一种RNA适配体分子及其与荧光团小分子复合物和应用

技术特征：
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列为：n1aacgn
6-n
7-n8gagucacuacgagaguaun
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，其中n1、n6、n7、n8和n
27
代表长度≥1个的核苷酸片段，并且n1和n
27
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，n6和n8核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少55％同一性的核苷酸序列；(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1、n6、n7、n8和n
27
的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的ia7结构核苷酸序列具有至少55％，59％，64％，68％，73％，77％，82％，86％，91％，95％或100％同一性的序列。3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的ia7结构核苷酸序列中不包括n1、n6、n7、n8和n
27
的位置，经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括n1、n6、n7、n8和n
27
的位置，经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n
27
互补配对时，n1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n
27
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
；n6与n8互补配对时，n6核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，n8核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当n1与n
27
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n1与n
27
核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当n6与n8中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则n6与n8核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。7.根据权利要求1-6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式ia7结构的核苷酸取代选自下组中的一种：a2u、a2c、a2g、a3u、a3c、a3g、c4a、c4u、c4g、g5a、g5u、g5c、g9a、g9u、g9c、a10u、a10c、a10g、g11a、g11u、g11c、u12a、u12c、u12g、c13a、c13u、c13g、a14u、a14c、a14g、c15a、c15u、c15g、u16a、u16c、u16g、a17u、a17c、a17g、c18a、c18u、c18g、g19a、g19u、g19c、a20u、a20c、a20g、g21a、g21u、g21c、a22u、a22c、a22g、g23a、g23u、g23c、u24a、u24c、u24g、a25u、a25c、a25g、u26a、u26c、u26g、u12a/a14g、u12a/c15u、u12a/c15g、u12a/u16a、u12a/u16c、u12a/a17u、u12a/c18a、u12a/c18u、a14g/c15u、a14g/c15g、a14g/u16a、a14g/u16c、a14g/a17u、a14g/c18a、a14g/c18u、c15u/u16a、c15u/u16c、c15u/a17u、c15u/c18a、c15u/c18u、c15g/u16a、c15g/u16c、c15g/a17u、c15g/c18a、c15g/c18u、u16a/a17u、u16a/c18a、u16a/c18u、u16g/a17u、u16g/c18a、u16g/c18u、a17u/c18a、a17u/c18u、u12a/c15u/u16a、u12a/c15u/u16c、u12a/c15u/a17u、u12a/c15u/c18a、u12a/c15u/c18u、u12a/c15g/u16a、u12a/c15g/u16c、u12a/c15g/a17u、u12a/c15g/c18a、u12a/c15g/c18u、u12a/u16a/a17u、u12a/u16a/c18a、u12a/u16a/c18u、u12a/u16c/a17u、u12a/u16c/c18a、u12a/u16c/c18u、u12a/a17u/c18a、u12a/a17u/c18u、c15u/u16c/a17u、c15u/u16c/c18a、c15u/u16c/c18u、u16c/a17u/c18a、u16c/a17u/c18u、c15g/u16c/a17u、c15g/u16c/c18a、c15g/u16c/c18u、u16a/a17u/c18a、u16a/a17u/c18u、c15g/u16c/a17u、c15g/u16c/c18a、c15g/u16c/c18u、u12a/c15u/u16c/a17u、u12a/c15u/u16c/c18a、u12a/c15u/u16c/c18u、c15u/u16c/a17u/
c18a、c15u/u16c/a17u/c18u、u12a/c15u/u16c/a17u/c18a、u12a/c15u/u16c/a17u/c18u。8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式ia7结构的核苷酸取代选自下组中的一种：a3u、a3c、a3g、c4u、c4g、g5a、g5u、g5c、g9a、g9u、g9c、a10u、a10c、a10g、g11a、g11u、g11c、u12a、u12c、u12g、c13a、c13u、c13g、a14u、a14c、a14g、c15a、c15u、c15g、u16a、u16c、u16g、a17u、a17c、a17g、c18a、c18u、c18g、g19a、g19u、g19c、a20u、a20c、a20g、g21a、g21u、g21c、a22u、a22c、a22g、g23a、g23u、g23c、u24a、u24c、u24g、a25u、a25c、a25g、u26c、u12a/a14g、u12a/c15u、u12a/c15g、u12a/u16a、u12a/u16c、u12a/a17u、u12a/c18a、u12a/c18u、a14g/c15u、a14g/c15g、a14g/u16a、a14g/u16c、a14g/a17u、a14g/c18a、a14g/c18u、c15u/u16a、c15u/u16c、c15u/a17u、c15u/c18a、c15u/c18u、c15g/u16a、c15g/u16c、c15g/a17u、c15g/c18a、c15g/c18u、u16a/a17u、u16a/c18a、u16a/c18u、u16g/a17u、u16g/c18a、u16g/c18u、a17u/c18a、a17u/c18u、u12a/c15u/u16a、u12a/c15u/u16c、u12a/c15u/a17u、u12a/c15u/c18a、u12a/c15u/c18u、u12a/c15g/u16a、u12a/c15g/u16c、u12a/c15g/a17u、u12a/c15g/c18a、u12a/c15g/c18u、u12a/u16a/a17u、u12a/u16a/c18a、u12a/u16a/c18u、u12a/u16c/a17u、u12a/u16c/c18a、u12a/u16c/c18u、u12a/a17u/c18a、u12a/a17u/c18u、c15u/u16c/a17u、c15u/u16c/c18a、c15u/u16c/c18u、u16c/a17u/c18a、u16c/a17u/c18u、c15g/u16c/a17u、c15g/u16c/c18a、c15g/u16c/c18u、u16a/a17u/c18a、u16a/a17u/c18u、c15g/u16c/a17u、c15g/u16c/c18a、c15g/u16c/c18u、u12a/c15u/u16c/a17u、u12a/c15u/u16c/c18a、u12a/c15u/u16c/c18u、c15u/u16c/a17u/c18a、c15u/u16c/a17u/c18u、u12a/c15u/u16c/a17u/c18a、u12a/c15u/u16c/a17u/c18u。9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式ia7结构的核苷酸取代选自下组中的一种：a3u、c4u、c4g、g5a、g5u、g5c、g9u、a10u、a10c、g11u、u12a、u12c、u12g、c13a、c13g、a14u、a14c、a14g、c15a、c15u、c15g、u16a、u16c、u16g、a17u、a17c、a17g、c18a、c18u、c18g、a20u、a20c、a20g、g21a、g21u、g21c、a22u、a22c、a22g、g23a、g23c、u24c、a25u、a25g、u26c、u12a/a14g、u12a/c15u、u12a/c15g、u12a/u16a、u12a/u16c、u12a/a17u、u12a/c18a、u12a/c18u、a14g/c15u、a14g/c15g、a14g/u16a、a14g/u16c、a14g/a17u、a14g/c18a、a14g/c18u、c15u/u16a、c15u/u16c、c15u/a17u、c15u/c18a、c15u/c18u、c15g/u16a、c15g/u16c、c15g/a17u、c15g/c18a、c15g/c18u、u16a/a17u、u16a/c18a、u16a/c18u、u16g/a17u、u16g/c18a、u16g/c18u、a17u/c18a、a17u/c18u、u12a/c15u/u16a、u12a/c15u/u16c、u12a/c15u/a17u、u12a/c15u/c18a、u12a/c15u/c18u、u12a/c15g/u16a、u12a/c15g/u16c、u12a/c15g/a17u、u12a/c15g/c18a、u12a/c15g/c18u、u12a/u16a/a17u、u12a/u16a/c18a、u12a/u16a/c18u、u12a/u16c/a17u、u12a/u16c/c18a、u12a/u16c/c18u、u12a/a17u/c18a、u12a/a17u/c18u、c15u/u16c/a17u、c15u/u16c/c18a、c15u/u16c/c18u、u16c/a17u/c18a、u16c/a17u/c18u、c15g/u16c/a17u、c15g/u16c/c18a、c15g/u16c/c18u、u16a/a17u/c18a、u16a/a17u/c18u、c15g/u16c/a17u、c15g/u16c/c18a、c15g/u16c/c18u、u12a/c15u/u16c/a17u、u12a/c15u/u16c/c18a、u12a/c15u/u16c/c18u、c15u/u16c/a17u/c18a、c15u/u16c/a17u/c18u、u12a/c15u/u16c/a17u/c18a、u12a/c15u/u16c/a17u/c18u。10.根据权利要求1-9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的n1与n
27
处的核苷酸序列为f30或trna脚手架rna序列。11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是rna分子或经碱基修
饰的rna分子。12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是dna-rna杂交分子或经碱基修饰的dna-rna分子。13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5-10倍，至少20-50倍，至少100-200倍，至少200-1000倍或者至少1000-5000倍。14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1-14任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(i)所述的结构：电子供体部分-d为-nx1-x2，x1选自氢、烷基、或改性烷基，x2选自氢、烷基、或改性烷基，x1，x2任选相互连接，与n原子一起形成脂杂环；共轭体系e为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、羟基、氨基、伯氨基、仲氨基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；x1，x2，独立地与共轭结构e连接成脂杂环；电子受体a部分如下式(i-1-a)的环状结构：ra独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基；r
b
独立地选自氢、卤原子、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团；各个y1独立地选自-o-、-s-、-(s＝o)-和-(nr
i
)-，其中r
i
选自氢、氨基、烷基或改性烷基；各个y2独立地选自＝o、＝s、＝s＝o和＝nr
i
，其中r
i
选自氢、烷基或改性烷基；各个y3独立地选自＝o、＝s、＝s＝o和＝nr
i
，其中r
i
选自氢、烷基或改性烷基；或者，各个y3独立地为＝c(r
e
)(cn)；其中r
e
选自氢、酯基、酰胺基、磺酸基、磺酰胺基、磺酸酯基；
其中，所述“烷基”为c
1-c
30
的直链或支链的烷基；优选地，为c
1-c
10
直链或支链烷基；优选地，为c
1-c7直链或支链烷基；优选地，为c
1-c5直链或支链烷基；优选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基；所述“改性烷基”为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-o-、-oh、-co-、-cs-、-no2、-cn、-s-、-so
2-、-(s＝o)-、苯基、亚苯基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环环烃基、联芳杂环、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换；所述“脂环”为饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂环；所述“脂杂环”为环上含有选自n、o、s或si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的4～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有s原子时，其为-s-、-so-或-so
2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；所述“芳基或芳香环”为5～10元单环或稠合双环芳香基团；所述“杂芳基或芳香杂环”为环上含有选自n、o、s或si中的至少一种杂原子的5～10 元单环或稠合双环杂芳香基团；所述“卤原子”各自独立地选自f、cl、br、i；所述“亲水性基团”为羟基、磺酸基、羧基、亚磷酸酯基、伯氨基、仲氨基或叔氨基；所述“桥联脂杂环”为环上含有选自n、o、或s中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环；所述“酯基”为r(c＝o)or’基团；所述“亚磷酸酯基”rp(＝o)(oh)2基团；所述“磺酸基”为rso3h基团；所述“磺酸酯基”为rso3r’基团；所述“磺酸胺基”为rso2nr’r”基团；所述“伯氨基”为rnh2基团；所述“仲氨基”为rnhr’基团；所述“叔氨基”为rnr’r”基团；所述“季铵盐基”r r’r”r
”’
n 基团；各个r、r’、r”、r
”’
各自独立地为单键、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，所述改性烷基或改性亚烷基为c1-c10(优选为c1-c6)烷基或亚烷基的任意碳原子被选自-o-、-oh、-co-、-cs-、-(s＝o)-中一种基团置换所得的基团；可选地，所述改性烷基或改性亚烷基各自独立地为含有选自-oh、-o-、乙二醇单元(-(ch2ch2o)n-)、c1～c8烷基、c1～c8烷氧基、c1～c8酰基氧基、c1～c8卤代烷基、单糖基团、二
糖基团、多糖基团、-o-co-、-nh-co-、-(-nh-chr
””‑
co-)n-、-so
2-o-、-so-、-so
2-nh-、-s-s-、-ch＝ch-、、卤原子、氰基、硝基、邻硝基苯基、苯甲酰甲基、磷酸酯基中至少一种基团的基团，其中，n为1～100，优选为1～50，更优选为1～30，更优选为1～10；r
””
为h或α氨基酸的残基；所述“磷酸酯基”具有如上所述定义；所述“单糖单元”为不能再被简单地水解为更小的糖分子的糖类单元；所述“二糖单元”为两个单糖失水而成的糖类单元；所述“多糖单元”为十个以上单糖失水而成的糖类单元；可选地，所述c1～c8烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基，所述c1～c8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述c1～c8酰基氧基为乙酰氧基、乙基、丙基、异丙基，所述c1～c8卤代烷基为三氟甲基、氯甲基、溴甲基；可选地，所述脂杂环选自氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、硫代吗啉。可选地，所述共轭体系e选自下式(i-2-1)～(i-2-39)中的结构：
可选地，所述共轭体系e与-nx
1-x2形成如下(i-3-1)(i-3-5)所示的脂杂环：或者，所述共轭体系e与-nx
1-x2形成如下(i-3-6)所示的结构：可选地，所述电子受体部分为选自下式(i-4-1)～(i-4-42)中的一种：
。16.可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针式(i)选自下式化合物：
。17.根据权利要求16所述的复合物，其中的荧光团分子选自
ⅰ‑
5-1、
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5-2、
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5-3、
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5-4、
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5-5、
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5-6、
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5-7、
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5-8、
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5-9、
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5-10、
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5-11、
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5-12、
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5-13、
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5-14、
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5-15、
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5-16、
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5-19、
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5-21、
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5-22、
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5-25、
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5-28、
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5-29、
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5-30、
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5-31、
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5-32、
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5-33、
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5-34、
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5-36、
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5-37、
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5-38、
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5-49、
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5-51、
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5-52、
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5-54、
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5-56、
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5-59、
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5-61、
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ⅰ‑
5-69、
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5-84。18.根据权利要求15-17任一项所述的复合物，其中复合物中的适配体分子包含核苷酸序列seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。19.一种权利要求15-18任一项所述的复合物用于体外或体内目标核酸分子的检测或标记。20.一种dna分子，其转录权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子。21.一种表达载体，其包含权利要求20所述的dna分子。22.一种宿主细胞，其包含权利要求21所述的表达系统。23.一种试剂盒，包含权利要求1-14任一项所述的核酸适配体分子和/或权利要求21所述的表达载体和/或权利要求22所述的宿主细胞和/或权利要求15-18任一项所述的复合物。24.一种检测靶标分子的方法，包括步骤：a)在包含靶标分子的溶液中加入权利要求15-18任一项所述的复合物；b)用合适波长的光激发复合物；c)检测复合物的荧光。25.一种提取与纯化rna的方法，包含利用权利要求15-18任一项所述复合物提取与纯化rna。

技术总结
本发明涉及一种适配体核酸分子，包含该适配体和荧光团小分子的复合物，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。强度。


技术研发人员：杨弋 左方婷 陈显军
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2021.08.06
技术公布日：2023/2/17