异二聚体蛋白质的制作方法

异二聚体蛋白质1.引言2.基于抗体的疗法已成为肿瘤学、炎症和传染病等领域越来越多的人类恶性疾病治疗的重要组成部分。事实上，抗体是当今最畅销的药物类别之一。前十名最畅销药物中有五个是抗体。抗体疗法也越来越多地用于兽医学，用于治疗家畜，例如狗。3.兽医学对这些疗法有着巨大的需求，因为仅在美国，每年就有600万例狗患癌症，在猫中也有类似的数量(cekanovaandrathoreanimalmodelsandtherapeuticmoleculartargetsofcancer:utilityandlimitations.drugdesdevelther,8:1911-2,2014)“animalmodelsandtherapeuticmoleculartargetsofcancer:utilityandlimitations”drugdesign,developmentandtherapy8:1911-1922)。此外，四分之一的美国狗被诊断出患有某种形式的关节炎(bland“canineosteoarthritisandtreatments:areview”veterinarysciencedevelopment5(2)),2015)。因此，有可能将抗体疗法应用于许多慢性兽医疾病。单克隆抗体还有利于检测、预防和控制寄生虫、细菌和病毒性疾病。4.第一个用于人类治疗的单克隆抗体在25年前获得上市许可，此后已有80种获得批准，还有50多种处于后期临床开发阶段。相比之下，抗体在兽医学中的应用还处于早期阶段，只有少数抗体正在开发中。有限的进展反映了这样一个事实，即开发物种特异的治疗性抗体在技术上具有挑战性，而且只是一项相对较新的努力。因此需要开发改进的兽医学抗体，以及制备兽医学抗体的方法。5.抗体结构已被用来改造各种不同的抗体形式(format)来靶向人类疾病。这种工程化的抗体形式的一个示例是双特异性抗体。双特异性抗体结合两个不同的靶标，因此能够同时结合两个不同的表位。一个感兴趣的领域是用于有效肿瘤杀伤的t细胞定向双特异性抗体。双特异性抗体可以具有“双靶标”功能并结合两种不同的表面受体或配体，从而影响多种疾病途径。双特异性抗体还可以将两个靶标放置在非常接近的位置，以支持在一个细胞上形成蛋白质复合物或触发细胞之间的接触。双特异性抗体的形式在很多方面都有所不同，包括它们的分子量、抗原结合位点的数量、不同结合位点之间的空间关系、每种抗原的效价、支持二次免疫功能的能力和药代动力学半衰期。这些不同的形式提供了很好的机会来定制双特异性抗体的设计，以匹配提议的作用机制和预期的临床应用(kontermann和brinkmannbispecificantibodiesdrugdiscoverytoday第20卷，第7期，2015年)。6.通过在单个宿主细胞中共表达两条轻链和两条重链来生产igg类型的双特异性抗体可能非常具有挑战性，因为所需的双特异性igg的低产量，并且难以去除密切相关的错配igg污染物。这反映出重链形成同二聚体以及所需的异二聚体——即所谓的重链配对问题。此外，轻链可能与非同源重链错配——即所谓的轻链配对问题。因此，除了所需的双特异性抗体外，两种抗体的共表达还可产生多达九种不需要的igg种类。7.本领域描述了多种方法以促进异二聚化，即用于人类治疗的某种感兴趣的双特异性抗体的形成，从而减少所得混合物中不需要的同二聚体的含量。这些方法已在有关靶向人类疾病设计的人类或人源化抗体中进行了研究。8.igg中两条重链的同二聚化仅由ch3结构域之间的非共价相互作用介导。因此，ch3-ch3相互作用是fc二聚化的主要驱动力。9.此外，众所周知，当两个ch3结构域相互作用时，它们会在包含“接触”残基(也称为接触氨基酸、界面残基或界面氨基酸)的蛋白质-蛋白质界面中相遇。第一ch3结构域的接触氨基酸与第二ch3结构域的一个或多个接触氨基酸相互作用。接触氨基酸在抗体的三维结构中通常彼此在以内(优选在以内)。来自一个ch3结构域的接触残基与来自不同ch3结构域的接触残基之间的相互作用可以例如通过范德华力、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳族侧链之间的吸引相互作用、二硫键，或本领域技术人员已知的其他力。因此，主要驱动力是核心中的疏水相互作用和静电相互作用。10.本领域已采用干扰抗体重链二聚化的方法来偏向异二聚抗体的产生。应用ch3结构域中的特异性工程化以有利于异二聚化而不是同二聚化。ch3-ch3界面的此类工程化的示例包括引入互补突起(protuberance)和空腔突变，也称为“杵-臼”方法，例如在wo9627011和j.b.ridgway等人'knobs-into-holes'engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerisationproteineng.,9(1996),pp.617-621中所描述的。11.通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起和在第二多肽的界面中引入相应的空腔，使得突起可以定位在空腔中以便促进异多聚体形成并阻碍同多聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建“突起”或“杵”。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二个多肽的界面中产生与突起大小相同或相似的补偿“空腔”或“臼”。可以通过合成方法例如改变编码多肽的核酸或通过肽合成来制备突起和空腔。从不利于ch3同二聚化的“杵”突变(t366w)(ridgway等人，同上)开始，通过噬菌体展示鉴定补偿的“臼”突变(t366s、l368a和y407v)(atwell等人stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibraryj.mol.biol.,270,pp.26-35,1997)，提供与“杵”的有效配对，同时不利于同二聚化。12.重链异二聚化的其他几种成功策略，包括静电转向突变(wo2006/106905和gunasekaran等人enhancingantibodyfcheterodimerformationthroughelectrostaticsteeringeffects:applicationstobispecificmoleculesandmonovalentiggj.biol.chem.,285,pp.19637-19646,2010)。该方法基于天然带电荷的ch3-ch3界面内接触残基的静电工程化。在重链的ch3结构域中引入突变，其中天然存在的带电荷氨基酸接触残基被带相反电荷的氨基酸残基替换(即电荷反转策略)。这在fc二聚体界面上产生了改变的电荷极性，使得静电匹配的fc链的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进所需的fc异二聚体形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不需要的fc同二聚体形成。13.据描述，在人ch3-ch3界面内，结构域-结构域相互作用涉及四个独特的电荷残基对。它们是d356/k439'、e357/k370'、k392/d399'和d399/k409'(根据kabat编号，1991)，其中第一条链中的残基与第二条链中的残基通过“/”分隔，并且其中上标符号(')表示第二条链中的残基编号)。由于ch3-ch3界面显示2倍对称性，每个独特的电荷对在完整igg中代表两次(即，界面中还存在k439/d356'、k370/e357'、d399/k392'和k409/d399'电荷相互作用)。利用这种2倍对称性，证明单个电荷反转，例如第一条链中的k409d或第二条链中的d399'k，由于相同电荷的排斥而导致同型二聚体形成减少。结合不同的电荷反转进一步增强了这种排斥作用。已证明包含不同互补电荷反转的不同ch3结构域的表达可以驱动异二聚化，导致混合物中双特异性种类的比例增加(综述参见kontermann和brinkmann，同上；brinkmann和kontermann：themakingofbispecificantibodies，mabs，第9卷，第2期，2017年，第182-212页，ha等人，frontiersinimmunologyimmunoglobulinfcheterodimerplatformtechnology:fromdesigntoapplicationsintherapeuticantibodiesandproteins，第7卷，文章394，2016年)。14.需要开发改进的兽医抗体，以及制造兽医抗体的方法。本发明旨在解决这一需求，特别是通过提供改进用于兽医学的异二聚体抗体的生产的方法以及提供相关产品和用途。15.发明概述16.本发明基于以下发现，即突变犬ch3结构域中的某些残基会促进异二聚体的形成，以产生兽医用的双特异性抗体。17.发明人还令人惊讶地鉴定了犬iggch3结构域中的保守犬电荷对，其在所有犬igg同种型中高度保守并且在所有人igg中的相应位置不带电荷。发明人已经表明修饰该电荷对可以促进异二聚化。18.发明人已经用电荷对的突变修饰了fc区的犬iggch3结构域界面，使得工程化的含有ch3的蛋白质优先形成异二聚体。这最小化了用于生产双特异性抗体的同二聚体污染物的形成。不希望受理论的束缚，发明人认为突变在fc二聚体界面上产生了改变的电荷极性，使得静电匹配的fc链的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进所需的fc异二聚体形成，而不利的排斥电荷相互作用抑制不需要的fc同二聚体形成。19.通常，在本发明的各种实施方案中，第一犬iggch3结构域和第二犬iggch3结构域均以互补方式进行改造，使得每个ch3结构域(或包含它的多肽)基本上不与其自身同二聚化或以较低的比率同二聚化，但被迫与互补工程化的其他ch3结构域异二聚化。换言之，在两个第一或两个第二ch3结构域之间形成第一和第二ch3结构域异二聚体和少数同二聚体。20.因此，本发明的方法涉及置换第一多肽的犬iggch3结构域中的至少一个氨基酸，和/或置换第二多肽的犬iggch3结构域中的至少一个氨基酸，其中所述第一多肽的ch3结构域的氨基酸在异二聚体蛋白质(例如抗体)的三级结构内面向第二重链的ch3结构域的至少一个氨基酸，其中第一和第二重链的ch3结构域内的相应氨基酸分别被置换，使得具有相反侧链电荷的氨基酸被引入到相反的多肽中。本发明还涉及通过此类方法获得或可获得的多肽。21.本发明还涉及修饰的ch3结构域和包含修饰的ch3结构域的异二聚体蛋白质或多肽，例如分离的ch3结构域、分离的多肽或包含修饰的ch3结构域的异二聚体蛋白质。异二聚体蛋白包含第一多肽中的ch3结构域和第二多肽中的ch3结构域，其特征在于第一多肽的第一ch3结构域和第二多肽的第二ch3结构域各自在一个界面相遇，所述界面包含ch3结构域之间的原始界面，其中所述界面被改变以促进异二聚蛋白质的形成。22.狗有几种同种型，igg-a、igg-b、igg-c和igg-d。本发明的方面涉及所有同种型。专门针对igg-d和igg-b列出了各种实施方案。然而，这些实施方案还延伸至覆盖其他同种型的那些，其中相应位置处的残基(对应于如针对igg-d和/或igg-b所描述的位置)被置换。图6显示了狗同种型中不同同种型的比对。技术人员将能够通过比对序列来鉴定不同犬igg同种型中的相应位置和残基。23.因此，在第一方面，本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其包含24.a)第一多肽，其包含第一犬iggch3结构域和25.b)第二多肽，其包含第二犬iggch3结构域26.其中所述第一和第二犬iggch3结构域包含一个或多个电荷对置换。27.所述一个或多个电荷对置换促进异二聚化。28.在第二方面，本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其包含29.a)第一多肽，其包含第一犬iggch3结构域和30.b)第二多肽，其包含第二犬iggch3结构域31.其中只有一个犬iggch3结构域包含一个或多个电荷对置换，而另一个不包含。例如，第一个犬iggch3结构域具有置换，但第二个没有。在另一个示例中，第二个犬iggch3结构域具有置换，但第一个没有。32.在第三方面，本发明涉及异二聚体蛋白质，其包含包含第一犬iggch3结构域的第一多肽和包含第二犬iggch3结构域的第二多肽，其中33.a)所述第一犬iggch3结构域包含在位置424、423、377、378、382的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置414、416、433、392、377、393的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或在425处用n进行的氨基酸置换；34.b)其中第一犬iggch3结构域包含在383、393和/或382处的氨基酸置换并且第二犬iggch3结构域不包含相应的突变或35.c)其中第二犬iggch3结构域包含在463或425处的氨基酸置换并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。36.igg可以是igg-a、b、c或d。以上编号是指igg-d，但另一种同种型中的相应位置可以被置换。37.所述一个或多个氨基酸置换促进异二聚化。38.因此，a)所述第一犬iggch3结构域包含在位置e424、d423、d/k377、e378的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414、h/r416、k433、k392的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时当残基是k；39.b)其中第一犬iggch3结构域包含在d383、d393和/或s382处的氨基酸置换并且第二犬iggch3结构域不包含相应的突变或40.c)或其中第二犬iggch3结构域包含在l463或425处的氨基酸置换并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。41.igg可以是igg-a、b、c或d。以上编号是指igg-d，但另一种同种型中的相应位置可以被置换。42.在进一步的方面，本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其包含43.包含第一犬iggch3结构域的第一多肽和包含第二犬iggch3结构域的第二多肽，其中44.a)所述第一犬iggch3结构域包含在位置428、427、382、383的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置420、418、437、467、396的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换或；45.b)所述第二犬iggch3结构域包含在429处的氨基酸置换并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。46.例如，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428、d427、e382、e383、k386的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420、k418、k437、k467、k396、d397、d429的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。47.igg可以是igg-a、b、c或d。以上编号是指igg-b，但另一种同种型中的相应位置可以被置换。48.在另一方面，本发明涉及一种多肽，其包含犬iggch3结构域，其中所述多肽包含在上述一个或多个位置(例如，对于igg-b或igg-d)处用相反电荷的氨基酸氨基酸进行的氨基酸置换。在另一方面，本发明涉及编码本文所述异二聚体蛋白质或多肽的核酸。49.在另一方面，本发明涉及包含所述核酸的载体或包含所述载体的宿主细胞。50.在进一步的方面，本发明涉及一种用于制备在犬iggch3结构域中具有氨基酸置换的异二聚体蛋白质或多肽的方法，其包括以下步骤：51.a)用本文所述的核酸或载体转化宿主细胞；52.b)培养宿主细胞并表达第一和第二iggch3和53.c)从宿主细胞培养物中回收异二聚体蛋白质或多肽。54.另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本文所述的异二聚体蛋白质或多肽和药物载体。55.另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含本文所述的异二聚体蛋白质或多肽以及任选的使用说明。附图说明56.下面提到的附图说明中所有突变id都参考了表2所示的igg-b。术语组合/组合id也指表中所示的突变id。57.图1在犬和人igg同种型中保守的kih位置。58.图2人与狗之间保守的形成ch3电荷对相互作用的残基。59.图3犬电荷对突变增强异二聚体形成。60.图4人igg4pekih的异二聚化方法评价。61.图5狗igg-a、-b、-c、-d序列(分别为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4)。62.图6狗igg-a、-b、-c、-d序列(seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4)的比对。突出显示的残基是本文描述的那些。63.图7通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:1)，1/3。组合/突变id2至5和10至12被表达并形成异二聚体。突变id6至9不表达。对应于异二聚体mw的区域由虚线矩形突出显示。泳道如下：1：分子量阶梯(mw)，2：组合1，3：组合2；4：组合3；5：组合4，6：组合5，7：组合6，8：组合7，9：组合8，10：组合9，11：组合10，12：组合11，13：组合12，14：mw。64.图8通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:1)，2/3。突变id13、14和16至24被表达并形成异二聚体。突变id15不表达。对应于异二聚体mw的区域由虚线矩形突出显示。泳道如下：1：mw，2：组合13，3：组合14，4：组合15；5：组合16，6：组合17，7：组合18，8：组合19，9：组合20，10：组合21，11：组合22，12：组合23，13：组合24。65.图9通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:1)，3/3。突变id25、26和28至29被表达并形成异二聚体。突变id27不表达。泳道如下：1：组合25，2：组合26，3：组合27，4：组合28，5：组合29，6：样品蛋白质，7：mw。66.图10通过sds-page进行的异二聚体评价的光密度分析(比例1:1)。对应于异二聚体的值显示为占总蛋白质的百分比。突变id1(wt)显示为比较。该图显示突变id3、4、10、11、12、17、19、20、21、23和29导致异二聚体比例增加。67.图11通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:3)，1/2。除了突变id17之外，所有选定的突变都得到表达并形成异二聚体。对应于异二聚体mw的区域由虚线矩形突出显示。泳道如下：1：mw，2：组合1，3：组合4，4：组合11；5：组合12，6：组合13，7：组合16，8：组合17，9：组合22，10：组合23，11：组合24，12：组合25，13：组合26,14：仅fc-wt，15：仅scfv-wt。68.图12通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:3)，2/2。所有选定的突变都得到表达并形成异二聚体。对应于异二聚体mw的凝胶的区域由虚线矩形突出显示。泳道如下：1：mw，2：组合1，3：组合28，4：组合29。69.图13通过sds-page进行的异二聚体评价的光密度分析(比例1:3)。对应于异二聚体的值显示为占总蛋白质的百分比。突变id1(wt)显示为比较。该图显示，对于所有组合，除了突变id17之外，观察到异二聚体比例的增加。70.图14通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:6)，1/2。所有选定的突变都得到表达并形成异二聚体。对应于异二聚体mw的区域由虚线矩形突出显示。泳道如下：1：mw，2：组合1，3：组合4，4：组合11；5：组合12，6：组合13，7：组合16，8：组合17，9：组合22，10：组合23，11：仅fc-wt，12：仅scfv-wt。71.图15通过sds-page进行的异二聚体评价(比例1:6)，2/2。所有选定的突变都得到表达并形成异二聚体。对应于异二聚体mw的区域由虚线矩形突出显示。泳道如下：1：组合1，2：mw，3：组合24，4：组合25，5：组合26，6：组合28，7：组合29。72.图16通过sds-page进行的异二聚体评价的光密度分析(比例1:6)。对应于异二聚体的值显示为占总蛋白质的百分比。突变id1(wt)显示为比较。该图显示除了id17和24之外，所有组合都增加了异二聚体的比例。73.图17a显示了同二聚体(用虚线突出显示)和异二聚体的hplcsec保留时间。在所有突变中，检测并量化对应于异二聚体的峰。74.图17b显示异二聚体峰的hplcsec量化，显示为占总蛋白质的百分比。75.图17c显示异二聚体峰的hplcsec量化，显示为总面积(c)。76.图18表格显示了1:3比例的结果汇总。组合/突变id17以灰色突出显示，因为它给出了异二聚体的最低表达。77.详细说明78.现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有相反的明确指示，否则如此定义的每个方面都可以与任何其他一个或多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。79.通常，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在整个本技术说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的那样。参见，例如，green和sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，第4版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(2012)；therapeuticmonoclonalantibodies:frombenchtoclinic，zhiqiangan(主编)，wiley，(2009)；和antibodyengineering，第2版，第1卷和第2卷，ontermann和duebel编，springer-verlag，海德堡(2010年)。80.酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学相关使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。81.本发明提供用于兽医用途的生物疗法，特别是用于治疗狗。特别地，本发明涉及用于靶向多种疾病修饰分子的异二聚体分子，例如多特异性分子，以及用于产生此类分子的方法。本发明基于对形成二聚体蛋白质界面的残基，特别是犬iggch3结构域中的残基的操作。在犬iggch3结构域中引入成对的静电转向氨基酸突变会在fc二聚体界面产生改变的电荷极性，从而使来自不同亲本抗体的异源重链彼此之间具有强烈且更特异的相互作用，而通过同源重链的同二聚体形成由于静电转向突变实现的排斥电荷而被最小化。82.因此，在第一方面，本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其包含83.a)第一多肽，其包含第一犬iggch3结构域和84.b)第二多肽，其包含第二犬iggch3结构域85.其中所述第一和第二犬iggch3结构域包含一个或多个电荷对置换。86.所述一个或多个电荷对置换促进异二聚化。87.在第二方面，本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其包含88.a)第一多肽，其包含第一犬iggch3结构域和89.b)第二多肽，其包含第二犬iggch3结构域90.其中只有犬iggch3结构域中的一个包含一个或多个电荷对置换，而另一个不包含。91.所述一个或多个电荷对置换促进异二聚化。92.术语iggch3结构域是指免疫球蛋白(ig)分子的恒定重链3。[0093]“第一多肽”是与第二多肽缔合的任何多肽，在本文中也称为“链a”。第一和第二多肽在“界面”处彼此相遇/缔合。“第二多肽”是通过“界面”与第一多肽缔合的任何多肽，在本文中也称为“链b”。“界面”包括第一多肽中与第二多肽界面中的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用的那些“接触”氨基酸残基。犬iggch3结构域包括此类界面的接触残基。[0094]如本文所用，界面包含犬iggch3结构域的残基，即源自犬或犬源化igg抗体的fc区的ch3结构域。[0095]异二聚体或异二聚体蛋白质通常是指由两个相似但不相同的亚基组成的蛋白质。异二聚体蛋白质的一个示例是双特异性抗体。[0096]如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白(ig)分子，或其抗原结合部分或片段，由四条多肽链、两条重(h)链和两条轻(l)链组成，或其任何功能片段，突变体，变体或衍生物，其保留了ig分子的基本表位结合特征。此类突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆抗体或单克隆抗体。[0097]在全长抗体中，每条重链由重链可变区或结构域(本文缩写为hcvr)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个恒定重链结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区或结构域(本文缩写为lcvr)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。[0098]每条l链通过一个共价二硫键与h链连接，而两条h链通过一个或多个二硫键相互连接，取决于h链同种型。每条h和l链还具有规则间隔的链内二硫键。每条h链在n末端都有可变结构域(vh)，随后是α和γ链各自的三个恒定结构域(ch)以及μ和ε同种型的四个ch结构域。每条l链在n端都有可变结构域(vl)，随后是在其另一端的恒定结构域。vl与vh对齐，cl与重链(ch1)的第一个恒定结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。vh和vl的配对一起形成单个抗原结合位点。[0099]抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“vh”和“vl”。这些结构域通常是抗体最易变的部分(相对于同类的其他抗体)并包含抗原结合位点。术语“可变的”是指可变结构域的某些区段在抗体之间的序列差异很大的事实。v结构域域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并不是均匀分布在可变结构域的整个跨度上。相反，它集中在轻链和重链可变域两者中称为高变区(hvr)的三个区段中。可变结构域的更高度保守部分称为框架区(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr区，主要采用β折叠结构，由三个hvr连接，其形成环连接，在某些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的hvr被fr区紧密结合在一起，并且与来自另一条链的hvr一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。[0100]重链和轻链可变区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，中间散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每条重链和轻链可变区由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。[0101]免疫球蛋白分子通常可以是任何同种型、类别或亚类。根据本发明的各个方面的ch3结构域是犬igg亚型的ch3结构域，例如igg-a、igg-b、igg-c和igg-d。[0102]在犬中，有四种igg重链，称为a、b、c和d。这些重链代表狗igg的四种不同亚类，称为igg-a、igg-b、igg-c和igg-d。这4种重链的dna和氨基酸序列首先由tang等人鉴定。(vet.immunol.immunopathol.80:259-270(2001))。这些重链的氨基酸和dna序列也可从genbank数据库中获得(igga：登录号aal35301.1，iggb：登录号aal35302.1，iggc：登录号aal35303.1，iggd：登录号aal35304.1)。犬抗体也含有两种类型的轻链，κ和λ(genbank登录号κ轻链氨基酸序列aby57289.1，genbank登录号aby55569.1)。氨基酸序列如图5和6所示。[0103]因此，本发明具体涵盖包括犬igg-a、igg-b、igg-c或igg-d中的ch3结构域的修饰的方面。如上所述，在定义位置的残基在同种型之间可能不同。此外，另一种同位素中的相应位置可能有不同的编号，如图6所示。[0104]术语“cdr”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中有三个cdr，对于每个可变区，它们被指定为cdr1、cdr2和cdr3。术语“cdr组”是指一组三个cdr，它们出现在能够结合抗原的单个可变区中。根据本领域已知的不同系统，可以不同地定义这些cdr的确切边界。[0105]kabat互补决定区(cdr)基于序列可变性，是人类抗体最常用的编号系统之一(kabat等人，(1971)ann.nyacad.sci.190:382-391和kabat，等人,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)。相反，chothia指的是结构环的位置(chothia和leskj.mol.biol.196:901ꢀ‑917(1987))。术语“kabat编号”、“kabat定义”和“kabat标签”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语是指氨基酸残基的编号系统，这些氨基酸残基比抗体的重链和轻链可变区或抗原结合部分中的其他氨基酸残基更易变(即，高变)。[0106]当提到犬残基时，本文使用的编号是指犬igg同种型，特别是igg-d和igg-b，如图6所示。显示的第一个残基(m)编号为1，连续的氨基酸残基被赋予连续的编号。然而，如上所述，本发明不限于这些同种型并且本发明的方面还包括igg-a和igg-c同种型。在这些同种型中，修饰位置(例如377、416、463)的特定残基可能与igg-d中发现的残基不同(参见图6)。[0107]抗体的蛋白水解消化释放不同的片段，称为fv(可变片段)、fab(抗原结合片段)和fc(结晶片段)。fc片段包含通过二硫化物连接在一起的两条h链的羧基末端部分。fc片段的恒定结构域负责介导抗体的效应子功能。[0108]根据本发明的方面和实施方案，也考虑了抗原结合片段。抗原结合片段包括，例如，fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、单域抗体(sdab)，例如vh单域抗体、包括互补决定区(cdr)的片段、单链可变片段抗体(scfv)、大抗体(maxibody)、小抗体(minibody)、胞内抗体(intrabody)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)和双-scfv，以及含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，其足以赋予多肽的特异性抗原结合。[0109]“fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中产生六个高变环(h和l链各有3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个hvr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。“单链fv”也缩写为“sfv”或“scfv”是包含连接成单个多肽链的vh和vl抗体结构域的抗体片段。[0110]术语“抗原结合位点”是指包含特异性结合抗原的区域的抗体或抗体片段的部分。抗原结合位点可由一个或多个抗体可变结构域提供。优选地，抗原结合位点包含在抗体或抗体片段的相关vh和vl内。[0111]“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其包含包括来自一个物种的抗体的互补决定区(cdr)的可变结构域，而抗体分子的恒定结构域则来自另一物种的恒定结构域，例如犬抗体。示例性的嵌合抗体是嵌合人-犬抗体。[0112]“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的cdr，从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移到人重链和轻链可变结构域(例如框架区序列)。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。在某些实施方案中，来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基可以被置换到人抗体框架区序列中。[0113]如本文所用，术语“犬源化抗体”是指包含来自犬和非犬(例如，鼠)抗体的序列的重组抗体的形式。一般而言，犬源化抗体将包含基本上所有的至少一个或更典型地，两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非犬免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的框架(fr)区域(通常是所有或基本上所有的剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的区域。犬源化抗体可包含来自鼠或人抗体的三个重链cdr和三个轻链cdr以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个氨基酸改变，其可以进一步优化犬源化抗体的有效性，例如，以增加其与其靶标的结合。[0114]如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)，包含群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是通过杂交瘤培养物合成的，未被其他免疫球蛋白污染。[0115]术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原表面上的一个位点(免疫球蛋白、抗体或抗体片段与之特异性结合。通常，抗原具有几个或许多不同的表位并与许多不同的抗体反应。该术语特别包括线性表位和构象表位。蛋白质抗原内的表位可以由通过蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸(通常是线性表位)或非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个独特空间构象的氨基酸。确定哪些表位被给定抗体或抗体片段结合的方法(即表位定位)是本领域众所周知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试重叠或连续肽与给定抗体或抗体片段的反应性。当两种抗体识别相同或空间重叠的表位时，抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间重叠的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以不同的形式配置。[0116]术语“分离的”蛋白质或多肽是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他蛋白质或多肽的蛋白质或多肽。此外，蛋白质或多肽可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。因此，本文所述的蛋白质、核酸和多肽优选是分离的。因此，如本文所用，“分离的”蛋白质、异源二聚体蛋白质、异源多聚体或多肽是指已从其天然细胞培养环境的成分中鉴定和分离和/或回收的异源二聚体蛋白质、异源多聚体或多肽。其自然环境的污染物成分是会干扰异二聚体蛋白质、异多聚体或多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。[0117]本文中的“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸之一或可能存在于特定、确定位置的任何非天然类似物。氨基酸包括天然存在的和合成的氨基酸两者。虽然在大多数情况下，当重组生产蛋白质时，仅使用天然存在的氨基酸。[0118]如本文所用，在本文所述的异二聚体蛋白质或多肽(例如抗体)的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“置换一个氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替换一个氨基酸残基”并表示原始(例如野生型/种系)氨基酸序列中具体位置的特定氨基酸残基已被不同的氨基酸残基替换(或置换)。这可以使用技术人员可用的标准技术来完成，例如使用重组dna技术。氨基酸相对于自然界中野生型(wt)中发现的天然(野生型/种系)序列发生了变化，但可以在包含相对于天然序列的其他变化的igg分子中产生。本文中的“野生型”或“wt”或“天然”是指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。wt蛋白、多肽、抗体、免疫球蛋白、igg等具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。[0119]因此，本发明提供了不同于亲本ch3结构域的变体ch3结构域。如本文所用，“亲本多肽”、“亲本蛋白质”、“前体多肽”或“前体蛋白质”是指未经修饰的多肽，其随后被修饰以产生变体。所述亲本多肽可以是天然存在的多肽，或者是天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。[0120]在异二聚体蛋白质的一个实施方案中，第一和/或第二第一犬iggch3结构域包含一个或多个，例如1、2或3个氨基酸置换。[0121]本文中的“位置”是指蛋白质氨基酸序列中的位置，例如参考图5或6。相应的位置如所概述的那样确定，通常通过与其他同种型序列比对来确定。残基是出现在具体位置的氨基酸。[0122]例如，犬iggch3中的氨基酸被置换，使得相反侧链电荷的氨基酸被引入相反的ch3结构域。因此，一个或多个置换用带相反电荷的氨基酸替换氨基酸。[0123]如上所述，可以在任何犬igg同种型中进行置换，技术人员将能够鉴定另一种同种型中的相应位置。[0124]本文中的“变体”或“突变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本(例如野生型序列)的多肽序列。如本文所用，在本文所述的蛋白质或多肽的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“置换一个氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替换一个氨基酸残基”并且表示原始(例如野生型/种系)氨基酸序列中具体位置的特定氨基酸残基已被不同的氨基酸残基替换(或置换)。这可以使用技术人员可用的标准技术来完成，例如使用重组dna技术。氨基酸相对于自然界中野生型(wt)中发现的天然(野生型/种系)序列发生了变化，但可以在包含相对于天然序列的其他变化的igg分子中产生。[0125]在某些实施方案中，异二聚体蛋白质包含指定的氨基酸置换并且可以在ch3结构域或氨基酸序列中的另一位置具有额外的突变。在其他实施方案中，异二聚体蛋白质仅在ch3结构域中具有指定的氨基酸置换并且在ch3结构域中不具有任何其他氨基酸置换和/或其他突变。在其他实施方案中，异二聚体蛋白质仅在ch3结构域中具有指定的氨基酸置换并且在蛋白质序列中没有任何其他突变。因此，在一个实施方案中，所提供的氨基酸置换由所列举的那些组成。[0126]igg-d中的修饰[0127]下面列出了参考igg-d氨基酸序列中残基编号的修饰。该序列如图5和6所示。igg-d的序列是seqidno.4。因此，编号参照seqidno.4。[0128]在另一个方面，本发明涉及异二聚体蛋白质，其包含包含第一犬iggch3结构域的第一多肽和包含第二犬iggch3结构域的第二多肽，其中[0129]a)所述第一犬iggch3结构域包含在igg-d中的位置424、423、377、378、382的一个或多个处或者igg-a、b或d中的相应位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在igg-d中的位置414、416、433、392、377、393的一个或多个处或者igg-a、b或d中的相应位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或在425处用n进行的氨基酸置换；[0130]b)其中第一犬iggch3结构域包含在igg-d中的383、393和/或382处或者igg-a、b或d的相应位置处的氨基酸置换并且第二犬iggch3结构域不包含相应的突变或[0131]c)其中第二犬iggch3结构域包含在igg-d中的463或425处或者igg-a、b或d中的相应位置处的氨基酸置换并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。[0132]本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其中[0133]a)所述第一犬iggch3结构域包含在igg-d中的位置e424、d423、d/k377、e378的一个或多个处或者igg-a、b或d中的相应位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在igg-d中的位置k414、h/r416、k433、k392的一个或多个处或者igg-a、b或d中的相应位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时当残基是k；[0134]b)其中第一犬iggch3结构域包含在igg-d中的d383、d393或者igg-a、b或d中的相应位置处和/或igg-d中的s382处或者igg-a、b或d中的相应位置处的氨基酸置换并且第二犬iggch3结构域不包含相应的突变或[0135]c)或其中第二犬iggch3结构域包含在igg-d中的l463或425处或者igg-a、b或d中的相应位置处的氨基酸置换并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。[0136]在一个实施方案中，参照犬igg-d中的具体残基，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e424、d423、k377或e378的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414、h416、k433、k392的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或l463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换或者，其中第二犬iggch3结构域包含l463处的氨基酸置换，并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。技术人员会理解，在其他犬igg同种型中，可以在具体位置发现不同的残基。如图6所示。例如，在犬igg-c中，第377位的残基是d。在犬的同种型igg-a、igg-b和igg-c中，第416位的残基是r。[0137]参照犬igg-d中具体残基的置换可以如下选择：e424处的置换为e424k、e424r或e424h，d423处的置换为d423k、d423r或d423h，e378处的置换为e378k、e378r或e378h，k377处的置换为k377e或k377d，d377处的置换为d377k，d377r或d377h，k414处的置换为k414e或k414d，h/r416处的置换为h/r416d或h/r416e，k433处的置换是k433d或k433e，l463处的置换是l463k、l463r、l463hl463e或l463d，k463处的置换是k463d或k463e，k392处的置换是k392e或k392d。[0138]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0139]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414处用带负电荷氨基酸进行的氨基酸置换和在位置h/r416处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一实施方案中，e424处的置换为e424k，k414处的置换为k414e且h/r416处的置换为h/r416d。[0140]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第二犬iggch3结构域包含在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一实施方案中，d423处的置换为d423k，k433处的置换为k433d。[0141]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置h/r416处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一实施方案中，d423处的置换为d423k，k433处的置换为k433d且h/r416处的置换为h/r416d。[0142]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第二犬iggch3结构域包含在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一实施方案中，e424处的置换为e424k，k414处的置换为k414e且k433处的置换为k433d。[0143]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第二犬iggch3结构域包含在k433位用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在k414位用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在h/r416位用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，e424处的置换为e424k，k414处的置换为k414e且h/r416处的置换为h/r416d。[0144]在一个实施方案中，第二犬iggch3结构域包含在位置l463处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变。[0145]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e378处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域在位置k392处包含用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，e378处的置换为e378k，k392处的置换为k392e。[0146]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置h/r416处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，e424处的置换是e424k，k414处的置换是k414e，h/r416处的置换是h/r416d，l463处的置换是l463k。[0147]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换代，在位置h/r416处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，d423处的置换是d423k，k333处的置换是k433e，h/r416处的置换是h/r416d，l463处的置换是l463k。[0148]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置l463处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，e424处的置换为e424k，k414处的置换为k414e且l463处的置换为l463e。[0149]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，d423处的置换是d423k，k333处的置换是k433e，且l463处的置换是l463k。[0150]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，e424处的置换是e424k，d423处的置换是d423k，k414处的置换是k414e，且l463处的置换是l463k。[0151]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k/d377处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，如果残基是k或带正电荷的氨基酸，如果残基是d，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，e424处的置换是e424k，k377处的置换是k377e，k414处的置换是k414e，且l463处的置换是l463k。[0152]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k/d377处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，如果残基是k或带正电荷的氨基酸，如果残基是d，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，d423处的置换是d423k，k/d377处的置换是k/d377e，k333e处的置换是k433e，且l463处的置换是l463k。[0153]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e424处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置d423处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k/d377处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，如果残基是k或带正电荷的氨基酸，如果残基是d，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k414处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置k433处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，d423处的置换是d423k，e424处的置换是e424k，k377处的置换是k377e，k414处的置换是k414e，k433处的置换是k433d且l463处的置换是l463k。[0154]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e378处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k392处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置e378处的氨基酸置换为e378k，位置k392处的氨基酸置换为k392e。[0155]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d393处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k377处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置d393处的氨基酸置换为d393k，位置k377处的氨基酸置换为k377d。[0156]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e378处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d393处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第二犬iggch3结构域包含在位置k392处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k377处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置e378处的氨基酸置换为e378k，位置k392处的氨基酸置换为k392e，位置d393处的氨基酸置换为d393k，位置k377处的氨基酸置换为k377d。[0157]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置k377处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置l/k463处用带电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，当残基是l和带负电荷的氨基酸时，当残基是k时。在一个实施方案中，位置k377处的氨基酸置换是k377e，且位置l463处的氨基酸置换是l463k。[0158]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置s382处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域不包含突变。在一个实施方案中，位置s382处的氨基酸置换为s382k。[0159]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置d383处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域不包含突变。在一个实施方案中，位置d383处的氨基酸置换为d383n。[0160]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域位置处的氨基酸置换包括在位置s382处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d393处用n进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域不包含突变。在一个实施方案中，位置s382处的氨基酸置换为s382k，位置d393处的氨基酸置换为d393n。[0161]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置s382处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置d393处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置s382处的氨基酸置换为s382d，位置d393处的氨基酸置换为d393k。[0162]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域不包含氨基酸置换并且所述第二犬iggch3包含在位置d425处用n进行的的氨基酸置换。[0163]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置s382处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置d393处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在d425处用n进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置s382处的氨基酸置换为s383d。在一个实施方案中，位置d393处的氨基酸置换为d393k，并且位置d383处的氨基酸置换为d383n。[0164]因此，在一个实施方案中，e424处的置换是e424k、e424r或e424h，d423处的置换是d423k、d423r或d423h，e378处的置换是e378k、e378r或e378h，k377处的置换是k377e或k377d，d377处的置换是d377k、d377r或d377h，k414处的置换是k414e或k414d，h/r416处的置换是h/r416d或h/r416e，k433处的置换是k433d或k433e，l463处的置换是l463k，l463r，l463hl463e或l463d，k463处的置换是k463d或k463e，k392处的置换是k392e或k392d，e378处的置换是e378k，e378r或e378h，d393处的置换是d393k，d393r或d393h，s382处的置换是s382k、s382r或s382h，d383处的置换是d383n，d425处的置换是n。[0165]在一个实施方案中，ch3结构域中的突变选自如表1中所示的突变id1至26之一。可以另外包括突变id27中的突变。[0166]也在本发明范围内的是修饰的ch3结构域，例如分离的ch3结构域，即在位置428、427、382、383、386、420、418、437、467、396、397、429、424、423、377、378、382、414、416、433、392、377、393、463、425、383、393和/或382中的一个或多个处具有氨基酸置换的ch3结构域。置换可以用带相反电荷的氨基酸，并且可以选自表1中所示的那些。[0167]如上所述，可以在任何犬igg同种型中进行置换，技术人员将能够鉴定在另一种同种型中的相应位置。[0168]igg-b中的修饰[0169]下面列出了参考igg-b氨基酸序列中残基编号的修饰。该序列如图5和6所示。igg-b的序列是seqidno.2。因此，编号参照seqidno.2。[0170]在一个方面，本发明涉及一种异二聚体蛋白质，其包含[0171]包含第一犬iggch3结构域的第一多肽和包含第二犬iggch3结构域的第二多肽，其中所述igg选自igg-a、b、c或d，其中[0172]a)所述第一犬iggch3结构域包含在igg-b中的位置428、427、382、383的一个或多个处或者在igg-a、c或d中的相应位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在igg-b中的位置420、418、437、467、396的一个或多个处或者在igg-a、c或d中的相应位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换；[0173]b)所述第二犬iggch3结构域包含在igg-b中的429处或者igg-a、c或d中的相应位置处的氨基酸置换并且第一犬iggch3结构域不包含相应的突变或[0174]c)所述第一犬iggch3结构域包含在igg-b中的387处或者igg-a、c或d中的相应位置处的氨基酸置换并且第二犬iggch3结构域不包含相应的突变。[0175]例如，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428、d427、e382、e383的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420、k418、k437、k467、k396的一个或多个处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0176]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0177]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0178]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0179]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0180]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428k处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0181]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428k处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0182]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428k处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0183]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428k处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第二犬iggch3结构域包含在位置k420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0184]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e382处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k467处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0185]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e383处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k396处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0186]在一个实施方案中，第一犬iggch3结构域包含在位置e382处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0187]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e382处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0188]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e382处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0189]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e372处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0190]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e383处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d427处用带正电荷氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0191]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e383处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0192]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e383处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0193]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e383处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0194]在一个实施方案中，其中所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k467处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0195]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置r467处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0196]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k396处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0197]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k396用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0198]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置r420处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k467处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0199]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k396处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，和在位置k467处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0200]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置467处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0201]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在位置k396处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0202]在一个实施方案中，其中所述第一犬iggch3结构域包含在位置e428处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k418处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0203]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置d427处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置k437处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0204]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置k386处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置d397处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。[0205]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域不包含氨基酸置换并且所述第二犬iggch3包含在位置d429处的氨基酸置换。[0206]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置k386处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置d397处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和在d429处的置换。[0207]在一个实施方案中，所述第一犬iggch3结构域包含在位置n387处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域不包含氨基酸置换。[0208]在一个实施方案中，e428处的置换是e428k、e428r或e428h，d427处的置换是d427k、d427r或d427h，e382处的置换是e382k、e382r或e382h，e383处的置换是e383k、e383r、e383h或e383r，r420处的置换是r420e或r420d，k418处的置换是k418e或k418d，k437处的置换是k437d或k437e，k467处的置换是k467d或k467e，k396处的置换是k396e或k396d，k386处的置换是k386e或k386d，d397处的置换是d397k、d397r或d397h并且d429处的置换是d429n或n387处的置换是n387d。[0209]在一个实施方案中，e428处的置换是e428k，d427处的置换是d427k，e382处的置换是e382k，e383处的置换是e383k，r420处的置换是r420d，k418处的置换是k418e，k437处的置换是k437d，k467处的置换是k467e，k396处的置换是k396e，k386处的置换是k386d，d397处的置换是d397k并且d429处的置换是d429n。[0210]在一个实施方案中，ch3结构域中的突变选自如表2中所示的突变id之一。在一个实施方案中，ch3结构域中的突变选自表2所示的以下突变id之一：2、3、4、5、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28或29。在一个实施方案中，ch3结构域中的突变选自如图18中所示的组合id之一。在一个实施方案中，ch3结构域中的突变选自组合id24和25中的一个。[0211]也在本发明范围内的是修饰的ch3结构域，例如分离的ch3结构域，即在位置428、427、382、383、386、420、418、437、467、396、397、429的一个或多个处具有氨基酸置换的ch3结构域。置换可以用带相反电荷的氨基酸，并且可以选自表2中所示的置换之一。[0212]双特异性抗体的挑战包括组装和纯化问题、生产挑战(重链异二聚化、轻链配对、对单特异性污染物的双特异性纯化)。如实施例和图7、8和9所示，在所用的实验条件下，某些突变组合会产生不表达、不配对或在凝胶上形成“模糊”的分子，即多种可能的形式而不是产生明确的双特异性分子。因此，在一些实施方案中，本发明的方面涉及参照表2的突变id2-5、10-14、16-26、28和29。[0213]在一个实施方案中，如本文所述的异二聚体蛋白质可在ch3结构域中包括额外的突变或可不在ch3结构域中包括额外的突变。例如，1、2、3、4、5或更多个额外突变可包括在ch3结构域中。额外的突变可以是促进异二聚化的突变。因此，本领域技术人员将理解，上述任何组合集均可进一步与ch3结构域中的此类额外突变组合。[0214]在一个实施例中，引入一种或多种额外突变以再现“杵-臼fc技术”(kih)。使用这种技术，在第一个多肽的ch3结构域中引入较大的氨基酸酪氨酸以取代较小的氨基酸，从而形成“杵”。第二种多肽以相反的方式进行操作，用较小的氨基酸置换较大的氨基酸以产生“臼”。这产生空间位阻效应，其促进具有犬iggch3结构域的第一和第二多肽之间所需的异源二聚体组装。[0215]例如，第一犬iggch3结构域包含在位置t388处的氨基酸置换，并且所述第二犬iggch3结构域包含在位置t388、l390和y431处的氨基酸置换，参考igg-d编号。[0216]在一个实施方案中，突变是在位置t388、l390和y431中的一个或多个位置处的置换并且参考igg-d编号选自t388w、t388s、l390a和y431v。参考igg-b编号，这些是t392s、l394a、y435v和t392w。[0217]技术人员将理解ch3结构域中的不同突变，例如改变fc结构域界面电荷的突变和使用“杵-臼fc技术”(kih)的突变可以组合在本发明的分子和方法中。[0218]当使用本发明的修饰的多肽时，例如通过质谱测定，同二聚体形成的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。[0219]本发明的变体包括ch3结构域中的一处或多处置换，并且它们可以包括任何数量的进一步修饰，只要蛋白质的功能仍然存在，如本文所述。然而，一般而言，除了ch3修饰外，通常还使用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰，因为通常目的是通过最少数量的修饰来改变功能。在一些情况下，有1到5个修饰，其中1-2、1-3和1-4也可用于许多实施方案中。应该注意的是，氨基酸修饰的数量可能在功能域内：例如，可能希望在野生型或工程化的蛋白质的fc区有1-6个修饰，以及例如，ch3区域中1到6个修饰。变体多肽序列将优选地与野生型序列或亲本序列具有至少约80％、85％、90％、95％或高达98％或99％的同一性。应当注意，根据序列的大小，同一性百分比将取决于氨基酸的数量。[0220]在用于创建bsab的众多平台中，基于对天然ab结构的最小的变化以及bsab可以从两个亲本ab形成的简单性，受控fab-臂交换(cfae)已被证明是有用的(labrijn等人，(2013)efficientgenerationofstablebispecificigg1bycontrolledfab-armexchange.proc.natl.acad.sci.u.s.a.110,5145-5150)。受控的fab臂交换使用最少的一组突变并避免了轻链配对问题，因为半抗体的交换可以在不扰乱正确的重链-轻链相互作用的情况下进行。因此，除了上述突变之外，cfae也可用于本发明。[0221]因此，本发明还提供了修饰的犬igg，其包含代替其天然igg铰链区的来自另一种同种型的铰链区，例如igg-d，其包含代替其天然igg-d铰链区的来自igg-a、igg-b或igg-c的铰链区，或者igg-b，其包含代替其天然igg-b铰链区的来自igg-a、igg-c或igg-d的铰链区。此类修饰可导致缺乏fab臂交换的犬igg-d。修饰的犬igg可以使用重组dna技术的标准方法构建[例如，maniatis等人，molecularcloning，alaboratorymanual(1982)]。为了构建这些变体，可以修饰编码犬igg氨基酸序列的核酸，例如igg-b或igg-d，使其编码修饰的igg。然后将修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白质表达。[0222]在本发明的异二聚体蛋白质的一个实施方案中，异二聚体蛋白质包含fc区，例如犬或fc区或源自犬fc区的区域。[0223]在本发明的异二聚体蛋白质的一个实施方案中，第一多肽是抗体重链和/或所述第二多肽是抗体重链，例如犬抗体重链、犬源化抗体重链或源自犬的抗体重链的抗体重链。在一个实施方案中，第一多肽和所述第二多肽均为抗体重链，例如犬抗体重链、犬源化抗体重链或fc区或源自犬抗体重链的重链。[0224]在本发明的异二聚体蛋白质的一个实施方案中，异二聚体蛋白质包含第一和第二轻链，例如犬抗体轻链、犬源化抗体轻链或源自犬抗体轻链的轻链。[0225]在一个实施方案中，异二聚体蛋白质是抗体，例如犬抗体、犬源化抗体轻链或源自犬抗体的抗体。[0226]在一个实施方案中，抗体是多特异性抗体或其片段。多特异性蛋白质，例如多特异性抗体，结合至少两个不同的靶标，即至少是双特异性的。因此，在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体或其片段。在其他实施方案中，多特异性抗体或其片段结合三个、四个或更多靶标。[0227]在一个实施方案中，特别是对于癌症的治疗，蛋白质可以靶向cd3并且以双特异性t细胞衔接器(bite)的形式提供。[0228]在一个实施方案中，该蛋白质是多互补位的，即结合同一靶标上的一个以上表位。[0229]双特异性抗体对不超过两个表位具有特异性。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结合域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同的抗原上，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同的抗原上，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在另一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结合域序列和轻链可变结合域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在另一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的抗体和对第二表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体或其片段包含对第一表位具有结合特异性的fab和对第二表位具有结合特异性的fab。[0230]也在本发明范围内的是scfv形式。[0231]在另一个实施方案中，异二聚体蛋白质，例如fc多肽或抗体或其片段包含另外的部分。[0232]例如，异二聚体蛋白质是fc受体融合蛋白。[0233]fc区与称为fcγ受体(fcγr)的受体家族结合(engage)。所有fcγr都与fc上非常相似的结合位点相互作用。已知恒定区，特别是fc片段内的c区，负责免疫球蛋白的各种效应子功能。另一方面，可变区介导抗原特异性。因此，效应子功能由fc片段介导，而不是由提供抗原特异性的可变区介导。与fcγr的结合会引发多种反应，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或吞噬作用。用于兽医用途的修饰的fc区在例如wo2019/035010中有所描述，该专利申请通过引用并入本文。因此，例如wo2019/035010中描述的fc修饰可以与本文描述的异二聚化修饰组合，并且具有此类组合修饰的蛋白质在本发明的范围内。此类修饰包括相对于野生型iggfc的氨基酸修饰，这导致例如包括增加的蛋白a结合(例如，为了便于纯化)、减少的clq结合(例如，为了减少补体介导的免疫反应)、减少的cd16结合(例如，用于减少抗体依赖性细胞毒性(adcc)诱导、增加稳定性和/或形成异二聚体蛋白质的能力。[0234]存在三类人类fcγ受体(fcγr)，它们允许igg与免疫系统的细胞相互作用。此外，新生儿fcrn在igg的胎盘转运和防止igg降解中发挥作用，从而延长循环igg的半衰期。各种类型的fcγr具有不同的细胞分布及其特性，包括具有重要功能的多态性的细节。fcγri(高亲和力)、fcγriiia(中等亲和力)以及fcγriia和fcγriiib(低亲和力)都是激活受体，这些受体的结合(engagement)会导致炎症反应，包括靶细胞的破坏。相反，低亲和力fcγrilb是唯一的抑制性fcγr，因此具有特殊意义。fcγrilb存在于b细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞以及巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上，在b细胞上起到防止活化和增殖的作用，在巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上可以抑制靶细胞的破坏。[0235]例如，本文所述的fc多肽可以与能够特异性结合靶分子的结合结构域组合。因此，在一方面，本发明涉及包含如本文所述的fc区的融合蛋白。在融合蛋白中，一个或多个多肽可操作地连接至本发明的fc区。例如，fc结构域可以链接到fab结合结构域。结合结构域可包含例如共价或以其他方式(例如疏水相互作用、离子相互作用或通过硫桥连接)缔合的多于一条多肽链。[0236]本文所述的修饰也可以与任何其他fc修饰组合，例如与修饰的效应子功能组合。[0237]通常，可操作地连接至本发明的fc区的一个或多个多肽可以是任何蛋白质或小分子，例如源自对另一分子具有特异性并能够结合所述分子的任何分子的结合结构域。结合结构域将具有与靶分子相互作用的能力，该靶分子优选是另一种多肽，但可以是任何靶标(例如碳水化合物、脂质(例如磷脂)或核酸)。优选地，相互作用将是特异性的。通常，靶标是存在于细胞上的抗原，或具有可溶性配体的受体。这可以被选为治疗靶标，由此期望将其与具有上述特性的分子结合。靶标可以存在于靶细胞上或靶细胞中，例如需要裂解的靶细胞，或需要在其中诱导细胞凋亡的靶细胞。因此，蛋白质融合伴侣(partner)可以包括但不限于任何抗体的可变区、受体的靶标结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、抗原、趋化因子或任何其他蛋白质或蛋白质结构域。小分子融合伴侣可以包括将fc融合引导至治疗靶标的任何治疗剂。此类靶标可以是与疾病有关的任何分子，优选细胞外受体。[0238]本发明还涉及本文定义的fc在制备fc融合蛋白的方法中的用途。例如，这可用于通过具有fc融合来产生具有延长半衰期的异二聚体。[0239]在另一个实施方案中，本发明的抗体包含另外的部分。例如，该部分是延长半衰期的部分，例如犬或犬源化血清白蛋白或其变体。还可以修饰抗体以增加半衰期，例如通过化学修饰，特别是通过聚乙二醇化，或通过掺入脂质体中。[0240]半衰期可增加至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍，大于没有半衰期延长的相应抗体的半衰期。例如，与没有半衰期延长部分的相应的抗体相比，增加的半衰期可以超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时。[0241]在另一个实施方案中，该部分是治疗部分，例如药物、酶或毒素。在一个实施方案中，治疗部分是毒素，例如细胞毒性放射性核素、化学毒素或蛋白质毒素。因此，本发明还包括免疫缀合物，例如缀合(连接)到第二分子(通常是毒素、放射性同位素或标记)的抗体。这些缀合物用于免疫疗法和开发单克隆抗体疗法作为化疗的靶向形式，通常称为抗体-药物缀合物(adc)。[0242]毒性有效负载可以选自小分子(例如美登木素生物碱、澳瑞他汀(auristatin))、蛋白质毒素(例如假单胞菌外毒素、白喉毒素)、杀死靶细胞的细胞溶解免疫调节蛋白(例如fas配体)、延长天然肽的药理学半衰期的生物活性肽(例如glp-1、改变靶向的微环境的生物化学的酶(如脲酶)或用于杀死或成像肿瘤细胞的放射性核素(如90y、111in)。[0243]在另一个实施方案中，抗体用可检测或功能标记标记。标记可以是产生或可以被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光团、荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂、核磁共振活性标记或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合。[0244]使用本领域已知的接头，例如通过化学或肽接头，可以将该部分连接至异二聚体蛋白质，例如抗体。连接可以是共价的或非共价的。示例性的共价连接是通过肽键。在一些实施方案中，接头是多肽接头(l)。合适的接头包括例如具有gs残基的接头，例如(gly4ser)n，其中n＝1-50，例如1至10。其他连接/缀合技术包括半胱氨酸缀合，例如基于半胱氨酸的位点特异性抗体缀合到毒性有效负载。[0245]在另一方面，本发明涉及包含犬iggch3结构域的多肽，其中所述多肽包含在igg-d中的位置k414处或在igg-a、b或c中的相应位置处用带负电荷的氨基酸进行的氨基酸置换或在igg-d的位置e424处或在igg-a、b或c的相应位置处用带正电荷的氨基酸进行的氨基酸置换。在一个实施方案中，该多肽包含fc结构域。在另一方面，本发明涉及包含犬iggch3结构域的多肽，其中所述多肽包含在igg-d中的位置424、423、378、414、416、433、392、383、393、383或378或者在igg-a、b或c中的相应位置用具有相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或在igg-d中的436处或者在igg-a、b或c中的相应位置处用带电荷的氨基酸或具有相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换和/或在igg-d中的425处或在igg-a、b或c中的相应位置用n进行的氨基酸置换。[0246]例如，参考igg-b，多肽可以包含犬iggch3结构域，其中所述多肽包含在位置428、427、382、383、420、418、437、467、386、397、396、429中的一个或多个位置处用相反电荷的氨基酸进行的氨基酸置换或在429或387处进行的置换。[0247]因此，参考igg-b，在一个实施方案中，e428处的置换是e428k、e428r或e428h，d427处的置换是d427k、d427r或d427h，e382处的置换是e382k、e382r或e382h，e383处的置换是e383k、e383r、e383h或e383r，r420处的置换是r420e或r420d，k418处的置换是k418e或k418d，k437处的置换是k437d或k437e，k467处的置换是k467d或k467e，k396处的置换是k396e或k396d，k386处的置换是k386e或k386d，d397处的置换是d397k、d397r或d397h，k387处的置换是k387d或k387e，且d429处的置换是d429n。[0248]在一个实施方案中，e428处的置换是e428k，d427处的置换是d427k，e382处的置换是e382k，e383处的置换是e383k，r420处的置换是r420d，k418处的置换是k418e，k437处的置换是k437d，k467处的置换是k467e，k396处的置换是k396e，k386处的置换是k386d，d397处的置换是d397k，k387处的置换是k387d并且d429处的置换是d429n。[0249]可在多肽中进行的具体置换在表1和2的突变id中列出，并且也在上文关于异二聚体多肽进行了描述。[0250]在一个实施方案中，多肽是犬、犬源化或犬衍生的重链。在一个实施方案中，该多肽在ch3结构域中包含一个或多个进一步的突变。上文详述了示例性突变。多肽优选是分离的多肽。[0251]在另一方面，本发明涉及编码异二聚体蛋白质或本发明多肽的核酸。核酸优选是分离的核酸。[0252]“分离的核酸分子”是指基因组、mrna、cdna或合成来源的dna或rna或它们的一些组合，其不与在自然界中发现的分离的多核苷酸中的多核苷酸的全部或部分相关联，或者与它在自然界中未与之连接的多核苷酸连接。[0253]此外，我们提供了分离的核酸构建体，其包含至少一种如上所定义的核酸。该构建体可以是质粒、载体、转录或表达盒的形式。因此，本发明还涉及包含本发明的核酸的质粒、载体、转录或表达盒。本发明中使用的表达载体可以从起始载体如市售载体构建。在构建载体并将编码重链或轻链和重链序列的核酸分子插入载体的适当位点后，可将完整的载体插入合适的宿主细胞进行扩增和/或多肽表达。[0254]本发明还涉及分离的重组宿主细胞，其包含一种或多种如上所述的核酸分子质粒、载体、转录或表达盒。表达载体向选定的宿主细胞的转化可通过众所周知的方法完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、deae-葡聚糖介导的转染或其他已知技术。所选择的方法部分取决于所用宿主细胞的类型。[0255]宿主细胞可以是真核或原核细胞，例如细菌、病毒、植物、真菌、哺乳动物或其他合适的宿主细胞。在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中，细胞是酵母细胞。在另一个实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞或对技术人员显而易见的其他细胞。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得的永生细胞系，并且本领域已知的表达系统中使用的任何细胞系都可以用于制备本发明的重组多肽。[0256]通常，宿主细胞用包含编码所需双特异性抗体的dna的重组表达载体转化。可以使用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括cos-7细胞、l细胞、ci27细胞、3t3细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物和在无血清培养基中生长的相关细胞系、hela细胞、bhk细胞系、cviiebna细胞系、人胚肾细胞如293、293ebna或msr293、人表皮a431细胞、人colo205细胞、其他转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来源于原代组织体外培养的细胞株、原代外植体、hl-60、u937、hak或jurkat细胞。任选地，当需要在各种信号转导或报道基因测定中使用多肽时，哺乳动物细胞系例如hepg2/3b、kb、nih3t3或s49可用于表达多肽。[0257]其他合适的宿主细胞包括昆虫细胞，在昆虫细胞、植物细胞、转基因植物和转基因动物中使用表达系统如杆状病毒，并通过病毒和核酸载体。[0258]或者，可以在低等真核生物如真菌细胞系和酵母中或在原核生物如细菌中产生多肽。合适的酵母包括酿酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、克鲁维酵母(kluyveromyce)菌株、毕赤酵母(pichiapastoris)、念珠菌(candida)或任何能够表达异源多肽的酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草杆菌(b.subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)或任何能够表达异源多肽的细菌菌株。如果双特异性抗体是在酵母或细菌中制备的，则可能需要修饰其中产生的产物，例如通过适当位点的磷酸化或糖基化，以获得功能性产物。这种共价连接可以使用已知的化学或酶促方法来完成。[0259]当在适当条件下培养时，宿主细胞可用于表达双特异性抗体，随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果不是分泌)。合适的宿主细胞的选择将取决于多种因素，例如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的难易程度。[0260]技术人员会知道有不同的方法来鉴定、获得和优化本文所述的异二聚体蛋白质，包括体外和体内表达文库。可以使用本领域已知的优化技术，例如展示(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如，易错诱变)。[0261]在这种方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可以展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(例如酵母)上，以便于筛选。用于展示和筛选(一组、集合或文库)氨基酸序列的合适的方法、技术和宿主生物对于本领域技术人员来说是清楚的(参见例如phagedisplayofpeptidesandproteins:alaboratorymanual,academicpress；第1版，briank.kay、jillwinter、johnmccafferty，1996年)。[0262]文库，例如噬菌体文库，是通过分离表达抗体或重链的细胞或组织、克隆编码来自分离的细胞或组织的mrna的基因的序列并使用文库展示编码的蛋白质而产生的。重链可以在哺乳动物、细菌、酵母或其他表达系统中表达。[0263]因此，另一方面，本发明还涉及包含本文所述的多种多肽或抗体的表达文库。噬菌体展示文库筛选优于一些其他筛选方法，因为单个噬菌体展示文库中可以包含大量不同的多肽(通常超过109种)。这允许在单个筛选步骤中筛选高度多样化的文库。通常，文库包括v基因库(例如，从淋巴细胞群收获或体外组装)，这些基因被克隆用于在丝状噬菌体表面展示相关的重链和轻链可变结构域。通过与抗原结合来选择噬菌体。可溶性抗体由噬菌体感染的细菌表达，抗体可以通过例如诱变来改进。建立了通过制备、筛选和进化抗体和抗体库来生产抗体的方法。[0264]在进一步的方面，本发明涉及一种用于制备异二聚体蛋白质或多肽的方法，其包括以下步骤：[0265]a)用本文所述的核酸或载体转化宿主细胞；[0266]b)培养宿主细胞并表达含有多肽的第一和第二iggch3和[0267]c)从宿主细胞培养物中回收异二聚体蛋白质或多肽。[0268]通过该方法获得或可获得的异二聚体蛋白质或多肽也在本发明的范围内。[0269]可以通过本领域已知的多种方法产生基于igg形式的本发明的双特异性抗体，其包含两条重链和两条轻链。例如，双特异性抗体可以通过融合两种抗体分泌细胞系产生新的细胞系或通过使用重组dna技术在单个细胞中表达两种抗体来产生。这些方法产生多种抗体种类，因为每个抗体的各自重链可能形成单特异性二聚体(也称为同二聚体)，其中包含两条具有相同特异性的相同配对重链，以及双特异性二聚体(也称为异二聚体)，其包含两条具有不同特异性的不同配对重链。此外，每个抗体的轻链和重链可能随机配对形成不合适的、无功能的组合。这个问题被称为重链和轻链错配，可以通过选择共享共同轻链的抗体作为双特异性表达来解决。解决轻链-重链错配问题的方法包括使用单条轻链产生双特异性抗体。这需要利用限制多样性的单个轻链的重轻链工程化或新型抗体文库。此外，已经从具有单一轻链的转基因小鼠中鉴定出具有共同轻链的抗体。另一种方法是将一条重链的ch1结构域与其同源轻链的cl结构域交换(crossmab技术)。还包括scfv形式。[0270]另一方面，提供了药物组合物，其包含本发明的异二聚体分子和任选的药学上可接受的载体。本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼部、鼻内、肺部、皮内、玻璃体内(intravitrial)、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、经皮、经粘膜、吸入或局部，特别是耳、鼻、眼或皮肤或吸入。在另一个实施方案中，递送是编码药物的核酸，例如递送编码本发明分子的核酸。[0271]肠胃外给药包括例如静脉内、肌肉内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地，所述组合物经肠胃外施用。[0272]药学上可接受的载体或运载体可以是颗粒状的，因此组合物可以是例如片剂或粉末形式。术语“载体”是指稀释剂、佐剂或赋形剂，本发明的药物抗体缀合物与其一起施用。这样的药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素等。此外，还可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至动物时，本发明的异二聚体蛋白质或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当静脉内施用本发明的药物抗体缀合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，本技术的组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。[0273]药物组合物可以是液体形式，例如溶液、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于口服施用或用于通过注射、输注(例如，iv输注)或皮下递送。[0274]当打算用于口服施用时，组合物可以是固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式内。[0275]作为口服施用的固体组合物，该组合物可以制成粉剂、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊、口香糖、威化等形式。这种固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一种或多种：粘合剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂；和着色剂。当组合物为胶囊形式时(例如明胶胶囊)，除了上述类型的材料外，它还可以包含液体载体，例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。[0276]当打算用于口服施用时，组合物可以包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于注射施用的组合物中，还可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。[0277]组合物可以采用一个或多个剂量单位的形式。[0278]在特定的实施方案中，可能需要将组合物局部施用至需要治疗的区域，或通过静脉内注射或输注。[0279]在治疗特定疾病或病症中有效/有活性的本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物的量将取决于疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。此外，可以任选地使用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量也将取决于施用途径、疾病或疾病的严重程度，并且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。应考虑年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应灵敏度和疾病严重程度等因素。[0280]通常，该量为组合物重量的至少约0.01％的本发明的异二聚体蛋白质。当打算用于口服施用时，该量可以在组合物重量的约0.1％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以包含组合物的重量的约4％至约50％的本发明的异二聚体蛋白质。[0281]可以制备组合物使得肠胃外剂量单位含有约0.01％至约2％重量的本发明的异二聚体蛋白质。[0282]对于通过注射施用，组合物可通常包含约0.1mg/kg至约250mg/kg动物体重，优选约0.1mg/kg至约20mg/kg动物体重，和更优选约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。在一个实施方案中，所述组合物以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药时间表可以从例如每周一次到每2、3或4周一次变化。[0283]本发明还涉及如本文所述的异二聚体蛋白质例如抗体或其片段的治疗应用。[0284]如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制或减轻疾病或疾病。例如，治疗可以包括延迟与一种或多种疾病相关的症状的发展，和/或减轻将要或预期会与所述疾病一起发展的此类症状的严重程度。这些术语包括改善现有症状、预防其他症状以及改善或预防此类症状的根本原因。因此，这些术语表示有益结果被赋予至少一些正在接受治疗的哺乳动物，例如犬科患者。许多药物治疗对部分(但不是所有)接受治疗的患者有效。[0285]术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，合适地是伴侣动物，特别是犬科动物。[0286]本发明还涉及本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物用于治疗或预防疾病。[0287]另一方面，本发明涉及本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物在治疗或预防疾病中的用途。另一方面，本公开涉及本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物在制造用于治疗或预防本文所列疾病的药物中的用途。[0288]在一个实施方案中，异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段，结合治疗靶标。这可以是肿瘤相关抗原(taa)。肿瘤抗原可大致分为癌胚抗原(通常仅在胎儿组织和癌性体细胞中表达)、癌病毒抗原(由致瘤转化病毒编码)、过度表达/积累(在正常组织和肿瘤组织中均表达，表达水平在肿瘤中高度升高)、癌症-睾丸(仅由癌细胞和成人生殖组织如睾丸和胎盘表达)、谱系限制(主要由单一癌症组织型表达)、突变的(仅由基因突变或转录改变引起的癌症表达)、翻译后改变的(与肿瘤相关的糖基化改变等)或独特型(高度多态性基因，其中肿瘤细胞表达特定的“克隆型”，即如在b细胞中，由克隆异常引起的t细胞淋巴瘤/白血病)。[0289]在一个实施方案中，肿瘤相关抗原选自psma、her2、her3、cd123、cd19、cd20、cd22、cd23、cd74、bcma、cd30、cd33、cd52、egrf、cecam6、caxii、cd24、eta、mage、间皮素、cmet、tag72、muc1、muc16、steap、ephviii、fap、gd2、il-13ra2、l1-cam、psca、gpc3、gpa33、ca-125、神经节苷脂g(d2)、g(m2)和g(d3)、ep-cam、cea、铃蟾肽样肽、psa、her2/neu、表皮生长因子受体(egfr)、erbb2、erbb3、erbb4、cd44v6、ki-67、癌症相关粘蛋白、vegf、vegfr(例如，vegfr3)、雌激素受体、lewis-y抗原、tgfβ1、igf-1受体、egfα、c-kit受体、转铁蛋白受体、il-2r、tag-72和co17-1a。[0290]在又一个实施方案中，异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段，通过与其抗原结合来抑制肿瘤细胞生长和/或增殖。[0291]在一个实施方案中，异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段是免疫检查点分子的抑制剂。这可以选自pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、ceacam、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4或tgfrβ中的一种或多种的抑制剂。在另一个实施方案中，该抗体可以是共刺激分子的激活剂，该共刺激分子选自例如ox40、ox40l、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3或cd83配体、cd3、cd8、cd28、cd4或icam-1中的一种或多种的激动剂。[0292]在又一个实施方案中，异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段结合细胞因子，例如白细胞介素，如白细胞介素-17、白细胞介素-4、白细胞介素-13或白细胞介素-31，一种参与与特应性皮炎有关的瘙痒和炎症的关键细胞因子。[0293]在另一个实施方案中，靶标是肿瘤坏死因子(tnf)，例如tnfα。[0294]在另一个实施方案中，靶标是神经生长因子(ngf)和/或ngf受体，在治疗急性和慢性疼痛状态ngf中的治疗靶标。[0295]在一个实施方案中，靶标是用于免疫去势的gnrh。[0296]如本文所述的双特异性异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段，其结合选自上述靶标的两个不同靶标，例如免疫检查点分子和另一个靶标、taa和另一个靶标或细胞因子和另一个靶标。在一个实施方案中，异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段，结合两种不同的免疫检查点分子、两种不同的taa或一种taa和免疫检查点分子。[0297]可用本文所述的异二聚体蛋白质，例如抗体或其片段，或药物组合物治疗的疾病可以选自癌症、免疫疾病、神经系统疾病、炎性疾病、过敏反应、移植排斥、病毒感染、免疫缺陷、自身免疫性疾病和其他免疫系统相关疾病。[0298]在一个实施方案中，该蛋白质可用于治疗疼痛，例如通过靶向ngf。[0299]在一个实施方案中，治疗是免疫去势，例如通过靶向抗gnrh。[0300]癌症可以选自实体瘤或非实体瘤。例如，癌症可以选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌癌症、乳腺癌、脑癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿道癌、膀胱癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、胸腺瘤、前列腺癌、间皮瘤、肾上腺皮质癌、淋巴瘤，例如b细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、胃癌、白血病例如all、cll、aml、尿路上皮癌、白血病和多发性骨髓瘤。[0301]在一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。可以相应治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤，例如由猫白血病病毒(felv)引起的t细胞淋巴瘤。此类肿瘤的一些实例包括表皮肿瘤、鳞状肿瘤，例如头颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤，包括小细胞和非小细胞肺肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝脏肿瘤。其他实例包括cns、肿瘤、神经母细胞瘤、毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤、胃肠道和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤，优选多形性成胶质细胞瘤和平滑肌肉瘤。本发明的拮抗剂对其有效的血管化皮肤癌的例子包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和可以通过抑制恶性角质形成细胞如兽医恶性角质形成细胞的生长来治疗的皮肤癌。[0302]在一个实施方案中，肿瘤是非实体瘤。非实体瘤的例子包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。[0303]在一个实施方案中，癌症是局部晚期的不可切除的、转移的或复发的癌症。[0304]癌症包括使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症，包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。[0305]在一个实施方案中，为了治疗癌症，蛋白质可以靶向cd3。任选地，可以双特异性t细胞衔接器(bite)的形式提供蛋白质。[0306]在一个实施方案中，癌症在另一种治疗例如化学疗法后进展。[0307]在另一个实施方案中，疾病选自自身免疫性疾病、炎性病症、过敏反应和过敏性病症、超敏反应、严重感染和器官或组织移植排斥。所述疾病可选自以下非限制性列表：银屑病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化症、特发性炎性肌病、干燥综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾疾病、中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病，如多发性硬化症、特发性脱髓鞘性多发性神经病或格林巴利综合征，以及慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、肝胆疾病，如感染性、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎症性肠病、谷胶致敏性肠病和惠普尔病、自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹、肺部免疫性疾病如嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎、自身免疫性血液病(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少症)、自身免疫性炎症性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和肠易激综合征)、包括移植物排斥和移植物抗宿主病的移植相关疾病，或其任何兽医等同物。[0308]在一个实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物与现有疗法或治疗剂例如抗癌疗法联合使用。因此，在另一方面，本发明还涉及联合疗法，其包括施用本发明的异二聚体蛋白质或药物组合物和抗癌疗法。抗癌疗法可以包括治疗剂或放射疗法，并且包括基因疗法、病毒疗法、rna疗法、骨髓移植、纳米疗法、靶向抗癌疗法或溶瘤药物。其他治疗剂的实例包括其他检查点抑制剂、抗肿瘤剂、免疫原性剂、减毒的癌细胞、肿瘤抗原、抗原呈递细胞例如用肿瘤来源的抗原或核酸脉冲的树突细胞、免疫刺激细胞因子(例如，il-2、ifna2、gm-csf)、靶向小分子和生物分子(例如信号转导通路的成分，例如酪氨酸激酶调节剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的药物，包括egfr拮抗剂)，以及抗炎剂、细胞毒剂、放射毒剂或免疫抑制剂和用编码免疫刺激细胞因子(例如gm-csf)的基因转染的细胞，化学疗法。在一个实施方案中，异二聚体蛋白质与手术组合使用。[0309]在一个实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物与免疫调节剂、检查点调节剂、参与t细胞活化的试剂、肿瘤微环境调节剂(tme)或肿瘤特异性靶标一起施用。例如，免疫调节剂可以是选自pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla-4、tim-3、ceacam、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4或tgfrβ中的一种或多种的抑制剂的免疫检查点分子的抑制剂。在另一个实施方案中，该免疫调节剂可以是共刺激分子的激活剂，该共刺激分子选自ox40、ox40l、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3或cd83配体、cd3、cd8、cd28、cd4或icam-1中的一种或多种的激动剂。[0310]在本发明的具体实施方案中，异二聚体蛋白质或组合物与化学治疗剂或放射疗法同时施用。在另一个具体的实施方案中，化学治疗剂或放射疗法在本发明的组合物给药之前或之后给药，优选在施用本发明的组合物之前或之后至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月、更优选几个月(例如最多三个月)。[0311]在一些实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物可以与两种或更多种治疗剂一起施用。在一些实施方案中，异二聚体蛋白质或药物组合物可以与两种或更多种治疗剂一起施用。[0312]本文所述的异二聚体蛋白质或药物组合物可与其他疗法或治疗化合物或疗法同时或不同时间施用，例如同时、分别或顺序施用。[0313]另一方面，本发明提供了用于治疗或预防疾病、诊断、预后或监测疾病的试剂盒，其包含本发明的异二聚体蛋白质或药物组合物。这样的试剂盒可能包含其他成分、包装和/或说明书。[0314]该试剂盒可以包括如本文所述的标记的异二聚体蛋白质或药物组合物以及一种或多种用于检测标记的化合物。[0315]另一方面，本发明提供了本发明的如本文所述的以冻干形式包装或包装在水性介质中的异二聚体蛋白质或药物组合物。[0316]另一方面，本文所述的异二聚体蛋白质用于非治疗目的，例如诊断测试和测定。[0317]鉴于包括以下实验示例的本公开内容，本发明的其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。[0318]除非本文另有定义，与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然前述公开内容提供了包含在本发明范围内的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，但提供以下实施例以进一步使技术人员能够实践本发明的技术并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，本发明的范围应从本公开所附的权利要求及其等同物中理解。鉴于本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。[0319]本说明书中提到的所有文件均通过引用整体并入本文，包括对基因登录号的任何引用和对专利出版物的引用。englandbiolabs)进行组装以生成scfv-fc。随后将scfv-fc(或“scfv-okt3 fc-b”)和仅fc(或“fc-b”)重链分别克隆到哺乳动物表达载体petml5(潮霉素抗性)和petml6(杀稻瘟菌素抗性)中。petml5和petml6表达载体均由cag启动子和bgh-pa组成，以驱动克隆插入物的表达，该插入物在本例中为修饰的scfv-fc或fc。为了在细胞中进行选择，pgk-hph-pgk-pa盒存在于petml5载体中以赋予潮霉素抗性，而pgk-bsr-pgk-pa盒存在于petml6载体中以赋予杀稻瘟菌素抗性。表达和耐药盒的两侧都是piggybac反向末端重复序列(itr)，因此在与piggybac转座酶共转染后，两侧是piggybacitr的序列可以稳定地整合到哺乳动物宿主细胞中，在这种情况下，cho细胞。质粒载体骨架包含用于细菌选择和cole1细菌复制起点的氨苄青霉素抗性盒。重链和抗生素抗性基因表达单元的两侧是dna转座子piggybac末端反向重复序列，以在piggybac转座酶存在的情况下介导稳定整合到宿主细胞中。[0333]随后使用liuh和naismithj(bmcbiotechnology2008,8:91)描述的方法通过定点诱变生成一系列突变，如表1和2所示。所有突变均通过sanger测序验证。kih突变被引入人类igg4pe(图1)作为对照。[0334]实施例3嵌合抗体的制备[0335]cho-s细胞在补充了l-谷氨酰胺和抗结块剂(thermofisherscientific)的freestylef17cho表达培养基中悬浮培养在锥形摇瓶中。悬浮细胞在加湿培养箱中培养，37℃，含8％co2，转速为150rpm。使用peimax将两个含有异二聚体重链对的质粒dna与含有piggybac转座酶的质粒共转染到cho-s细胞中，dna与peimax的比例为1ugdna对3ulpeimax，浓度为1mg/ml每1x106cho细胞。如图所示测试不同比例的scfv-fc和fc构建体。转染后24小时使用潮霉素和杀稻瘟菌素选择稳定整合。6-8天药物选择后，细胞在生产前在非选择性培养基中回收。对于生产，每1ml培养基接种2x106个cho细胞，温度为32℃，8％co2，150rpm振荡。每3天用l-葡萄糖、cellboost7a和cellboost7b喂养细胞。在生产期间监测细胞活力为至少超过70％，并在第12天收集上清液用于蛋白a纯化。[0336]实施例4异二聚化评估[0337]为了评估用于转染的两条嵌合重链的最佳比例，将编码具有工程化kih突变的人igg4pefc或scfv-fc的质粒(fc-杵和scfv-臼)以1:0、6:1、3:1、1:1、1:3、1:6、0:1的比例转染到cho-s细胞中。使用具有相同转染率的无kih突变的人igg4pescfv-fc和fc链作为对照。蛋白a纯化的scfv-fc和fc组装通过非还原sds凝胶电泳进行评估。1:1的比例产生最多的异二聚体和最少的单体污染物(图4)。[0338]为了测试所有选定的狗igg-dscfv-fc和fc重链对(表1)，含有两条链的dna质粒以1:1的比例转染，并按照所述选择稳定整合。使用非还原sds凝胶电泳检查蛋白a纯化的scfv-fc和fc组装。通过离子交换色谱分析异二聚体和同二聚体的比例。还检查了热稳定性和聚集。[0339]为了测试所有选定的狗igg-bfc和scfv-fc链对(表2)，含有两条链的dna质粒以1:1、1:3或1:6的比例转染，并按所述选择稳定整合。使用uv光谱法(nanodrop1000，thermofisherscientific)对蛋白a纯化的同源/异源scfv-fc和fc组装进行量化，归一化为0.25mg/ml，2.5ug总蛋白已加载到非还原sds凝胶电泳和hplc尺寸排阻色谱(hsec)上。异二聚体将在sds-page和hsec中以不同方式迁移或洗脱，并进行量化并与wt分子进行比较。“fc-b”mw为28kda，因此形成同二聚体～56kda；“scfv-okt3 fc-b”为55kda，因此形成同二聚体～110kda；“fc-b:scfv-okt3-fc-b”异二聚体为～83kda。图4显示了同二聚体和异二聚体形成的示意图。[0340]使用instantblue(考马斯蛋白染色剂(isb1l)(ab119211))标准方案对sds-page进行染色。imagej软件(https://imagej.nih.gov/ij/)用于通过密度测定法量化sds-page条带。简而言之，生成每个泳道的矩形选择，并使用已实施的imagej插件合并条带的峰值。绘制了每个峰(同二聚体/异二聚体)下的面积。[0341]hplc-sec色谱法(柱：bioresolvesecmab200a，2.5um柱，waterscorporation)使用acquityh-classbio(waterscorporation)进行，使用pbs作为流动相，等度0.575ml/min流速。测试样品以20000g离心5'(使用标准台式离心机)以去除任何沉淀物。empower软件用于对检测到的每个色谱峰进行积分。确定每个分子的异二聚体种类百分比和面积(表示抗体浓度)并与wt分子进行比较。[0342]1:1scfv-fc:fcdna比例的sds-page分析结果(图7、8和9；使用表2中所示的突变)表明，与wtiggb序列相比，许多突变体改善了异二聚体形成。在一些组合中，一条或甚至两条链的表达较低或不存在，表明引入的突变可能影响了多肽链的表达、稳定性和/或折叠。还值得注意的是，除了增加异二聚体的百分比外，许多组合还显示具有对应于异二聚体的mw的单个条带，这与在wtiggb序列中看到的至少3个条带形成对比。这可能表明由这些突变诱导的更稳定的构象。此外，单体fc的存在(在28kda附近迁移，即在突变体id23和26中观察到)也表明同源二聚体排斥，这在临床产品的大规模生产中的进一步纯化步骤中可能是有帮助的。[0343]图10显示了这些表达蛋白的异二聚体百分比的光密度分析(突变如表2所示)。[0344]基于1:1scfv-fc:fcdna比例sds-page结果，另外两组转染使用1:3和1:6scfv-fc:fcdna比例在cho-s细胞系中对选定的候选者进行(id4、11、12、13、16、17、22、23、24、25、26、28和29)。1:3转染比例的结果如图11、12和13所示；1:6转染比例的结果如图14、15和16所示。使用如表2中所示的突变。[0345]在这些条件下，与wt(iggb)对照相比，突变体还显示出异二聚体的增加，并且对于单个异二聚体带和单体fc的存在显示出相似的表型。[0346]图17a显示了通过hsec分析测量的异二聚体峰的保留时间。图17b显示异二聚体峰的hplcsec量化，显示为占总蛋白质的百分比。这显示了与sds-page量化相似的结果，几乎所有突变体都增加了异二聚体的百分比。图17c显示异二聚体峰的hplcsec量化，显示为总面积。除id17、22和29外，所有突变体均显示异二聚体峰百分比增加。除了突变id(组合)12、13、16和17显示不太稳定的异二聚体和24、25显示稳定性增加之外，所有突变都显示出与wt对照相似的稳定性。[0347]从使用1:3scfv-fc:fcdna比例实验的实验中获得的数据生成了汇总表(图18)。[0348]使用离子交换色谱法(h-scx(强阳离子交换))进行进一步的分析方法以评估异二聚体的百分比。这种方法允许根据分子的电荷分离分子，在标准igg形式中测试这些突变的影响时特别有用，在这种情况下，分子量对于区分异二聚体鉴定/分离不太有用。例如，这可用于指导双特异性抗体制造过程中的纯化步骤。[0349]igg形式的异二聚体稳定性也可以通过使用温度和ph值作为压力因素进行加速稳定性测试来评估。然后使用hsec和hscx来鉴定和量化聚集/断裂倾向以及蛋白质变体的存在，以便选择最稳定的组合。[0350][0351]表1异二聚体形成的电荷对突变总结。[0352][0353]表2异二聚体形成的电荷对突变总结(与iggb相关的编号)。当前第1页12当前第1页12