一种碱性木聚糖酶突变体的制作方法

1.本发明涉及基因工程与蛋白质工程技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体。


背景技术：

2.造纸行业一直是污染严重的行业，近年来随着我国对环保越来越重视及污染治理力度的加强，对制浆造纸工艺的要求也越来越高，无论是在生产工艺的改进还是造纸助剂的添加方面均向着绿色环保的方向发展。生物酶在制浆造纸工业中的应用越来越广泛，在工艺流程的各个阶段，如蒸煮、漂白、打浆、废纸脱墨、胶粘物控制等方面均有应用。生物酶在制浆漂白中应用的研究是近几年生物酶在造纸中应用的一个热点，在漂白过程中加入生物酶，能够减少化学漂剂的用量，提高纸浆漂后白度，减少漂白废液中离子垃圾含量，提高白水循环利用率。常用于纸浆漂白中的酶制剂有木聚糖酶和漆酶。
3.广义上的木聚糖酶是指一类能够降解大量存在于自然界尤其是植物纤维中的半纤维素木聚糖的复合酶系，包括β-1, 4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶等。而狭义的木聚糖酶主要是指β-1,4-内切木聚糖酶。β-1,4-内切木聚糖酶主要是作用于木聚糖分子中的β-1,4-糖苷键，通过切断β-1,4-糖苷键从而使木聚糖降解为小分子的低聚木糖诶寡糖及木二糖等，以及一些量很少的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶及 α-l-阿拉伯糖苷酶等主要是使低聚木糖进一步降解为单糖，从而使木聚糖彻底降解为单糖。
4.木聚糖酶的来源较为广泛，自然界中的动、植物以及微生物都能产生木聚糖酶。其中微生物是木聚糖酶最广泛的来源，目前对木聚糖酶的筛选研究也大多是从微生物入手，主要是一些细菌和真菌。研究表明：细菌分泌的木聚糖酶既有酸性的也有碱性的，而真菌分泌的木聚糖酶则只有碱性木聚糖酶。因此可以根据对木聚糖酶的实际应用要求对其菌种进行筛选。目前木聚糖酶的生产主要是通过对细菌及真菌等进行发酵来实现。
5.目前木聚糖酶已被广泛应用在制浆造纸工业中，其中应用最多的是作为漂白助剂应用在制浆造纸工艺的漂白工段。许多研究发现，木聚糖酶预处理可以提高纸浆漂白性能，提高漂后纸浆的成纸白度。garg等使用来源于bacillus stearothermophilus sdx 的木聚糖酶在 60℃、时间 120 min 的条件下处理浆料，发现酶处理后的纸浆白度提高了 4.75 %。另外，国内外许多浆厂应用之后发现，木聚糖酶加入在漂白工段前，在达到要求白度下可降低化学浆漂白成本，漂白负荷可降低约5%~20%。
6.然而，由于在实际生产过程中纸浆漂白的环境多为高温偏碱环境，一般的木聚糖酶在其中难以存活，很难起到作用效果，因此，需要研发具有耐温耐碱的木聚糖酶。本发明通过蛋白质工程这一手段，制备出具有耐温耐碱特性的木聚糖酶，可广泛应用于造纸行业中。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种新型碱性木聚糖酶突变体。所述突变体的耐热性得到显
著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：24，38，40，41，56，57，59，61，75，80，103，107，114，129，132，135，143，144，149，151，154，157，160，165，166，167，177，192。
9.在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
10.在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
11.在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：q24p，s38v/k/w/h/t/i，g40m/r/k/f/h，d41p，n56l/i/p/k，a57e/d/y，a59k/r/i/m/h，h61f/y，a75s，t80m，t103i，t107e，t114y，d129l，q132r/m，d135m，n143d，k144r，t149l，q151n/y，c154n，d157e，a160e，n165d，v166i，n167s/w，t177v，d192e。
12.本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的dna分子。
13.本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达载体。
14.本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
15.将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的耐热性和耐碱性得到显著提升。
16.在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。
17.在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（trichoderma reesei）。
18.本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
19.本发明以野生型木聚糖酶h1为基础，提供了包含q24p，s38v/k/w/h/t/i，g40m/r/k/f/h，d41p，n56l/i/p/k，a57e/d/y，a59k/r/i/m/h，h61f/y，a75s，t80m，t103i，t107e，t114y，d129l，q132r/m，d135m，n143d，k144r，t149l，q151n/y，c154n，d157e，a160e，n165d，v166i，n167s/w，t177v，d192e中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶h1相比，本发明提供的单点突变体在75℃条件下的相对酶活普遍提高了12.2%-71.4%。其中，含s38t、s38w、d41p、t177v单点的突变体在75℃条件下的相对酶活均超过80%，远高于野生型木聚糖酶h1，取得了意料不到的技术效果。
20.在ph9.0-11.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶h1及其单点突变体的酶活残留率普遍高于91%，几乎没有酶活损失；在ph12.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶h1的酶活残留率仅为45.06%，而木聚糖酶单点突变体的酶活残留率高达61.51-93.29%，尤其是含s38t、s38w、d41p、t177v单点的突变体酶活残留率分别高达90.6%、92.33%、93.11%和93.29%。从而说明，本发明提供的单点突变体对碱性环境的耐受性得到显著提高，取得了意料不到的技术效果。
21.综上，本发明提供的木聚糖酶突变体对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，从而有利于木聚糖酶在造纸领域中的广泛应用。
22.具体实施方式
23.本发明公开了一种木聚糖酶突变体、其制备方法及应用、编码该木聚糖酶突变体的dna分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
24.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning：a laboratory manual，3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌dh5α、毕赤酵母gs115、载体ppic9k、amp、g418均购自invitrogen公司。
25.酶与试剂盒：pcr酶及连接酶购买自takara公司，限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
26.培养基配方：大肠杆菌培养基（lb培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；酵母培养基（ypd培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；酵母筛选培养基（md培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5 %生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5 %生物素，0.5%甲醇；lb-amp培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，100μg/ml氨苄青霉素，ph7.0；lb-amp平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，1.5%琼脂，100μg/ml氨苄青霉素，ph7.0；上层培养基：0.1%mgso4，1%kh2po4，0.6%(nh4)2so4，1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%琼脂糖；下层培养基平板：2%葡萄糖，0.5%(nh4)2so4，1.5%kh2po4，0.06%mgso4，0.06�cl2，1.5%琼脂。
27.下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1 重组质粒的构建将来源于拟青霉（paecilomyces. sp）的木聚糖酶基因（genebank acs26244. 1）根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化，并在其起始密码子atg前增加6个碱基gaattc（ecor i酶切位点），在其终止密码子taa后增加gcggccgc（not i酶切位点）。优化后的核苷酸序列
由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该木聚糖酶命名h1，其氨基酸序列为seq id no：1，编码核苷酸序列为seq id no：2。
28.用限制性内切酶ecor i和not i（fermentas）对木聚糖酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶ecor i和not i对质粒ppic9k进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用t4 dna连接酶（fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进dh5α大肠杆菌（invitrogen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序。
29.使用质粒小量制备试剂盒（omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为ppic9k-h1。
30.实施例2 耐高温和耐碱突变体的筛选为了进一步提高木聚糖酶h1对高温和碱性条件的耐受性，申请人对其进行蛋白结构分析。该蛋白是gh11家族木聚糖酶，其结构为β-果冻卷的结构，蛋白质表面和蛋白质的活性中心都是暴露在外界环境中，所以认为外界环境的改变特别是高温或强的酸碱环境既可以直接影响到酶的表面结构的稳定性也可以直接影响酶的活性中心的稳定性，所以要提高酶在环境中的耐受性，就要提高蛋白整体的刚性，稳定酶的整体结构。在不破坏蛋白二级结构与活性中心的前提下，进一步对该基因进行突变。
31.1.1设计pcr引物h1-f1、h1-r1：h1-f1：ggcgaattcatgatgattggtatcacttcttttgc（下划线为限制性内切酶ecori识别位点）；h1-r1：atagcggccgc ttaaccgacgtctgcaacggtaattc（下划线为限制性内切酶noti识别位点）。
32.以h1基因（seq id no：1）为模板，利用上述引物用genemorph ii随机突变pcr试剂盒（博迈斯）进行pcr扩增，胶回收pcr产物，ecori、noti进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21（de3）中，涂布于lb amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mm iptg的lb amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
33.分别取出三份裂解液做如下处理：第一份和第二份裂解液用ph8.0的缓冲液稀释，第三份裂解液用预热的ph10.0的0.05m硼砂-0.2m氢氧化钠的缓冲液37℃处理2h后用缓冲液稀释；取上述处理好的裂解液各30 ul，分别置于三块新的96孔板，三块96孔板中都加入30 ul用相应缓冲液配置的底物；将第一份和第三份处理后的裂解液于50℃反应30 min，第二份处理后的裂解液于75℃反应30 min后，利用dns法测定生成的还原糖。分别计算不同突变子的酶活水平。
34.实验结果显示，不同的突变子保持的活性不同。有些突变在高温反应条件和强碱处理条件下还具有较高的酶活，有些突变甚至使其耐受性变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高木聚糖酶的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人筛选获得既能显著提高木聚糖酶耐受性，又不会显著影响其酶活及原有酶学性质的突变位点：q24p，s38v，s38k，s38w，s38h，s38t，s38i，g40m，g40r，g40k，g40f，g40h，d41p，n56l，n56i，n56p，n56k，a57e，a57d，a57y，a59k，a59r，a59i，a59m，a59h，h61f，h61y，a75s，t80m，t103i，t107e，t114y，d129l，q132r，q132m，d135m，n143d，k144r，t149l，q151n，
q151y，c154n，d157e，a160e，n165d，v166i，n167s，n167w，t177v，d192e。
35.在野生型木聚糖酶h1的基础上，本发明提供了分别含上述单个突变位点的突变体。
36.参照突变体的氨基酸序列，分别得到所述木聚糖酶突变体的编码核苷酸序列。
37.实施例3 木聚糖酶在毕赤酵母中的表达3.1表达载体的构建依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对木聚糖酶h1及其突变体的基因序列进行优化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上ecori和noti两个酶切位点。
38.按照实施例1中所述方法，将合成的木聚糖酶h1及其突变体的基因序列分别进行ecori和noti双酶切，然后与经同样酶切后的ppic-9k载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌dh5a，涂布于lb amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落pcr（反应体系：模板挑取的单克隆，rtaqdna聚合酶 0.5ul，10
×
buffer 2.0μl，dntps(2.5mm) 2.0μl，5’aox引物（10mm）：0.5μl，3’aox引物：0.5μl，ddh2o 14.5μl，反应程序：95℃预变性5min，30个循环： 94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min）。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
39.3.2毕赤酵母工程菌株的构建3.2.1酵母感受态制备将毕赤酵母gs115菌株进行ypd平板活化，30℃培养48 h后接种活化的gs115单克隆于6 ml ypd液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30ml ypd液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其od600值在1.1
–
1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4ml菌体至灭菌ep管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 ml灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1ml灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1ml山梨醇(1 mol/l)重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1 mol/l)轻柔重悬菌体。
40.3.2.2转化和筛选分别将3.1构建得到的重组表达质粒用sac i进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母gs115，在md平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的ypd平板（0.5mg/ml-8mg/ml）上筛选多拷贝的转化子。
41.将获得的转化子分别转接于bmgy培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入bmmy培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含木聚糖酶h1和木聚糖酶突变体的发酵上清液。
42.（1）木聚糖酶酶活单位的定义在温度为50℃、ph为8.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活性单位，以u表示。
43.（2）木聚糖酶酶活测定方法吸取10.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡20 min。
44.吸取10.0 ml经过适当稀释的酶液，50℃平衡5 min。
45.空白样品测定：吸取2.00 ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5ml dns试剂，电磁振荡3 s。然后加入2.0 ml木聚糖溶液，50℃平衡30 min，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至25 ml，电磁振荡3 s～5s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度ab。
46.样品测定：吸取2.00 ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0 ml木聚糖溶液（已经过50℃平衡），电磁振荡3 s，50℃精确保温30 min。加入5.0 ml dns试剂，电磁振荡3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至25 ml，电磁振荡3 s。以标准空白样为空白对照，在540 nm处测定吸光度ae。
47.xd=。
48.式中：xd—试样稀释液中木聚糖酶的活力，u/ml；ae—酶反应液的吸光度；ab—酶空白样的吸光度；k—标准曲线的斜率；co—标准曲线的截距；m—木糖的摩尔质量m（c5xyn110o5）= 150.2 g/mol；t—酶解反应时间，min；1000—转化因子，1 mmol = 1000 μmol；xd值应在0.04—0.10 u/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
49.x = xd·df
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
（2）x—试样中木聚糖酶的活力，u/ml；df—试样的稀释倍数。
50.（3）测定结果按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶h1及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为310-550 u/ml。
51.实施例4 木聚糖酶在里氏木霉中的表达首先依照木霉的密码子偏爱性，分别对木聚糖酶h1以及其突变体的基因序列进行优化。优化后的基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上kpni和mlui两个酶切位点。
52.4.1表达载体的构建将合成后的木聚糖酶基因片段与psc1g载体分别用限制性内切酶kpni和mlui（fermentas）进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用t4 dna连接酶（fermentas）分别将上述木聚糖酶基因与psc1g载体的酶切产物连接并转化大肠杆菌trans5α (transgen)，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序(invitrogen)验证。测序正确后，即得到含有木聚糖酶基因的重组质粒。
53.4.2 里氏木霉重组菌株的构建（1）原生质体制备
取宿主菌里氏木霉（trichoderma reesei）ue孢子悬液，接种于pda平板上，30℃培养6 天；待其产孢丰富后，切取约1cm
×
1cm的菌落置于含120 ml yeg u（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 ml 10mg/ml裂解酶液（sigma l1412）的三角瓶中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；将预冷的20 ml 1.2 m山梨醇（1.2 m山梨醇，50 mm tris-cl，50 mm cacl2）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入预冷的5 ml 1.2 m山梨醇溶液悬浮菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的1.2 m山梨醇悬浮分装（200 μl/管，原生质体浓度为108个/ml）。
54.（2）表达载体转化以下操作均在冰上进行，分别取10 μg上述构建的到的重组质粒加入到含有200 μl原生质体溶液的7 ml无菌离心管中，然后加入50 μl 25% peg（25% peg，50 mm tris-cl，50 mm cacl2），轻弹管底混匀，冰上放置20 min；加入2 ml 25% peg，混匀后室温放置5 min；加入4 ml 1.2 m山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上，30℃培养5~7 d至有转化子长出，将生长出的转化子挑至下层培养基平板进行复筛，菌落边缘形态较光滑的菌株为阳性转化子。
55.按照上述方法，申请人分别构建得到重组表达木聚糖酶h1及其突变体的里氏木霉工程菌株。
56.（3）发酵验证和酶活测定将上述构建得到的里氏木霉工程菌株分别接种至pda固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50ml发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(nh4)2so4，0.09%mgso4，2%kh2po4，0.04�cl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250ml三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时。将发酵液离心，即得到分别含木聚糖酶h1及其突变体的发酵上清液。
57.按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达木聚糖酶h1及其突变体的里氏木霉重组菌株发酵上清液的酶活为300-500 u/ml。
58.实施例5木聚糖酶突变体的耐热性分析将上述重组菌株发酵上清液用0.1m磷酸氢二钠-0.05m柠檬酸缓冲液稀释10倍后，分别在50℃和75℃两个温度条件下测定稀释后的木聚糖酶酶活。以50℃时的发酵上清液酶活计100%，计算75℃条件下的相对酶活。具体结果见表1。
59.相对酶活（%）=75℃条件下的样品酶活/50℃条件下的样品酶活
×
100%。
60.表1 木聚糖酶h1及其突变体在75℃条件下的相对酶活水平木聚糖酶及其单点突变体75℃/50℃相对酶活（%）野生型h149%q24p56%s38t84%n56i68%g40m56%
g40r58%g40k55%g40f59%g40h60%s38v69%s38k68%s38w82%s38h68%s38t62%s38i69�1p84%n56l59%n56i68%n56p59%n56k60�7e61�7d59�7y68�9k64�9r62�9i72�9m71�9h59%h61f56%h61y67�5s67%t80m65%t103i57%t107e67%t114y58%q132m59%q132r55�35m72%n143d64%k144r60%t149l55%q151n62%q151y69�54n56%
d157e56�60e68%n165d64%n167s58%n167w58%t177v81%从表1的数据可以看出，与野生型木聚糖酶h1相比，本发明提供的单点突变体在75℃条件下的相对酶活普遍提高了12.2%-71.4%。其中，含s38t、s38w、d41p、t177v单点的突变体在75℃条件下的相对酶活均超过80%，远高于野生型木聚糖酶h1。从而说明，本发明提供的单点突变体的耐热性得到显著提高，取得了意料不到的技术效果。
61.实施例6 木聚糖酶突变体对碱性环境的耐受性分析用去离子水将上述重组菌株发酵上清液稀释至50u/ml；取1ml上清液分别加入到已预热10min的9ml相应ph（ph9.0，10.0，11.0，12.0）缓冲液中，37℃处理2h；反应结束迅速加入5ml补充液，摇匀；然后用缓冲液稀释，测定残留酶活。以未处理发酵上清液酶活为100%，计算酶活残留率。
62.酶活残留率（%）=处理后样品的酶活/未处理样品的酶活
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100%。
63.结果显示：在ph9.0-11.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶h1及其单点突变体的酶活残留率普遍高于91%，几乎没有酶活损失；在ph12.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶h1的酶活残留率仅为45.06%，而木聚糖酶单点突变体的酶活残留率高达61.51-93.29%，尤其是含s38t、s38w、d41p、t177v单点的突变体酶活残留率分别高达90.6%、92.33%、93.11%和93.29%。从而说明，本发明提供的单点突变体对碱性环境的耐受性得到显著提高，取得了意料不到的技术效果。
64.综上所述，本发明筛选获得的突变位点q24p，s38v，s38k，s38w，s38h，s38t，s38i，g40m，g40r，g40k，g40f，g40h，d41p，n56l，n56i，n56p，n56k，a57e，a57d，a57y，a59k，a59r，a59i，a59m，a59h，h61f，h61y，a75s，t80m，t103i，t107e，t114y，d129l，q132r，q132m，d135m，n143d，k144r，t149l，q151n，q151y，c154n，d157e，a160e，n165d，v166i，n167s，n167w，t177v，d192e均能显著提高木聚糖酶h1在高温和碱性环境中的耐受性，从而有利于其在造纸行业中的广泛应用。