一种南极磷虾肽-多酚复合物及其应用

1.本发明涉及一种南极磷虾肽-多酚复合物，属于生物技术/食品技术领域。


背景技术：

2.随着生活方式和饮食结构的不规律变化，糖尿病(dm)的患病率日益增加，是继癌症和心血管疾病之后的第三大常见慢性非传染性疾病，已严重威胁人类健康。这给患者本人、家庭及社会带来了沉重的负担。而目前治疗糖尿病的药物存在副作用，开发天然、安全且具有药用价值的天然降血糖物质具有现实意义。
3.研究发现有许多天然的抗糖尿病有效成分，譬如：银杏叶提取物、植物多糖等。生物活性多肽的降血糖方面的研究较少。活性肽与蛋白质相比，具有良好的理化性质和加工性能以及重要的生理功能，如提供人体生长发育所需的营养，促进矿物质的吸收，调节神经系统，抗氧化、降血糖、降血压、降血脂、降胆固醇、护肝、抗菌等作用。因而成为国内外研究的重点。
4.多酚也被证实为一类具有降血糖活性的天然物质，研究表明多酚与其他活性物质复配，可实现多靶点、多作用机制的优势，同时复合物通过协调效应呈现出功能活性的增强及延缓耐药性。
5.人体中淀粉等糖类物质的消化吸收，需要依赖α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶这两种关键酶。因此，抑制这两种关键酶的活性便能减缓碳水化合物降解为单糖的速度，以达到调控餐后血糖升高过快的目的；在肠中高表达，会分解蛋白glp-1，此蛋白(刺激胰岛素、抑制升糖素、抑制胃排空、让胰岛细胞重生)具有降低血糖的效果。使dpp-4失活从而不分解glp-1是治疗糖尿病的主攻方向之一。
6.南极磷虾肽-多酚复合物通过抑制α-葡萄糖苷酶与、α-淀粉酶和dpp
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，实现多种机制对血糖的控制，是一种具有较高经济价值和市场前景的降血糖复合物。
7.已有的一些研究表明，生物活性肽能有效改善糖尿病的作用。例如，在王军波等的研究中，海洋胶原肽能够缓解高胰岛素血症大鼠的胰岛β细胞的结构损伤，增加颗粒的分泌，减少脂滴的形成，显著提高胰岛素的生物学活性；显著降低的空腹胰岛素水平，对空腹血糖和口服葡萄糖耐量也有一定的改善作用。在黄凤杰等的研究中，鲨鱼肝活性肽s-8300有抗氧化作用，通过清除自由基保护胰岛β细胞，调节糖脂代谢，延缓胰岛β细胞的衰竭，在一定程度上能够治疗糖尿病。
8.李明玺证实余甘子提取物能通过升高glut-2和pparγ的表达和抑制相关炎症通路发挥降血糖作用,该提取物通过分离鉴定主要活性成分为多酚； huang等研究发现在口服葡萄糖耐受试验中，多酚极大缓解了高果糖饮食 (hfd)诱导糖尿病小鼠的高血糖症状。
9.李星亚等在细胞水平和动物水平都证实了茶多糖与茶多酚以一定比例复配对sd糖尿病大鼠有很好的协同防治作用，配比组tp/tps＝5(茶多酚/茶多糖＝5)在辅助降低dm大鼠血糖方面效果明显。王林戈采用放射免疫法等方法检测绿茶茶多糖与茶多酚组合对min6细胞的胰岛素分泌功能等的影响，研究表明其降血糖机制与线粒体功能密切相关。通
过清除ros、保护dna和线粒体功能、升高atp水平等来减轻细胞的氧化应激损伤，同时抑制caspase－3活性抗细胞凋亡等途径，从而实现对min6细胞的保护效果。多酚类化合物与其他活性物质协同降糖机理是通过抑制糖尿病关键酶来实现的。
10.目前大部分活性肽只作为独立成分实现降血糖效果，在已有技术中有关多酚与活性肽复合物实现降血糖效果增效的研究也较为罕见，而关于多肽
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多酚的复配物在调节血糖方面发挥协同效果的研究也未见报道。


技术实现要素：

11.本发明所要解决的技术问题在于：提供一种南极磷虾肽-多酚复合物及其应用，以提高活性肽的生物利用率，实现南极磷虾肽/多酚通过多种机制调节血糖方面的增成效果。
12.本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
13.一种南极磷虾肽-多酚复合物，该南极磷虾肽-多酚复合物是将南极磷虾肽、多酚在ph6.5-7条件下混合溶解，经搅拌、静置而制得。
14.南极磷虾肽、多酚的重量比为10:0.1-5，优选为10：0.25-2，更优选为10：0.5-2。在本发明的一个优选方案中，比例为10：1。
15.优选的，所述南极磷虾肽的氨基酸序列为fagdadapr。
16.优选的，将南极磷虾肽、多酚溶解于ph6.5-7的磷酸盐缓冲液中。
17.优选的，所述南极磷虾肽的制备方法,包括以下步骤：
18.s1.制备南极磷虾酶解液：脱脂南极磷虾粉与酸性磷酸盐缓冲液混合，加入酶解液，酶解后灭酶，得南极磷虾酶解液；
19.s2.南极磷虾肽的分离和纯化：冷却后的南极磷虾酶解液离心后取上清液，经抽滤和超滤得到滤液。
20.优选的，在s2完成抽滤和超滤后的滤液经过浓缩干燥，得到南极磷虾肽。
21.更进一步的，干燥时间为1-2d。
22.优选的，在s1中，所述磷酸盐缓冲液的ph为6.5-7，脱脂南极磷虾粉与磷酸盐缓冲液的料液比为1g:4-10ml，50-60℃下酶解3-5h；酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶，以脱脂南极磷虾粉的重量计，其用量分别为1％、1％、1％和0.3％，灭酶温度为100℃，灭酶时间为8-10min。
23.优选的，混合溶液经过干燥获得南极磷虾肽-多酚复合物干粉。
24.更进一步的，干燥时间为1-2d。
25.优选的，所述多酚为没食子酸。
26.以上所述的南极磷虾肽-多酚复合物在制备治疗糖尿病的药物或者降血糖药物方面的应用。
27.以上所述的南极磷虾肽-多酚复合物在制备抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶或dpp
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的药物方面的应用。
28.优选的，在s2中，离心机转数为8000-12000r/min，离心机的离心温度为3-5℃，抽滤采用0.45-0.5μm膜，超滤采用3k分子量的膜，纯化南极磷虾活性肽溶液的分子量在≤3000da以下。
29.本发明的有益效果是：本发明将高浓度的南极磷虾降血糖肽与低浓度多酚进行复
合物，通过感官认知认为掩盖了活性肽的不良气味，又实现了两种活性物质在降血糖效果方面的增效，其复合物对α-葡萄糖苷酶与、α-淀粉酶和dpp
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的抑制效果均优于单一的活性多肽/多酚，说明复合物联合产生的协同效应使复合物功能活性增强，同时实验结果表明复合物还起到了延缓耐药性的效果。
附图说明
30.图1为本发明肽与不同比例多酚在磷酸盐缓冲液中的紫外图谱；
31.图2为实施例2中的复合物对α-淀粉酶的抑制率图；
32.图3为实施例3中的复合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率图；
33.图4为实施例4中的复合物对dpp
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的抑制率图；
34.图5为本发明中的南极磷虾肽傅里叶红外光谱；
35.图6为本发明中的南极磷虾肽/多酚复合物红外光谱；
具体实施方式
36.为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
37.实施例1
38.按重量比为10:1将南极磷虾肽、没食子酸在ph6.8磷酸缓冲液中混合溶解，经搅拌、静置而制得南极磷虾肽-没食子酸复合物。南极磷虾肽氨基酸序列为fagdadapr。
39.所述南极磷虾肽的制备方法,包括以下步骤：
40.s1.制备南极磷虾酶解液：脱脂南极磷虾粉20g与200ml的ph＝6.8磷酸盐缓冲液混合，以脱脂南极磷虾粉的重量计，分别为1％的中性蛋白酶、1％的碱性蛋白酶、1％的胰蛋白酶和0.3％的脂肪酶所组成的酶解液，酶解时间为 3h,灭酶温度为100℃，灭酶时间为8min，酶解后灭酶，得南极磷虾酶解液；
41.s2.南极磷虾肽的分离和纯化：冷却后的南极磷虾酶解液，经10000 r/min，4℃的离心后取上清液，采用0.45μm膜进行抽滤，采用3k分子量的膜进行超滤得到滤液，所得滤液的分子量在≤3000da以下。
42.在s2完成抽滤和超滤后的滤液经过浓缩干燥1.5d，得到南极磷虾肽。其氨基酸序列为fagdadapr。
43.混合溶液经过干燥2d获得南极磷虾肽-没食子酸复合物干粉。
44.用ph＝6.8磷酸盐缓冲液配制10mg/ml南极磷虾肽，5mg/ml没食子酸，试管1-10分别添加南极磷虾肽5ml，没食子酸0、0.125、0.25、0.375、0.5、 0.625、0.75、0.875、1、1.125ml，定容至10ml,30℃磁力搅拌5min，检测其紫外吸光度。
45.如图1所示，在没食子酸浓度在0-0.25mg/ml时，其λ＝260nm时，吸光度增长速度加快，在0.25-0.5mg/ml时，其λ＝260nm时，吸光度增长速度缓慢，在0.5mg/ml时，其λ＝260nm时，吸光度增长速度趋于平稳。
46.从图5-图6可知，南极磷虾肽与没食子酸之间发生了化学作用，有化学键的形成，说明复合物联合产生的协同效应使复合物功能活性增强。
47.实施例2对α-淀粉酶的抑制作用
48.(一)实验方法
49.步骤1：抑制剂的制备
50.用ph6.8磷酸盐缓冲液配制10mg/ml南极磷虾肽，5mg/ml没食子酸，试管1、2、3、4、5分别添加南极磷虾肽5ml，没食子酸0、0.25、0.5、0.75、 1ml，定容至10ml,30℃磁力搅拌5min；
51.步骤2:淀粉溶液的配制
52.1g可溶性淀粉溶于100ml蒸馏水制备淀粉溶液；
53.步骤3:对α-淀粉酶抑制效果的测定
54.各试管加入3mlα-淀粉酶(活性单位100u，0.5g定容至50ml)，在37 ℃水浴5min，再加入4mlα-淀粉溶液，37℃水浴保温，每隔15分钟取混合物2ml，加入dns试剂1ml，混合液沸水5min，冷却至室温，蒸馏水定容到 10ml，在540nm测量吸光度，持续1h。
55.磷酸盐缓冲液替代抑制剂(a1)及磷酸盐缓冲液替代α-淀粉酶做空白对照物(a2)；磷酸盐缓冲溶液替代α-淀粉酶做背景对照(a4)；以磷酸盐缓冲液替代抑制剂做空白组(a1)，五种不同复配比例的抑制剂为实验组 (a3)。
[0056][0057][0058]
检测结果如附图2所示。
[0059]
实施例3：对α-葡萄糖苷酶的抑制检测方法
[0060]
步骤1：抑制剂的制备；
[0061]
用6.8磷酸缓冲液配制10mg/ml南极磷虾肽，5mg/ml没食子酸，试管1、2、3、4、5分别添加南极磷虾肽5ml，没食子酸0、0.25、0.5、0.75、1ml，定容至10ml；30℃磁力搅拌5min；
[0062]
步骤2:对α-葡萄糖苷酶抑制效果的测定
[0063]
200ul样品提取液和200ul、0.02mg/mlα-葡萄糖昔酶(33u/mg)(溶于0.01mol/l、ph 6.8磷酸钠缓冲溶液)37℃反应15min,再加入200ul, 2.5mmol/l对硝基苯基-α-d-毗喃葡萄糖(pnpg)溶液，37℃反应10min 后，加入5ml 0.10mol/l na2co3溶液终止反应，在400nm处测定吸光度 a，空白用缓冲液代样品，对照用磷酸缓冲液代替酶。
[0064][0065]
检测结果如附图3所示。
[0066]
实施例4对dpp
‑ⅳ
的抑制检测方法
[0067]
步骤1：抑制剂的制备
[0068]
用ph6.8磷酸缓冲液配制10mg/ml南极磷虾肽，5mg/ml没食子酸，试管 1、2、3、4分别添加南极磷虾肽5ml，没食子酸0、0.5、0.75、1ml，定容至10ml，30℃磁力搅拌5min；
[0069]
步骤2:对dpp-iv抑制效果的测定
[0070]
采用试剂盒法(荧光法)对dpp-iv抑制率进行测定，以西格列汀为阳性对照；
[0071]
依次将50μl抑制剂(1、2、3、4)，10μl抑制剂加入酶标板混匀，37℃孵育10min，后加入25μl底物，37℃再孵育15min，荧光检测(激发波长360nm，发射波长460nm)。记录结果，按如下计算公式得出dpp-iv抑制肽的抑制率
[0072][0073]
式中：f对照—不含抑制剂；f样品—含有样品或抑制剂
[0074]
检测结果如附图4所示。
[0075]
综合附图2到附图4可知，南极磷虾肽(5mg/ml)/没食子酸(0.5mg/ml) 复合物对葡萄糖苷酶的抑制率为54.73％、对淀粉酶的抑制率为51.16％、对 dpp-iv抑制率为58.43％。
[0076]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。