用于治疗病毒的方法

用于治疗病毒的方法
发明领域
1.本公开总体上涉及用于治疗或预防通过血管紧张素转换酶2(ace2)感染受试者的病毒对受试者的感染的方法。
2.背景
3.新发传染病的爆发继续挑战人类健康。在世界许多地方，新发和再发人畜共患病的报告发病率正在增加。严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)于17年前首次出现(drosten et al.,identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome,n engl j med(2003)348,1967-1976)。2019年12月，一种新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2，“sars-cov-2”)跨越物种障碍感染人类，并在人与人之间有效传播，导致肺炎爆发。sars-cov-2引起的冠状病毒病-19(covid-19)具有从轻度疾病到重度肺损伤和多器官衰竭的流感样症状，最终导致死亡，尤其在具有其他合并症的老年患者中。
4.sars-cov-2是一种正义单链rna( ssrna)病毒，属于β-冠状病毒家族，与其他致病性人β-冠状病毒(包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(“sars-cov”，也称为sars-cov-1)和中东呼吸综合征冠状病毒(“mers-cov”))具有实质性的遗传和功能相似性。与其他冠状病毒一样，sars-cov-2具有四种结构蛋白，称为s(刺突)、e(包膜)、m(膜)和n(核衣壳)蛋白。刺突蛋白是负责让sars-cov-2病毒附着在宿主细胞膜上的蛋白质，sars-cov-2的刺突蛋白的受体结合结构域(“rbd”)识别并附着于宿主细胞的血管紧张素转化酶2(“ace2”)受体，以将其用作细胞进入的机制。
5.ace2是肾素血管紧张素系统(ras)的关键金属蛋白酶，主要作为膜锚定锌金属蛋白酶存在，其在血液循环中起作用并在受影响的器官中诱导局部效应，以及通过血液循环诱导全身效应。ace2在血管系统以及大多数器官中表达，但主要在肺、肾、肝、心脏、肠和睾丸中表达。在正常成人肺中，ace2主要在肺泡上皮ii型细胞中表达，该细胞可作为病毒库。这些细胞产生降低表面张力的表面活性剂，从而防止肺泡塌陷，因此对肺的气体交换功能至关重要。人ace2的过表达被确定会增加感染sars-cov的小鼠的疾病严重程度，证明ace2依赖性病毒进入细胞是关键步骤(yang et al.,2007)。还有报道称，向小鼠注射sars-cov刺突降低ace2表达水平，从而加重肺损伤(imai et al.,2005；kuba et al.,2005)。因此，ace2既可作为sars-cov的进入受体，又可保护肺部免受损伤。
6.一些靶向ace2破坏rbd和ace2相互作用的破坏剂已被证明抑制sars-cov感染。然而，鉴于ace2在体内的重要生理作用，这些药剂可能具有不希望的副作用。另一方面，靶向rbd的破坏剂因此更有利。
7.目前没有可用的sars-cov-2特异性的治疗方法。因此，本领域迫切需要治疗和/或预防病毒(尤其是冠状病毒)对受试者的感染。
8.发明概述
9.在整个本公开中，冠词“一个”、“一种”和“该”在本文中用于指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。
10.在一方面，本公开提供用于治疗或预防通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的方法，其包括向受试者施用有效量的重组ace2(race2)。
11.在另一方面，本公开提供了ace2在制备用于治疗或预防通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的药物中的用途。
12.在又一方面，本公开提供ace2用于治疗或预防通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的用途。
13.在一方面，本公开提供了用于治疗或预防通过ace2感染细胞或组织的病毒对细胞或组织的感染的体外方法，其包括向细胞或组织施用有效量的race2。在一些实施方案中，组织是肺、血管、肠、肾、肝、脑或心脏。在一些实施方案中，细胞是肺细胞、血管细胞、肠细胞、肾细胞、肝细胞、脑细胞或心脏细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞或非人哺乳动物细胞。
14.在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的方法，其包括向受试者施用有效量的race2。在一些实施方案中，本公开提供了用于预防通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的方法，其包括向受试者施用有效量的race2。
15.在一些实施方案中，病毒是冠状病毒、流感病毒、埃博拉病毒或马尔堡病毒或假型病毒家族的成员。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒选自sars-cov、sars-cov-2和mers-cov。在另一实施方案中，冠状病毒是sars-cov-2。
16.在一些实施方案中，ace2是重组ace2。在一些实施方案中，ace2是重组人ace2。在另一实施方案中，ace2是可溶性ace2。在又一实施方案中，ace2是可溶性重组人ace2。在一些实施方案中，ace2是糖基化的。在一些实施方案中，ace2的可能的n-糖基化位点的至少85％、88％、90％、92％、95％或99％是糖基化的。在一些实施方案中，ace2的糖基基团以总共至少10、11、12、13、14、15或至少16个唾液酸残基，优选至少14个唾液酸残基存在。在一些实施方案中，rhace2包含seq id no:1的氨基酸18-740的氨基酸序列。在一些实施方案中，rhace2与seq id no:2的氨基酸序列至少90％、92％、95％、98％或99％相同。
17.在一些实施方案中，ace2以单体、二聚体形式或多聚体形式存在。在一些实施方案中，ace2以二聚体形式存在。在一些实施方案中，ace2以同二聚体形式存在。在另一个实施方案中，ace2以多聚体形式存在。在一些实施方案中，使用接头以二聚化或多聚化rhace2。在一些实施方案中，接头是fc区。在一些实施方案中，rhace2是gsk2586881。
18.在一些实施方案中，受试者是人。
19.在一些实施方案中，方法用于治疗或预防病毒对受试者的组织的感染。在一些实施方案中，方法用于治疗或预防冠状病毒对受试者的组织的感染。在一些实施方案中，方法用于治疗或预防sars-cov-2对受试者的组织的感染。在一些实施方案中，组织是肺、血管、肠、肾、肝、脑或心脏。在一些实施方案中，通过向受试者施用有效量的ace2来预防或治疗受试者的肺、血管、肠、肝、心脏、脑或肾的感染。
20.在一些实施方案中，病毒通过在肺细胞上表达的ace2感染受试者。在另一实施方案中，病毒通过在肺泡上皮ii型细胞上表达的ace2感染受试者。在一些实施方案中，病毒通过在血管细胞上表达的ace2感染受试者。在另一实施方案中，病毒通过在毛细血管细胞上表达的ace2感染受试者。在一些实施方案中，病毒通过在心脏细胞上表达的ace2感染受试
者。在一些实施方案中，病毒通过在肾细胞上表达的ace2感染受试者。在一些实施方案中，病毒通过在肠细胞上表达的ace2感染受试者。在一些实施方案中，病毒通过在肝细胞上表达的ace2感染受试者。在一些实施方案中，病毒通过在脑细胞上表达的ace2感染受试者。在一些实施方案中，病毒通过在睾丸细胞上表达的ace2感染受试者。
21.在一些实施方案中，ace2以药物组合物施用于受试者。在一些实施方案中，ace2以药学上可接受的制剂施用于受试者。
22.在一些实施方案中，通过静脉内、皮内、肌肉内注射、口服施用或吸入施用ace2。
23.在一些实施方案中，以0.01-10mg/kg的剂量施用race2。在一些实施方案中，以0.01-1mg/kg的剂量施用race2。在另一实施方案中，以0.4mg/kg的剂量施用race2。在一些实施方案中，每天施用两次ace2。在另一实施方案中，每天施用一次ace2。在一些实施方案中，ace2连续施用至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。在另一实施方案中，ace2连续施用不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。
24.在一些实施方案中，方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，方法进一步包括向受试者施用用于治疗感染或并发症的第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗病毒剂或抗炎剂。在一些实施方案中，抗病毒剂是羟氯喹。在一些实施方案中，第二治疗剂是rna依赖性rna聚合酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂(nnrti)、核苷逆转录酶抑制剂(nrti)、嘌呤核苷、抗病毒干扰素、金刚烷抗病毒化合物或任何其他合适的抗病毒剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、洛匹那韦、利托那韦、apn01、法匹拉韦、美沙拉秦、托瑞米芬、依普利酮、帕罗西汀、西罗莫司、放线菌素d、厄贝沙坦、大黄素、巯嘌呤、褪黑素、奎纳克林、卡维地洛、秋水仙素、樟脑、马烯雌酮、羟甲烯龙、萘莫司他、卡莫司他，其衍生物，或其任何组合。
25.附图简要说明
26.下列附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开。
27.图1a显示了分离的sars-cov-2的病毒颗粒的电子显微术图像。图1b显示了将分离的sars-cov-2映射到进化枝a3的系统发育树。图1c显示了瑞典sars-cov-2与sars-cov-2s和l型的序列比对，表明瑞典分离株属于l型。
28.图2a-2b是使用光学显微术的人毛细血管类器官的图像(放大倍数x10)。图2c是通过使用抗cd31检测内皮细胞和抗pdgfrβ检测周细胞对人毛细血管类器官进行免疫染色的图像(比例尺，500μm和50μm)。
29.图3a是一组条形图，显示可溶性rhace2抑制vero-e6细胞的sars-cov-2感染，其取决于接种物中病毒的初始数量和可溶性rhace2的剂量。图3b是一组条形图，显示等效的重组小鼠可溶性ace2不抑制感染。
30.图4a是一组条形图，显示可溶性rhace2处理对子代病毒的影响。图4b是一组条形图，显示等效的重组小鼠可溶性ace2不抑制vero-e6细胞的sars-cov-2感染。
31.图5a是一组条形图，显示在用sars-cov-2感染后第3天和第6天(dpi)来自血管类器官的病毒rna，表明该病毒可以感染血管类器官。图5b是条形图，显示受感染的人血管类器官产生子代病毒，其取决于初始感染水平。图5c是条形图，显示可溶性rhace2对人血管类
器官的sars-cov-2感染的影响。
32.图6显示人重组ace2的氨基酸序列(seq id no:1)。
33.图7显示了人ace2的全长氨基酸序列(seq id no:2)。氨基酸1-17是信号序列，18-740形成细胞外结构域，741-761形成跨膜结构域，且762-805形成细胞质结构域。
34.图8显示当前研究中用于rt-qpcr分析的引物和探针列表(seq id no:3-8)。
35.发明详述
36.本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各种实施方案。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下可以进行各种等同物、改变和修改，并且应当理解，此类等同实施方案将被包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均通过引用整体并入本文。
37.在一方面，本公开提供了用于治疗或预防通过血管紧张素转化酶2(ace2)感染受试者的病毒对受试者的感染的方法，其包括向受试者施用有效量的重组血管紧张素转化酶2(race2)。
38.本文所用的术语“感染”是指病毒和相关试剂如类病毒和朊病毒对生物体的组织或细胞的侵袭，它们的增殖和与宿主细胞的反应，以及由此产生的病状和疾病。
39.如本文所用的术语“病毒”是指包括亲本病毒及其子代病毒的病毒颗粒，其可以是传染性的或非传染性的。病毒的增殖取决于其对特定宿主细胞的破坏倾向和环境条件。在病毒感染的营养周期中，子代病毒的增殖可以是快速的。这种感染周期通常导致细胞死亡和许多病毒子代的释放。
40.如本文所用的术语“通过血管紧张素转化酶2感染受试者的病毒”是指其感染涉及ace2的任何病毒。在一些实施方案中，病毒使用ace2作为受体。在一些实施方案中，病毒使用ace2作为受体。在一些实施方案中，病毒使用ace2作为受体进入宿主细胞。在一些实施方案中，通过ace2感染受试者的病毒是冠状病毒、流感病毒、埃博拉病毒或马尔堡病毒或假型病毒家族的成员。在一些实施方案中，通过ace2感染受试者的病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。
41.如本文所用的术语“ace2”是指作为胞外酶定位在内皮细胞和其他细胞表面上的锌金属酶和羧肽酶。虽然其主要底物似乎是ang ii，但它可以水解许多其他生理底物。人ace2(uniprot序列数据库条目：q9byf1)包含信号肽(氨基酸1至17)、细胞外结构域(氨基酸18至740)、螺旋跨膜结构域(氨基酸741至761)和细胞质结构域(氨基酸762至805)。在本发明中，ace2可以是全长的ace2多肽或其片段。
42.当关于多肽或多核苷酸使用时，术语“重组”是指通过重组方法产生的多肽或多核苷酸。重组多肽包括由重组多核苷酸表达的任何多肽。重组多核苷酸包括已通过引入至少一个外源(即外来的，通常是异源的)核苷酸或改变多核苷酸的至少一个天然核苷酸组分而修饰的任何多核苷酸，并且不需要包括所有的编码序列或与编码序列天然相关的调控元件。重组载体是指非天然存在的载体，包括例如包含重组多核苷酸序列的载体。
43.在一些实施方案中，race2是可溶性race2。在一个实施方案中，可溶性race2没有跨膜结构域。在一些实施方案中，可溶性race2包含ace2胞外结构域的氨基酸序列或其任何片段，或由其组成。在一个实施方案中，可溶性ace2包含seq id no:2的氨基酸374至378。在
一些实施方案中，可溶性ace2包含或seq id no:2的氨基酸18-740或由其组成。在一些实施方案中，可溶性ace2由seq id no:2的氨基酸18至615组成。在一些实施方案中，可溶性ace2以单体、二聚体或多聚体形式存在。
44.本文使用的race2可以任选地被糖基化。天然人ace2的可溶性结构域具有七个n-糖基化位点。在一个实施方案中，对应于seq id no:2的asn53、asn90、asn103、asn322、asn432、asn546、asn690的ace2多肽的3、4、5、6或7个可能的n-糖基化位置被糖基化，和/或ace2多肽具有大于10％(总ace2多肽的重量百分比)或11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％，特别是大于20％、21％、22％、23％、24％或25％重量的含糖量。在一些实施方案中，rhace2多肽的可能n-糖基化位点的至少85％、88％、90％、92％、95％或99％是糖基化的。
45.如本文所用的术语“唾液酸残基”是指n-乙酰神经氨酸类型(neu5ac)的残基，尤其是n-糖基化或o-糖基化。
46.race2可以通过本领域熟知的常规方法制备。产生ace2多肽的示例性方法描述于wo2008/151347中，其全部内容通过引用并入本文。race2也可以商购获得。在一些实施方案中，race2是gsk2586881。
47.术语“多肽”或“蛋白质”是指通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串。多肽和蛋白质可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖基化的)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“多肽”或“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其功能部分。普通技术人员将进一步理解，多肽或蛋白质有时可以包括多于一条多肽链，例如二聚体。二聚体优选为同二聚体，特别是其单体单元具有相同的序列和糖基化。通常，二聚体的单体单元是非共价结合的。该术语还包括氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应的天然存在的氨基酸的化学类似物和聚合物。
48.如本文所用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非另有说明，特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见batzer et al.,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka et al.,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini et al.,mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
49.关于氨基酸序列(或核酸序列)的“百分比(％)序列同一性”定义为在比对序列并且如果需要引入空位以实现最大数目的相同氨基酸(或核酸)之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可以或不可以被视为是相同的残基。出于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的目的的比对可以例如使用公众可获得的工具来实现，诸如blastn、blastp(可在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的网站上获得，另外参见，altschul s.f.et al.,j.mol.biol.,215:403
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410(1990)；stephen f.et al.,nucleic acids res.,25:3389
–
3402(1997))，clustalw2(可在欧洲生物信息学研究所的网站上获得，另外参见，higgins d.g.et al.,methods in enzymology,266:383-402(1996)；larkin m.a.et al.,bioinformatics(oxford,england),23(21):2947-8(2007))和align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可
以使用工具提供的默认参数，或者可以定制适合于比对的参数，例如通过选择合适的算法。
50.如本文所用，本文所用的术语“样品”是指从感兴趣的受试者获得或衍生的生物标本。样品包含待表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体，例如基于物理、生物化学、化学和/或生理表征。
51.如本文所用的术语“受试者”是指被通过ace2感染受试者的病毒感染或处于被所述病毒感染的风险中的人和非人动物。在一些实施方案中，受试者是人。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
52.术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒介物、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成制剂的其他成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理学上相容。
53.如本文所用的术语“治疗效果”是指由药理活性物质在受试者，特别是人中引起的局部或全身效果。因此，该术语意指旨在用于治疗或预防感染或疾病，或用于增强受试者所需的身体或精神发育和状况的任何物质。
54.本文使用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指有效预防、改善和/或治疗由病毒(优选sars-cov-2)感染引起的病状的ace2的量。如本文所用，“改善”可指减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或病毒(优选sars-cov-2)感染的任何其他可测量的表现。在一个实施方案中，ace2的治疗有效量(即，有效剂量)的范围为约0.01-10mg/kg体重，优选约0.01-5mg/kg体重，更优选约0.1-1mg/kg体重，甚至更优选约0.1-0.8mg/kg、0.2-0.7mg/kg、0.3-0.6mg/kg或0.4-0.5mg/kg。本领域技术人员将理解某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于感染、疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。
55.此外，用治疗有效量的ace2治疗受试者可以包括单一治疗，或者优选地，可以包括一系列治疗。在一些实施方案中，受试者用约0.01-10mg/kg体重范围内的ace2治疗，每天一次或每天两次，持续约1至30天。在一些实施方案中，ace2连续施用至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。在一些实施方案中，ace2连续施用不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。还应当理解，ace2的有效剂量或用于治疗的方案可以在特定治疗过程中改变。剂量和/或方案的变化可来自诊断分析的结果。
56.术语“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”包括例如特定作用、功能或相互作用的减少、限制或阻碍。在一些实施方案中，如果感染的至少一种症状得到缓解、终止、减缓或预防，则感染被“抑制”。如本文所用，如果病毒的复制减少、减缓、延迟或阻止，感染也被“抑制”。
57.当提及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”是指分子彼此之间的物理接触(例如，结合)。通常，此类相互作用导致一个或两个所述分子的活性(其产生生物学效应)。rhace2与冠状病毒(优选sars-cov-2)刺突蛋白的rbd之间的相互作用可抑制冠状病毒刺突蛋白rbd与其结合配体(如受试者细胞上表达的ace受体)之间的结合相互作用。
58.如本文所用的术语感染、疾病、病症或病状的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻感染、疾病、病症或病状，减缓感染、疾病、病症或病状的发生或发展速度，降低发展感染、疾病、病症或病状的风险，预防或延迟与感染、疾病、病症或病状相关的症状的发展，减少或终止与感染、疾病、病症或病状相关的症状，产生疾病、病症或病状的完全或部分消退，治愈疾病、病症或病状，或其一些组合。需要治疗的那些包括已经患有由病毒(优选sars-cov-2)感
染引起的病状的那些以及其中要预防病毒(优选sars-cov-2)感染的那些。从病毒(优选sars-cov-2)感染中部分或完全康复的受试者也可能需要治疗。预防涵盖抑制或减少病毒(优选sars-cov-2)的传播，或抑制或减少与病毒感染(优选sars-cov-2)相关的一种或多种症状的发生、发展或进展。
59.术语“预防”、“防止”、“防范”、“预防性治疗”等是指降低受试者发展感染、疾病、病症或病状的可能性，所述受试者未患有但处于发展感染、疾病、病症或病状的风险中或易发生感染、疾病、病症或病状。
60.本公开提供了用于治疗或预防通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的方法，其包括向受试者施用药物组合物中有效量的race2。在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的race2和一种或多种药学上可接受的载体。
61.用于本文所公开的药物组合物中的药学上可接受的载体可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、张力调节剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质，本领域已知的其他组分，或其各种组合。
62.合适的组分可以包括例如填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。在一些实施方案中，合适的缓冲剂可包括例如磷酸盐缓冲剂或mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)缓冲剂。
63.为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如水性媒介物，例如氯化钠注射液、林格注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格注射液，非水性媒介物例如植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂例如氯化钠或右旋糖，缓冲剂例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂或mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲剂，抗氧化剂例如硫酸氢钠，局部麻醉剂例如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂例如聚山梨醇酯80(tween-80)、多价螯合剂或螯合剂例如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺或环糊精的试剂。
64.药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
65.药物组合物的形式取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或待施用剂量。药物组合物可以配制用于静脉内、口服、鼻、直肠、经皮或肌肉内施用。例如，用于静脉内施用的剂型，可以配制成冻干粉剂或液体制剂；用于鼻施用的剂型可以方便地配制成气雾剂、溶液、滴剂、凝胶剂或干粉剂。根据所期望的施用途径，药物组合物可以配制成片剂、胶囊、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒、小袋(sachets)、扁囊剂(cachets)、锭剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、喷雾剂、吸入剂或栓剂。
66.在某些实施方案中，将药物组合物配制成可注射组合物。可注射药物组合物可以以任何常规形式制备，例如液体溶液、悬浮液、乳液或适于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。用于注射的制剂可包括准备注射的无菌和/或非热性溶液、准备在临使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(诸如冻干粉末)(包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在临使用前与媒介物组合的无菌干燥不溶性产品以及无菌和/或非热性乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
67.在某些实施方案中，单位剂量肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。如本领域已知和实践的，所有用于肠胃外施用的制剂应该是无菌的并且不发热。
68.根据施用途径，race2可以用选定的材料包衣或置于选定的材料中，以保护其免受可对其进行预期功能的能力产生不利影响的自然条件的影响。它可以单独施用，或与药学上可接受的载体联合施用。它也可以作为前药施用，其在体内转化为其活性形式。
69.本公开提供用于治疗或预防通过ace2感染受试者的病毒对受试者的感染的方法，其包括向受试者施用有效量的race2或包含有效量的race2的药物组合物。
70.在某些实施方案中，被治疗或预防的感染是冠状病毒或由冠状病毒引起。在某些实施方案中，被治疗或预防的感染由sars-cov-2引起。在某些实施方案中，受试者是人。
71.race2或包含有效量的race2的药物组合物可以通过本领域已知的任何途径施用，诸如例如肠胃外(例如皮下、腹膜内、静脉内，包括静脉内输注、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
72.在某些实施方案中，race2可以单独施用或与有效量的第二治疗剂组合施用。在一些实施方案中，第二治疗剂是抗病毒剂。在一个实施方案中，抗病毒剂是羟氯喹。在一些实施方案中，第二治疗剂是rna依赖性rna聚合酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂(nnrti)、核苷逆转录酶抑制剂(nrti)、嘌呤核苷、抗病毒干扰素、金刚烷抗病毒化合物或任何其他合适的抗病毒剂。在某些实施方案中，第二治疗剂选自下组：瑞德西韦、氯喹、羟氯喹、洛匹那韦、利托那韦、apn01、法匹拉韦、美沙拉秦、托瑞米芬、依普利酮、帕罗西汀、西罗莫司、放线菌素d、厄贝沙坦、大黄素、巯嘌呤、褪黑素、奎纳克林、卡维地洛、秋水仙素、樟脑、马烯雌酮、羟甲烯龙、萘莫司他、卡莫司他，其衍生物，或其任何组合。
73.在这些实施方案的某些中，race2可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用，并且在这些实施方案的某些中，race2和另外的治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的race2不必与该药剂同时施用或在与该药剂相同的组合物中施用。在另一种药剂之前或之后施用的race2被认为是与该药剂“组合”施用，如该短语在本文中所用，即使race2和第二药剂通过不同的途径施用。在可能的情况下，根据另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表，或根据physicians
′
desk reference 2003(physicians
′
desk reference,57th ed；medical economics company；isbn:1563634457；57th edition(november 2002))或本领域熟知的方案，施用与race2组合施用的另外的治疗剂。
74.在这些实施方案的某些中，race2可以以约0.01-10mg/kg体重，优选约0.01-5mg/kg体重，更优选约0.1-1mg/kg体重，甚至更优选约0.1-0.8mg/kg，0.2-0.7mg/kg，0.3-0.6mg/kg或0.4-0.5mg/kg的剂量施用于受试者。在这些实施方案的某些中，可向受试者连续施用race2至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。在另一实施方案中，可向受试者
连续施用race2不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。在这些实施方案的某些中，可以将race2每天两次施用于受试者。
75.提供以下实施例是为了更好地说明要求保护的发明，而不应解释为限制本发明的范围。下文所述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体的组合物、材料和方法并非旨在限制本发明，而仅仅是为了说明落入本发明范围内的具体实施方案。本领域技术人员可以在不行使发明能力且不背离本发明范围的情况下开发等效的组合物、材料和方法。应当理解，可以在本文描述的程序中做出许多变化，同时仍然保持在本发明的范围内。发明人的意图是这些变化包括在本发明的范围内。
76.实施例1.材料和方法
77.a.sars-cov-2颗粒的分离和培养
78.从瑞典covid-19确诊患者的鼻咽样品中分离出sars-cov-2，并在vero-e6细胞上培养。如前所述(becker et al.,synthetic recombinant bat sars-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice,proc natl acad sci u s a 105,(2008)19944-19949)，在感染后72小时使用其中细胞固定的蚀斑测定法滴定病毒。通过下一代测序对分离的sars-cov-2进行测序(genbank登录号mt093571)。培养的sars-cov-2颗粒在电子显微术下显示原型冠状形状(图1a，使用35％戊二醛灭活病毒原液用于电子显微术)，并通过使用gisaid(https://www.gisaid.org/)的系统发育分析，其属于进化枝a3，如图1b所示。关于分离的瑞典sars-cov-2作为s或l亚型的一部分的定义，如先前所述(参见tang,x.,wu,c.,li,x.,song,y.,yao,x.,wu,x.,duan,y.,zhang,h.,wang,y.,qian,z.,et al.(2020).on the origin and continuing evolution of sars-cov-2.national science review)，使用sequencher 5.4.6软件(gene codes corporation)检查核苷酸位置8782(orf1ab中)的t(s型)或c(l型)核苷酸，并检查位置28144(orf8中)的c(s型)或t(l型)。结果显示该毒株是l亚型的成员(参见图1c)。
79.b.重组人ace2和鼠ace2
80.临床级重组人ace2(氨基酸1-740)由polymun scientific(合同制造商)根据良好生产实践指南从cho细胞生产，并配制成生理水溶液。鼠ace2的等效结构域类似地在无血清条件下在cho细胞中过表达，并通过依次在deae-sepharose上进行捕获步骤、硫酸铵沉淀、通过hic-phenyl sepharose柱纯化，随后通过superdex 200凝胶过滤柱纯化来纯化。鼠蛋白质的纯度通过hplc确定，浓度通过280nm光度测量确定。
81.c.人毛细血管类器官
82.人毛细血管类器官从诱导性多能干细胞(ipscs)工程化，并且可以如前所述进行免疫染色(参见wimmer et al.,generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells,nat protoc 14,(2019)3082-3100，其全部内容通过引用并入本文)。毛细血管类器官非常类似于具有管腔、cd31

内皮衬壁、pdgfr

周细胞覆盖以及基底膜形成的人毛细血管(wimmer et al.,human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy,nature 565,(2019)505-510)。使用光学显微术(放大倍数
×
10)的血管毛细血管类器官的示例性图像显示在图2a-2b中。通过使用抗cd31来检测内皮细胞和使用抗pdgfrβ来检测周细胞，对毛细血管类器官进行免疫染色(图2c)。
83.g.vero-e6细胞培养
84.vero-e6细胞(atcc)在补充有1％非必需氨基酸(thermofisher scientific)、10mm hepes(thermofisher scientific)和10％ fbs的dulbecco改良eagle培养基(dmem，thermofisher scientific)中在37℃、5％ co2下生长。
85.i.用于sars cov-2 rna的qrt-pcr
86.使用direct-zol rna miniprep试剂盒(zymo research)提取样品。按照世界卫生组织的指南使用e基因sars-cov-2引物/探针进行qrt-pcr。rnase p用作内源性基因对照，以标准化细胞内病毒rna的水平。
87.表1.用于qrt-pcr的引物/探针
[0088][0089]
统计数据
[0090]
使用graphpad prism 8(graphpad)进行所有统计分析，并通过学生t检验确定显著性。
[0091]
实施例2.重组人ace2在体外抑制sars-cov-2感染
[0092]
1.可溶性rhace2阻断sars-cov-2对细胞的感染
[0093]
将vero e6细胞接种在含有10％ fbs的dmem的48孔板(每孔5
×
104个细胞)(sarstedt)中24小时。将不同浓度的可溶性rhace2(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)与sars-cov-2(v/v＝1:1)以100μl/孔的终体积在dmem(0％fbs)中在37℃下混合。sars-cov-2以每种浓度分别为103个噬斑形成单位(pfu，moi 0.02)、105pfu(moi 2)和106pfu(moi 20)的量混合。然后将混合物加入vero-e6细胞的培养基中。感染后1小时(h.p.i.)用pbs洗涤细胞3次，并与不含可溶性rhace2的新鲜完全培养基一起孵育。感染后15小时，用pbs洗涤细胞3次，然后在通过qrt-pcr进行病毒rna检测分析前使用trizol
tm
(thermo fisher)裂解。通过qrt-pcr测定作为复制的标志物的sars-cov-2rna。**p《0.01；***p《0.001。结果显示在图3a中。数据表明可溶性rhace2抑制sars-cov-2与细胞的附着，并且这种抑制取决于接种物中病毒的初始量和可溶性rhace2的剂量，从而建立剂量依赖性。
[0094]
将vero e6细胞接种在含有10％ fbs的dmem的48孔板(每孔5
×
104个细胞)(sarstedt)中24小时。将浓度分别为6μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的等效可溶性重
组小鼠ace2(可溶性rmace2，以与可溶性rhace2相同的方式生产)与sars-cov-2(v/v＝1：1)在dmem(0％fbs)中以每孔100μl的终体积在37℃下混合30分钟。sars-cov-2以每种浓度分别为103pfu(moi 0.02)、105pfu(moi 2)和106pfu(moi 20)的量混合。然后将混合物加入vero-e6细胞的培养基中。在1h.p.i后用pbs洗涤细胞3次，并与不含rmace2的新鲜完全培养基一起孵育。感染后15小时，用pbs洗涤细胞3次，然后在通过qrt-pcr进行病毒rna检测分析前使用trizol
tm
(thermo fisher)裂解。通过qrt-pcr测定作为复制的标志物的病毒rna。结果显示在图3b中。数据表明可溶性重组小鼠ace2不显著影响vero-e6细胞的sars-cov-2感染，突出了可溶性rhace2在阻断sars-cov-2进入中的特异性。
[0095]
2.可溶性rhace2减少sars-cov-2感染
[0096]
将vero e6细胞接种在含有10％fbs的dmem的48孔板(每孔5
×
104个细胞)(sarstedt)中24小时。将不同浓度的可溶性rhace2(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml)与sars-cov-2(v/v＝1:1)以100μl/孔的终体积在dmem(0％fbs)中在37℃下混合。sars-cov-2以每种浓度分别为103pfu(moi 0.02)、105pfu(moi 2)和106pfu(moi 20)的量混合。然后将混合物加入vero-e6细胞的培养基中。不移除接种物。感染后15小时，用pbs洗涤细胞3次，然后在通过qrt-pcr进行病毒rna检测分析前使用trizol
tm
(thermo fisher)裂解。通过qrt-pcr测定病毒rna。结果显示在图4a中。在可溶性rhace2存在下观察到显著降低的病毒感染(学生t检验:*p《0.05；**p《0.01)。这可能是因为可溶性rhace2抑制子代病毒，导致病毒感染显著减少。
[0097]
将vero e6细胞接种在含有10％fbs的dmem的48孔板(每孔5
×
104个细胞)(sarstedt)中24小时。将浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的等效可溶性rmace2与sars-cov-2(v/v＝1:1)在dmem(0％fbs)中以每孔100μl的终体积在37℃下混合30分钟。sars-cov-2以每种浓度分别为103pfu(moi 0.02)、105pfu(moi 2)和106pfu(moi 20)的量混合。然后将混合物加入vero-e6细胞的培养基中。不移除接种物。感染后15小时，用pbs洗涤细胞3次，然后在通过qrt-pcr进行病毒rna检测分析前使用trizol
tm
(thermo fisher)裂解。通过qrt-pcr测定病毒rna。结果显示在图4b中。数据表明，可溶性rmace2不显著影响vero-e6细胞的sars-cov-2感染，突出了可溶性rhace2在减少sars-cov-2感染中的特异性。
[0098]
3.细胞毒性测定
[0099]
为了确定重组人或小鼠ace2是否对细胞有毒，将每孔104个vero e6细胞接种在96孔板中。接种后24小时，一式三份添加25μl不同浓度(从25到200μg/ml)的race2，并孵育15小时。处理后15小时，按照制造商的方案，使用发光细胞活力测定法(promega)测定细胞毒性。添加人或小鼠race2对vero-e6细胞没有毒性(数据未显示)。
[0100]
实施例3.sars-cov-2感染人血管类器官以及重组人ace2抑制感染
[0101]
sars-cov-2感染人血管类器官
[0102]
在96孔超低附着板的每孔50μl体积中，在含有15％ fbs(gibco目录10500064)、100ng/ml vegf-a(peprotech目录号100-2)和100ng/ml fgf-2(milteny biotech目录号130-093-841)的stempro完全培养基中，用102、104或106个sars-cov-2感染性颗粒感染人血管类器官群1小时。感染后1小时，用pbs洗涤血管类器官3次，并保存在100μl相应的培养基中(含有15％ fbs、100ng/ml vegf-a和100ng/ml fgf-2的stempro完全培养基)3到6天。在
感染后第3天(3dpi)，将某些类器官用pbs洗涤3次，然后用trizol
tm
(thermofisher)裂解。然后通过qrt-pcr分析样品中的sars-cov-2rna的存在。在感染后第6天(6dpi)，将其他类器官用pbs洗涤3次，然后用trizol
tm
(thermofisher)裂解。然后通过qrt-pcr分析样品中的sars-cov-2rna的存在。我们可以检测到血管类器官中的病毒rna，其中病毒rna从感染后第3天到第6天增加(参见图5a)，表明sars-cov-2的活跃复制。
[0103]
在感染后第6天，回收了血管类器官的上清液。使用100μl的每种上清液感染48孔板中的vero e6。感染后48小时回收细胞并合并(5个血管类器官/条件)，并使用qrt-pcr通过病毒rna检测来确定感染水平。在感染后第6天收集的受感染类器官的上清液有效感染了vero e6细胞(图5b)，表明受感染的血管类器官可产生感染性子代病毒，这取决于初始感染水平。
[0104]
重组人ace2抑制人血管类器官的sars-cov-2感染
[0105]
在stempro 34完全培养基中，将不同浓度的可溶性rhace2(50μg/ml和100μg/ml)与106个sars-cov-2颗粒在37℃下以每孔50μl的最终体积混合30分钟。然后在37℃下用混合物感染血管类器官1小时。然后将类器官用pbs洗涤3次，并加入100μl/孔的新培养基(含有15％fbs、100ng/ml vegf-a和100ng/ml fgf-2的stempro完全培养基)。将类器官孵育3天。为了检测细胞内病毒rna，将类器官用pbs洗涤3次，合并(5个类器官/条件)，并在分析前使用trizol
tm
(thermofisher)裂解。然后通过qrt-pcr评估sars-cov-2rna的水平。rhace2显著降低血管类器官中sars-cov-2感染的水平(学生t检验:**p《0.01)，如图5c所示。可以看出，人血管类器官可以容易地被sars-cov-2感染，并且这种感染可以被rhace2显著抑制。
[0106]
这些数据表明，sars-cov-2感染的主要部位似乎是肺部，然后sars-cov-2在局部组织(如肾和肠)感染之前感染血管。
[0107]
实施例4.sars-cov-2感染人肺和心脏类器官
[0108]
鉴于心脏表达高水平的ace2并且心脏改变是我们的ace2突变小鼠中观察到的第一个表型这一事实(参见crackower,m.a.,sarao,r.,oudit,g.y.,yagil,c.,kozieradzki,i.,scanga,s.e.,oliveira-dos-santos,a.j.,da costa,j.,zhang,l.,pei,y.,et al.(2002).angiotensin-converting enzyme 2is an essential regulator of heart function.nature 417,822-828)，肺和心脏类器官可能与covid-19患者的多器官功能障碍有关。本公开的类似方法可用于测试sars-cov-2对人心脏类器官和肺类器官的感染。
[0109]
*************
[0110]
根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法和用途。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的方法和用途，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法和方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
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