一种光控裂解工程菌及其构建方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种光控裂解工程菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.现有的癌症疗法存在对系统的高毒性、对肿瘤的低靶向性以及对肿瘤组织内部的低渗透性问题，高风险以及低收益的治疗手段使得发展新的肿瘤治疗技术迫在眉睫。工程化细菌由于自身特殊的性质可以完美解决这些问题，它可以靶向肿瘤组织的所有区域，在其中定植，并且可以作为携带治疗药物的载体。为了避免传统药物造成的系统性毒性，如何严格控制细菌在到达肿瘤组织时释放药物是一个需要解决的问题。
3.有研究报道通过对细菌加以改造后，施加2戈瑞电离辐射强度的刺激，细菌的基因组会被破坏而激活sos响应，reca启动子开启表达合成可分泌的治疗药物，对肿瘤进行治疗。sos系统的开启虽然可以让reca启动子表达，但是由于自身基因组遭到破坏，细菌是否继续维持其功能性值得商榷。还有工作在沙门氏菌内构建了一个由tet启动子控制的λ噬菌体裂解基因表达系统，在外源加入四环素或者四环素类似物之后，细菌可以被诱导裂解从而释放治疗药物。类似的工作还有采用阿拉伯糖诱导启动子表达来自另一噬菌体ieps5的裂解基因使沙门氏菌裂解释放治疗药物，或者用乙酰水杨酸诱导。
4.现有的技术主要依赖于外界化学小分子或者肿瘤内部微环境刺激细菌产生治疗药物，进入体内后外界无法对其行为进行控制，且化学小分子的诱导是一种不可逆过程，一旦发生就无法停止。并且化学小分子诱导物可能存在毒副作用以及被代谢系统降解，例如沙门氏菌的代谢系统可以将阿拉伯糖转化为木酮糖，低浓度的阿拉伯糖无法诱导相应启动子的表达。另一种基于reca修复系统的触发方式由于会对工程菌基因组产生破坏，系统本身的鲁棒性会受到难以估量的影响，且辐射源不易获得，因此也不是理想的诱导方式。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供一种光控裂解工程菌，旨在解决现有技术诱导工程菌裂解释放药物不可控且有毒副作用的问题。
6.为实现上述目的，本发明第一方面提出一种光控裂解工程菌，包括：
7.光敏基因表达盒，表达得到光敏蛋白，所述光敏蛋白受光调控合成信使分子；
8.抗终止基因表达盒，所述抗终止基因表达盒的启动子受所述信使分子调控，表达得到抗终止蛋白；
9.裂解基因表达盒，所述裂解基因表达盒的启动子受所述抗终止蛋白调控，表达得到裂解蛋白，用于裂解所述工程菌；其中，
10.当调控所述光敏蛋白的光强达到裂解阈值时，所述裂解蛋白的表达量使所述工程菌裂解。
11.可选地，所述光敏基因表达盒和所述裂解基因表达盒整合到所述工程菌的基因组
中，所述抗终止基因表达盒存在于外源质粒中。
12.可选地，所述工程菌还包括：
13.药物基因表达盒，表达得到药物蛋白，当所述工程菌裂解后，所述药物蛋白从所述工程菌释放。
14.可选地，所述药物基因表达盒与所述抗终止基因表达盒存在于同一个外源质粒中。
15.可选地，所述光敏基因包括bphs、ilac*、ilad9、ilam4和ilam5中的任一种；
16.所述信使分子包括c-di-gmp或camp；
17.所述抗终止基因表达盒的启动子包括受c-di-gmp调控的cdra启动子、pel启动子或psl启动子，或者受camp调控的lac启动子；
18.所述抗终止基因包括λ噬菌体的q蛋白；
19.所述裂解基因包括lkd16。
20.本发明第二方面提出一种光控裂解工程菌的构建方法，包括质粒构建和质粒转化，所述质粒构建包括：
21.光敏基因表达载体的构建，所述光敏基因表达得到光敏蛋白，所述光敏蛋白受光调控合成信使分子；
22.抗终止基因表达载体的构建，所述抗终止基因表达载体的启动子受所述信使分子调控，表达得到抗终止蛋白；
23.裂解基因表达载体的构建，所述裂解基因表达载体的启动子受所述抗终止蛋白调控，表达得到裂解蛋白，用于裂解所述工程菌；
24.所述质粒转化包括：
25.将上述构建好的光敏基因表达载体、抗终止基因表达载体和裂解基因表达载体转化到出发菌中得到所述光控裂解工程菌。
26.可选地，所述光敏基因表达载体和所述裂解基因表达载体由自杀质粒构建得到，所述抗终止基因表达载体由复制质粒构建得到，所述光敏基因和所述裂解基因整合到所述工程菌的基因组中，所述抗终止基因以质粒形式存在。
27.可选地，所述质粒构建还包括：
28.药物基因表达载体的构建，所述药物基因表达得到药物蛋白；
29.所述质粒转化还包括：
30.将构建的药物基因表达载体转化到出发菌中得到所述光控裂解工程菌；
31.其中，
32.当所述工程菌裂解后，所述药物蛋白从所述工程菌释放。
33.可选地，所述药物基因表达载体和所述抗终止基因表达载体构建到同一质粒上。
34.可选地，所述光敏基因包括bphs、ilac*、ilad9、ilam4和ilam5中的任一种；
35.所述信使分子包括c-di-gmp或camp；
36.所述抗终止基因表达载体的启动子包括受c-di-gmp调控的cdra启动子、pel启动子或psl启动子，或者受camp调控的lac启动子；
37.所述抗终止基因包括λ噬菌体的q蛋白；
38.所述裂解基因包括lkd16。
39.本发明第三方面提出一种药物组合物，包括上述第一方面任一项所述的一种光控裂解工程菌。
40.本发明第四方面提出上述第一方面任一项所述的一种光控裂解工程菌在制备治疗肿瘤药物中的应用。
41.本发明第五方面提出一种肿瘤治疗系统，其特征在于，包括肿瘤治疗装置和肿瘤治疗药物；
42.所述肿瘤治疗药物包括上述第一方面任一项所述的一种光控裂解工程菌；
43.所述肿瘤治疗装置包括激光元件，所述激光元件可发射光源；其中，
44.所述肿瘤治疗系统在使用的时候，将所述肿瘤治疗药物注射到待治疗肿瘤部位，然后使用所述肿瘤治疗装置的光源照射所述肿瘤部位，
45.当所述光强达到裂解阈值时，所述光控裂解工程菌裂解释放菌内治疗物。
46.本发明技术方案在工程菌中构建光敏基因表达盒、抗终止基因表达盒和裂解基因表达盒，可分别表达得到光敏蛋白、抗终止蛋白和裂解蛋白，通过光敏蛋白在光调控下合成信使分子，信使分子诱导抗终止蛋白表达，抗终止蛋白诱导裂解蛋白表达，并且当调控光敏蛋白的光强达到裂解阈值时，所述裂解蛋白的表达量能够使所述光控裂解工程菌裂解，从而释放菌内物质。从而本发明技术方案得到的光控裂解工程菌在外界光源的刺激下，当光强低于裂解阈值时，细菌可以正常生长；当光强达到裂解阈值时，细菌裂解，实现了工程菌的可控裂解，并且无毒副作用。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
48.图1为本发明光控裂解工程菌一实施例的基因结构示意图；
49.图2为本发明光控裂解工程菌另一实施例的基因结构示意图；
50.图3为mini-ctx2质粒的图谱示意图；
51.图4为pucp20质粒的图谱示意图；
52.图5为minitn7质粒的图谱示意图；
53.图6为pex18gm质粒的图谱示意图；
54.图7为本发明光控裂解工程菌抗终止基因表达盒的rbs筛选部分结果图；
55.图8a为本发明光控裂解工程菌治疗小鼠肿瘤实验的肿瘤体积结果图；
56.图8b为本发明光控裂解工程菌治疗小鼠肿瘤实验的小鼠体重结果图；
57.图8c为本发明光控裂解工程菌治疗小鼠肿瘤实验的肿瘤重量结果图；
58.图9a至图9d为对照菌株治疗小鼠肿瘤实验的结果图；
59.图10为本发明光控裂解工程菌治疗小鼠肿瘤实验的组织切片染色结果图；
60.图11a为pbad-b0034-q-pjn105质粒和pr
’‑
tr
’‑
mscarlet-minitn7质粒的结构示意图；
61.图11b为测试pr
’‑
tr’启动子-终止子转录系统在pao1菌种中的背景表达水平以及
诱导表达水平的显微镜观察结果；
62.图11c为mscarlet荧光强度的定量结果；
63.图12a为本发明实施例标定rbs光响应强度的质粒结构示意图；
64.图12b为本发明实施例随机合成的rbs的相对强度标定结果图。
65.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
66.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
67.本文所用的术语“基因表达盒”是指由启动子，靶基因，筛选基因和终止子组成，能在特定组织中表达并易于检测的一组dna序列，该dna序列可以存在于外源表达载体中，也可以整合到特定组织的基因组中。
68.术语“表达载体(expression vectors)”是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、rbs、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本发明包括但不限于原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或其它细胞表达载体。
69.术语“质粒”是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核dna之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状dna分子，是常用的克隆载体，用于构建表达载体。
70.术语“自杀质粒”为r质粒的衍生质粒，常有宿主范围广的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制，利用自杀质粒的该特性可以将外源基因整合到细菌基因组中。
71.本发明第一方面提出一种光控裂解工程菌，请参阅图1，包括：
72.光敏基因表达盒，表达得到光敏蛋白，所述光敏蛋白受光调控合成信使分子；
73.抗终止基因表达盒，所述抗终止基因表达盒的启动子受所述信使分子调控，表达得到抗终止蛋白；
74.裂解基因表达盒，所述裂解基因表达盒的启动子受所述抗终止蛋白调控，表达得到裂解蛋白，用于裂解所述工程菌；其中，
75.当调控所述光敏蛋白的光强达到裂解阈值时，所述裂解蛋白的表达量使所述工程菌裂解。
76.上述光敏基因表达盒、抗终止基因表达盒、裂解基因表达盒整合到细菌基因组，或者以外源质粒形式存在可以为任意组合。详细而言，例如可以为光敏基因表达盒整合到细菌基因组，抗终止基因表达盒和裂解基因表达盒以质粒形式存在；还可以为裂解基因表达盒整合到细菌基因组，光敏基因表达盒和抗终止基因表达盒以质粒形式存在。上述基因表达盒的形式不限于所举例这些，其他实施例不再一一例举，可以理解的是，凡是通过基因工程构建的菌株包括上述光敏基因表达盒、抗终止基因表达盒以及裂解基因表达盒都属于本发明技术方案保护的范围。
77.具体的，光敏基因表达盒的启动子为组成型启动子，可以持续表达光敏蛋白，光敏蛋白在光照射下可以合成信使分子，信使分子的浓度一方面促进生物被膜的形成，另一方面促进抗终止蛋白的表达，促进细菌裂解。光强大小与合成的信使分子浓度成正相关，因此，光强大小也与抗终止蛋白的产生浓度成正相关。在一优选实施例中，所述光敏基因表达盒通过构建在自杀质粒中整合到细菌基因组中，提高光敏基因遗传稳定性。
78.具体的，抗终止基因表达盒的启动子为诱导型启动子，受信使分子的浓度调控表达得到抗终止蛋白，抗终止蛋白可以特异的阻止终止子的作用，使酶越过终止子继续转录。
79.具体的，裂解基因表达盒的启动子为启动子-终止子(pr
’‑
tr’)系统，其中，抗终止蛋白不表达或表达浓度低时，裂解基因表达盒的pr
’‑
tr’系统在终止子的作用下不转录，因而无法表达得到裂解蛋白，当抗终止蛋白的表达浓度足够多时，抗终止蛋白可以阻止pr
’‑
tr’系统的终止子的作用，使得裂解基因正常转录表达得到裂解蛋白，从而对细菌进行裂解。
80.由此可见，抗终止蛋白的浓度与裂解蛋白的浓度成正相关，因而，调控光敏蛋白的光强大小与裂解蛋白的表达浓度成正相关。因此可以理解，调控光敏蛋白的光强的裂解阈值即为可以使得裂解蛋白的表达量使工程菌裂解的光强值。达到裂解阈值可以为与裂解阈值相同，也可以为超过裂解阈值。还应当说明的是，对于不同的工程菌，由于其性质不同，即使其采用本发明技术方案进行改造，其裂解阈值也有可能不同，因此，本发明技术方案对于具体的裂解阈值不做具体限定。
81.本发明技术方案在工程菌中构建光敏基因表达盒、抗终止基因表达盒和裂解基因表达盒，可分别表达得到光敏蛋白、抗终止蛋白和裂解蛋白，通过光敏蛋白在光调控下合成信使分子，信使分子诱导抗终止蛋白表达，抗终止蛋白诱导裂解蛋白表达，并且当调控光敏蛋白的光强达到裂解阈值时，所述裂解蛋白的表达量能够使所述光控裂解工程菌裂解，从而释放菌内物质。从而本发明技术方案得到的光控裂解工程菌在外界光源的刺激下，当光强低于裂解阈值时，细菌可以正常生长；当光强达到裂解阈值时，细菌裂解，实现了工程菌的可控裂解，并且无毒副作用。
82.可选地，所述光敏基因表达盒和所述裂解基因表达盒整合到所述工程菌的基因组中，所述抗终止基因表达盒存在于外源质粒中。
83.可选地，请参阅图2，所述工程菌还包括：
84.药物基因表达盒，表达得到药物蛋白，当所述工程菌裂解后，所述药物蛋白从所述工程菌释放。
85.可选地，所述药物基因表达盒与所述抗终止基因表达盒存在于同一个外源质粒中。
86.可选地，所述光敏基因包括bphs、ilac*、ilad9、ilam4和ilam5中的任一种；
87.所述信使分子包括c-di-gmp或camp；
88.所述抗终止基因表达盒的启动子包括受c-di-gmp调控的cdra启动子、pel启动子或psl启动子，或者受camp调控的lac启动子；
89.所述抗终止基因包括λ噬菌体的q蛋白；
90.所述裂解基因包括lkd16。
91.具体的，bphs受近红外光调控可合成信使分子c-di-gmp；ilac*、ilad9、ilam4和
ilam5受近红外光调控可合成信使分子camp。
92.在一实施例中，所述光敏基因为bphs；所述信使分子为c-di-gmp；所述抗终止基因表达盒的启动子为cdra启动子。
93.本发明第二方面提出一种光控裂解工程菌的构建方法，包括质粒构建和质粒转化，所述质粒构建包括：
94.光敏基因表达载体的构建，所述光敏基因表达得到光敏蛋白，所述光敏蛋白受光调控合成信使分子；
95.抗终止基因表达载体的构建，所述抗终止基因表达载体的启动子受所述信使分子调控，表达得到抗终止蛋白；
96.裂解基因表达载体的构建，所述裂解基因表达载体的启动子受所述抗终止蛋白调控，表达得到裂解蛋白，用于裂解所述工程菌；
97.所述质粒转化包括：
98.将上述构建好的光敏基因表达载体、抗终止基因表达载体和裂解基因表达载体转化到出发菌中得到所述光控裂解工程菌。
99.具体的，所述出发菌例如可以为铜绿假单胞菌、大肠杆菌或沙门氏菌等。
100.可选地，所述光敏基因表达载体和所述裂解基因表达载体由自杀质粒构建得到，所述抗终止基因表达载体由复制质粒构建得到，所述光敏基因和所述裂解基因整合到所述工程菌的基因组中，所述抗终止基因以质粒形式存在。
101.可选地，所述质粒构建还包括：
102.药物基因表达载体的构建，所述药物基因表达得到药物蛋白；
103.所述质粒转化还包括：
104.将构建的药物基因表达载体转化到出发菌中得到所述光控裂解工程菌；
105.其中，
106.当所述工程菌裂解后，所述药物蛋白从所述工程菌释放。
107.可选地，所述药物基因表达载体和所述抗终止基因表达载体构建到同一质粒上。
108.可选地，所述光敏基因包括bphs、ilac*、ilad9、ilam4和ilam5中的任一种；
109.所述信使分子包括c-di-gmp或camp；
110.所述抗终止基因表达载体的启动子包括受c-di-gmp调控的cdra启动子、pel启动子或psl启动子，或者受camp调控的lac启动子；
111.所述抗终止基因包括λ噬菌体的q蛋白；
112.所述裂解基因包括lkd16。
113.具体的，bphs受近红外光调控可合成信使分子c-di-gmp；ilac*、ilad9、ilam4和ilam5受近红外光调控可合成信使分子camp。
114.在一实施例中，所述光敏基因为bphs；所述信使分子为c-di-gmp；所述抗终止基因表达盒的启动子为cdra启动子。
115.本发明第三方面提出一种药物组合物，包括上述第一方面任一项所述的一种光控裂解工程菌。
116.本发明第四方面提出上述第一方面任一项所述的一种光控裂解工程菌在制备治疗肿瘤药物中的应用。
117.本发明第五方面提出一种肿瘤治疗系统，其特征在于，包括肿瘤治疗装置和肿瘤治疗药物；
118.所述肿瘤治疗药物包括上述第一方面任一项所述的一种光控裂解工程菌；
119.所述肿瘤治疗装置包括激光元件，所述激光元件可发射光源；其中，
120.所述肿瘤治疗系统在使用的时候，将所述肿瘤治疗药物注射到待治疗肿瘤部位，然后使用所述肿瘤治疗装置的光源照射所述肿瘤部位，
121.当所述光强达到裂解阈值时，所述光控裂解工程菌裂解释放菌内治疗物。
122.下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
123.下述实施例中所使用的引物序列如表1所示。
124.表1为所用引物序列表
125.pr'-lkd-ass-r：ctgcaggaattcctcgagaagctttcagtctccttgattcagggcgtn7-pr'-ass-f：ctgcaggaattcctcgagaagctttcagtctccttgattcagggcgtn7-ass-f：aagcttctcgaggaattcctgcagtn7-ass-r：ggtacctcgcgaaggccttgbphs-ctx-f：gataccgtcgacctcgaaccccacgcccctcgabphs-ctx-r:ggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgpa1o4o3-f:ctcactatagggcgaattgggtacctgccacctgacgtctaagaaaccatbphs-r:cggccgctctagaactagttccttcatacccgccgggcq-f：tgagtaggacaaatccgcccccgggctaaactgatgcagcgtagttttcgtcgtttgcpcdra-r：attaatgtgagttagctcacgaattctggaaggttccttggcggcagcggapucp-q-r：gacgaaaactacgctgcatcagtttagcccgggggcggatttgtcctactcaggapucp-f：aattcgtgagctaactcacattaattgcgttgcgpucp-r：aagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgpucp-pcdra-q-f：actagtgggttcgaggtcgacggtatcgataagctagcttj23118-f：taaaacgacggccagtgccaagcttttgacggctagctcagtcctaggtahlye-pucp-r：ataccgtcgacctcgaacccactagtttagacttcaggtacctcaaagagtgtcttttt
126.实施例1光控裂解工程菌的构建
127.1.1质粒构建
128.1.1.1光敏基因bphs表达载体的构建
129.本方案中以能够在肺部有效定植的铜绿假单胞菌pao1作为出发菌，以此为基础构建光控裂解工程菌。
130.光敏基因bphs(seq id no.1)编码得到光敏蛋白bphs(seq id no.2)，光敏蛋白bphs可以在近红外光调控下合成c-di-gmp，光强大小与合成的c-di-gmp浓度成正相关，bphs表达载体构建在自杀质粒minictx2中(质粒图谱见图3所示)，以通过自杀质粒将bphs基因及其相关表达元件整合到细菌基因组中，相关表达元件包括组成型启动子pa1/o4/o3(seq id no.3)，光响应组件bpho(seq id no.4)，使得bphs蛋白可以持续表达。其中，从上海生工生物有限公司合成pa1o4o3-bphs-bpho基因片段，并利用引物对pa1o4o3-f和bphs-r
对其进行聚合酶链式pcr反应，minictx2质粒利用引物对bphs-ctx-f和bphs-ctx-r进行聚合酶链式pcr反应，以获得带有25个碱基同源臂的能持续性表达光响应组件bpho和bphs的基因片段以及线性化的载体质粒minictx2，最后利用吉布森连接法(gibson assembly)将2个基因片段连接，即构建得到bphs表达载体pa1/o4/o3-bphs-ctx2。
131.1.1.2抗终止基因q表达载体的构建
132.其中抗终止基因q(seq id no.5)来自λ噬菌体基因组，通过gibson assembly构建到载体质粒pucp20(质粒图谱见图4所示)中，pucp20质粒为可自主复制的外源质粒，通过该质粒构建抗终止基因q表达载体，抗终止基因q不会整合到细菌基因组中，而是以外源质粒形式存在，这样可以方便对抗终止基因q的表达进行调整。
133.抗终止基因q表达载体使用的启动子为响应c-di-gmp的cdra启动子(seq id no.6)，c-di-gmp的浓度越高，抗终止基因q表达载体表达得到的抗终止蛋白q(seq id no.7)越多。
134.首先人工合成以pao1为宿主进行碱基优化的pcdra-q基因片段，分别通过引物q-f和pcdra-r进行聚合酶链式pcr反应得到带有同源臂的pcdra-q片段，通过引物pucp-q-r和pucp-f进行聚合酶链式pcr反应得到线性化的pucp20载体片段；然后利用gibson assembly方法将pcdra-q碱基片段插入到pucp20中，从而构建载体pcdra-q-pucp20。然后将抗终止基因q前的rbs进行批量置换筛选，即得到一系列pcdra-rbs-q-t0/t1-pucp20质粒。
135.1.1.3hlye基因表达载体的构建
136.hlye(血溶素e)基因(seq id no.8)采用组成型启动子j23118(seq id no.9)，持续表达hlye蛋白(seq id no.10)，通过pcr方法获得j23118-hlye基因片段(引物为j23118-f和hlye-pucp-r)，模板为人工合成；随后通过吉布森连接法在pcdra-rbs-q-t0/t1-pucp20质粒(线性化载体引物为pucp-pcdra-q-f和pucp-r)的t0/t1双终止子后插入j23118-hlye基因片段，最终得到pcdra-rbs-q-t0/t1-j23118-hlye-pucp20质粒，可以同时表达抗终止蛋白q和药物hlye。
137.1.1.4裂解基因lkd16表达载体的构建
138.裂解基因lkd16(seq id no.11)表达得到裂解蛋白lkd16(seq id no.12)，为了降低裂解基因lkd16的背景表达水平，选用了来自λ噬菌体的启动子-终止子转录系统(pr
’‑
tr’)(seq id no.13)作为lkd16表达载体的启动子，该系统在抗终止蛋白q存在时可以正常转录下游基因，当抗终止蛋白q不存在时，由于终止子的存在，导致启动子pr’无法表达下游lkd16基因。因此设计将裂解基因lkd16放置在pr
’‑
tr’控制下，同时希望将其整合到工程菌基因组上，提升其稳定性的同时进一步降低其表达量，因此将裂解基因lkd16构建到自杀质粒minitn7(质粒图谱见图5所示)中。为了避免抗终止蛋白q累计造成的泄露表达，我们在抗终止基因q后加上了ssra水解标签(seq id no.14)。
139.首先人工合成pr
’‑
tr
’‑
lkd16基因片段，通过pcr获得pr
’‑
tr
’‑
lkd16基因片段(引物：pr'-lkd-ass-r/tn7-pr'-ass-f)和线性化的minitn7质粒(引物：tn7-ass-f/tn7-ass-r)，从而将合成裂解基因lkd16和pr
’‑
tr’基因序列插入minitn7质粒，从而得到pr
’‑
tr
’‑
b0034-lkd-t0/t1-minitn7质粒。
140.1.2质粒转化
141.将上述构建出来的质粒在测序正确后通过电转的方法转入铜绿假单胞菌pao1中
对其进行工程化改造。
142.1.2.1lkd16表达载体和bphs表达载体的转化
143.首先将pr'-tr'-b0034-lkd-t0/t1-minitn7质粒在辅助质粒ptns2的帮助下，电转至野生型铜绿假单胞菌pao1中，然后涂板于lb gen30(30微克每毫升庆大霉素)的琼脂培养板上，挑取12小时后长出来的单克隆点，用lb gen30的液体培养基37℃，250转每分钟摇菌8小时，将质粒pflp2电转入其中，涂于lb carb300(300微克每毫升羧苄青霉素)的琼脂培养板上。
144.将长出来的点划线于lb 5％sucrose(蔗糖)板上，37℃培养12小时后挑单克隆点溶解于20微升无菌水中，每个点分别点于lb、lb gen30、lb carb300培养板上，选取只在lb琼脂培养板上生长但在gen、carb两种抗性板上均未生长的点做pcr鉴定并送测序，得到将pr'-tr'-b0034-lkd-t0/t1-minitn7质粒插入基因组的菌种pr'-tr'-b0034-lkd-t0/t1-minitn7-pao1。
145.质粒pa1/o4/o3-bphs-ctx2也采用同样的方法电转入pr'-tr'-b0034-lk d-t0/t1-minitn7-pao1中，只需将抗性由gen30更改为tc100(100微克每毫升的四环素)，得到菌种pa1/o4/o3-bphs-ctx2-pr'-tr'-b0034-lkd-t0/t1-minitn7-pao1，此菌种标记为bphs-lkd-pao1。
146.1.2.2工程菌毒性的减弱
147.野生型的pao1菌种毒性较大，为了减少毒性，采用无抗敲除的办法在bphs-lkd-pao1的基础上敲除了三个基因以控制其毒性，分别为vfr(基因组编号为pa0652)、exos(基因组编号为pa3841)、exot(基因组编号为pa0044)，最终得到的减毒菌株命名为exost，相较于野生型pao1菌株，exo st菌株的毒性大大降低。
148.基因敲除采用无缝重组敲除的方法，以vfr基因敲除的载体构建为例，首先需要通过pcr技术从基因组上获得目的片段的上游及下游的1000个碱基的片段，记为vfr-up和vfr-dn；随后通过gibson assembly方法将他们插入到自杀型载体pex18gm的酶切位点ecori和hindiii之间(质粒图谱见图6所示)，构建载体vfr-pex18gm。
149.首先将构建的敲除质粒vfr-pex18gm电转入目的菌种，在含有庆大霉素的平板上筛选出单克隆菌斑；随后在含有15％蔗糖的不含氯化钠的lb平板上划线。37℃培养16小时后，挑选单克隆菌斑pcr鉴定目的基因vfr是否成功敲除。测序验证后，以相同的方法进行第二个基因的敲除直至三个毒力基因全部敲除成功，该菌种记为exost。
150.1.2.3pcdra-rbs-q-t0/t1-j23118-hlye-pucp20质粒的转化
151.抗终止蛋白q的表达量直接影响了裂解基因lkd16的表达量，若背景表达量较高则工程菌可能在未光照时就已经开始裂解，而若背景表达量过低，则工程菌在高光强照射时也无法裂解。
152.启动子与核糖体结合位点(rbs)均可以影响q的背景表达水平，rbs是指基因起始密码子aug上游的一段富含嘌呤的非翻译区。q的背景表达水平如果比较高，即没有光照时，q的表达量也足够开启裂解基因的表达使细菌裂解，细菌只需微弱的光甚至不光照就会裂解。与之相对，q的背景表达水平如果太低，即使光强很强，也无法诱导足够的q表达来使细菌裂解。所以说不同rbs序列导致整个系统对光强的响应行为是不一样的，因此对抗终止基因q前的rbs进行筛选是必要的。
pjn105载质粒通过电转的方法导入pr
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tr
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mscarlet-minitn7-pao1中，并用阿拉伯糖诱导q蛋白的表达，以观察红色荧光蛋白的表达情况，并使用只有pr’启动表达的pr
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mscarlet-minitn7质粒和pr
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tr’启动表达的pr
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mscarlet-minitn7质粒做对照，结果如图11b和图11c所示。
161.图11b中上排图像为显微镜明场图片，下排图像为显微镜荧光图片，pr
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mscarlet列为没有终止子tr’时，pr
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mscarlet-pao1的明场图片和荧光图片，荧光强度很强，证明pr’可以正常驱动红色荧光蛋白的表达，pr
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mscarlet列为加上终止子tr’后，pr
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mscarlet-pao1的明场图片和荧光图片，几乎没有荧光，证明tr’可以阻止红色荧光蛋白的表达，背景表达水平较低。pr
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mscarlet-q-pjn105 0.6％l-ara是pbad-b0034-q-pjn105-pr
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mscarlet-minitn7-pao1菌种在加入0.6％阿拉伯糖诱导之后的图片，有一定强度的荧光产生，证明阿拉伯糖可以诱导红色荧光蛋白的表达，图11c为三种菌种mscarlet荧光强度的定量数据。以上实验结果说明pr
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tr’启动子-终止子转录系统的背景表达水平低，诱导表达水平较高，验证了该系统的可行性。
162.实施例3光控裂解工程菌的小鼠体内实验
163.待用菌种在注菌前一夜由-80℃冰箱划线于lb gen30琼脂板上，第二天早上挑取单克隆点于1ml fab 摇菌至od600值约为0.6，离心后用pbs重悬清洗两次，注意全程避光操作。
164.取100微升待用菌种注射到荷瘤(a549细胞系)balb/c小鼠的瘤内，将小鼠分为高光强照射组(h017-light)和黑暗处理组(h017-dark)，其中高光强照射组小鼠采用10mw/cm2的光强照射，考虑到光穿透动物组织到达肿瘤部位会减弱的问题，因此，动物实验照射的光强高于细菌实验照射的光强。于第1、2、7、8、12、14、15、21天再次注菌，并在第1、2、6、10、14、19、21天测量肿瘤体积、小鼠体重的变化以及肿瘤重量，结果分别如图8a、图8b和图8c所示。说明菌株h017在光照条件下可以释放药物治疗肿瘤，而避光条件下不行。同时小鼠的体重未受到明显影响，表明释放药物不会给小鼠带来显著的生存压力。
165.将工程菌更换为可裂解释放红色荧光蛋白(mscarlet)或者不可裂解的菌株(exost)时，在光照与避光条件下均无法抑制肿瘤生长，如图9a和图9c所示，同时对小鼠体重也无显著影响，如图9b和图9d所示。
166.对上述初次注菌21天后的肿瘤进行组织切片染色分析，分别进行he染色、dapi染色、tunel染色，其中tunel染色的原理是基因组dna断裂时，暴露的3'-oh可以在末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,tdt)的催化下加上荧光素(fitc)标记的dutp(fluorescein-dutp)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，荧光强度越强，细胞凋亡越多。结果如图10所示，发现h017光照组肿瘤组织内部大量细胞凋亡，而避光组几乎没有检测到凋亡的细胞，证实了药物的可控释放程度非常高，本发明实施例的光控裂解工程菌仅在高光强照射下才会释放治疗药物诱导细胞凋亡。
167.以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。