监测pcr反应时使用了两个光源。该系统可以替代性地使用两个光源来监测微流体反应器的两个部分。例如，微流体反应器2可以包括相应地用于复制第一dna 50和第二dna 52的第一反应隔室和第二反应隔室。
79.根据如图3所展示的本发明构思的实施例的一个示例，系统1可以具有第一成像光学器件32和第二成像光学器件42，这两者适于将微流体反应器2的相同区域99或部分(例如，反应隔室70)相应地成像在第一成像表面34和第二成像表面44上。未展示第一发射滤光片30和第二发射滤光片40以及第一激发光滤光片6和第二激发光滤光片16。第一光源4和第二光源14照射微流体反应器2的相同区域或部分。第一荧光团54和第二荧光团56(未展示)可以被选择成对于pcr反应相应地确定例如所产生的dna的浓度和单体的浓度或存在。使用这种系统，可以确定pcr反应的进展并且与单体的浓度相关。例如，如果dna浓度没有增加或者指示不存在dna，并且存在少的单体或者指示不存在单体，则可以确定单体的提供可能存在问题。替代性地，可以选择第二荧光团以指示温度，或者可以存在第三光源和荧光团，该第三光源和荧光团可以用于除了监测dna和单体浓度之外或与监测dna和单体浓度并行地监测温度。然后可以确定dna的非预期或不期望的浓度是否与温度和/或单体的浓度有关。
80.图4示意性地展示了系统1，其中单独地监测微流体反应器2的第一部分17和第二部分19。由此可以监测每个部分中的pcr反应的进展。第一部分和第二部分可以是第一反应隔室和第二反应隔室70。进一步展示了第一光源4和第二光源14，其各自照射第一部分17和第二部分19的至少一部分。它们可以照射整个微流体反应器。还进一步展示了：第一激发光滤光片6和第二激发光滤光片16；第一发射滤光片30和第二发射滤光片40；第一成像光学器件32，该第一成像光学器件适于将第一部分17(例如，第一反应隔室)成像在第一成像表面3上；以及第二成像光学器件42，该第二成像光学器件适于将第二部分19(例如，第二反应隔室)成像在第二成像表面44上。利用这样的系统1，例如，可以相应地监测包括用于第一dna和第二dna的pcr反应的第一反应隔室和第二反应隔室70的微流体反应器2。替代性地，可以监测微流体隔室70内的不同部分。pcr反应的进展可以可选地与确定的第三反应参数(比如
温度、ph或试剂的浓度)相关。例如，例如通过确定没有产生dna或dna的产生没有遵循预定模式或所产生的dna的浓度是非预期的,可以确定在一个或多个反应隔室70中的pcr反应是有故障的。关于例如温度在期望范围之外的附加信息可以提供故障原因的指示并进一步指示温度应当被调整。
81.根据本发明构思的另一个实施例，微流体反应器2可以具有多个微流体反应隔室70，例如，微流体反应器2可以包括1个至100个或更多个微流体反应隔室70。本发明构思的实施例允许监测全部或一些微流体隔室的pcr反应。例如，可以确定在任何给定时间或在一段时间内在哪个隔室中发生pcr。进一步地，可以识别气泡形成。例如，可以确定所产生的dna的定性和/或定量测量，并且可以比如通过监测与dna的产生相关联的荧光团来确定在每个隔室或一组隔室中的pcr的发展。非预期的发展可能与反应参数有关或相关，例如，在一个或多个隔室或一组隔室中dna的非预期的低产量可能与不期望的温度关联。该系统还可以有利地用于包括充当反应器的多个微液滴(比如一个或多个阵列)的微流体反应器2。
82.图5的a至图5的h展示了根据本发明构思的系统1的实施例。图5的a至图5的h展示了微流体反应器2以及光源90、可选的激发光学器件92、成像光学器件94、激发光滤光片96、发射滤光片98、成像表面102和成像传感器104的定位的不同示例。第一至第四组光源90、激发光学器件92和激发光滤光片96相应地由a到d表示。第一至第四组发射滤光片98、成像光学器件94和成像表面102相应地由i-iv表示。第一至第四图像传感器104由104a至104d指示。
83.在图5的a至图5的h中展示的示例中，每个成像表面对应于单个图像传感器，而在图5的e至图5的g中展示的示例中，每个成像表面对应于单个图像传感器的一部分。图5的h展示了将对应于单个图像传感器的一个成像表面与对应于单个成像传感器的多个部分的多个成像表面结合的示例。