一种糙米葛根发酵液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及活性原料制备技术领域，具体涉及一种糙米葛根发酵液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.现代医学认为，皮肤的颜色主要是由皮肤内色素的含量及分布决定的，包括黑素、胡萝卜素等，其中黑素是最主要的决定因素。皮肤中的黑素细胞位于表皮最深处的基底层，并分散在基底细胞之间，黑素细胞通过生化反应产生黑素。
3.目前黑素排泄途径主要有两条：(1)由内排出——黑素在皮肤内分解后再在真皮层被吞噬，最后经循环系统、泌尿系统排出；(2)向外排出——黑素随表皮细胞上行至角质层，最后老化的角质细胞脱落而排出体外，这个周期通常需要28天，称为表皮更替时间。如果受到机体内外环境条件的影响，如内分泌失调、紫外线照射等，使皮肤黑素过速增长或者分布不匀，则会产生局部皮肤色素沉积的现象。
4.现今人们所追求化妆品的美白功效，多是通过抑制黑色素形成或促进黑色素排出而实现，其中酪氨酸酶在黑色素形成中起关键作用。现今常见的皮肤美白剂有：熊果苷、维生素c、花青素等，原理为抑制黑色素形成；烟酰胺、绿茶提取物等用于阻断黑色素转运；果酸、溶角酶蛋白等，用于剥落角质促进表皮新陈代谢。
5.1956年harman d.提出的衰老自由基学说中认为衰老是自由基对细胞成分进攻造成的结果。通常机体会不断产生内源性抗自由基的活性物质清除自由基，使细胞和组织免受损害。随着年龄增长、机体内部环境变化或外部环境异常，体内抗自由基系统的平衡被破坏，就会使得自由基增加，从而导致皮肤细胞的损伤，使皮肤产生老化的各种色素物质(老年斑)。同时，自由基及过氧化作用使胶原表面形成age(终末糖化产物)而过度交联，使得皮肤半桥粒结构失去弹性，表皮-真皮连接变平，皮肤变得松弛、失去弹性。综上，可通过清除自由基的方法缓解老年斑的形成与皮肤衰老带来的松弛。
6.稻，通称为水稻，是稻属谷类作物，对稻谷加工程度的不同可将大米分为糙米和精白米等不同类型。稻谷粒仅去掉颖壳后称为糙米，包含米糠层、胚芽及胚乳；糙米研磨后除去米糠层和胚芽,剩下胚乳部分即为精白米。目前，将大米作为原料制作的美容护肤产品有很多，多见使用酵母菌发酵后的产物滤液生产，如sk
‑ⅱ
护肤精华露、pdc酒粕面膜；但有部分人存在对酒精过敏的情况，故而需避免使用该类化妆品。
7.现有技术采用纯大米发酵液虽然具有一定的美白功效，但不同方法发酵得到的发酵液其美白功效差别是很大的，有待进一步提高；同时，现有方法制备得到的大米发酵液其抗氧化功效也较低，同样有待进一步提高。


技术实现要素：

8.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种糙米葛根发酵液的制备方法；由该方法制备得到的糙米葛根发酵液具有较好的美白作用；同时还
具有较好的抗氧化作用。
9.本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
10.一种糙米葛根发酵液的制备方法，其包含如下步骤：
11.s11.取糙米粉和葛根粉混合，然后加入水，搅拌均匀得混合料液；
12.s12.将混合料液进行加热反应，加热结束后进行冷却，接着接种发酵菌液，得发酵原料混合物；
13.s13.将发酵原料混合物进行发酵，发酵结束后进行固液分离，取液体即得所述的糙米葛根发酵液。
14.本发明在研究中发现，以糙米粉和葛根粉为原料，采用本发明所述方法发酵得到的糙米葛根发酵液，与单单采用糙米粉为原料，采用本发明所述方法制备得到的糙米葛根发酵液相比，其不仅具有较好的美白作用，同时其抗氧化作用得到了大幅的提高。
15.优选地，步骤s11中糙米粉和葛根粉的重量比为1:0.2～1。
16.进一步优选地，步骤s11中糙米粉和葛根粉的重量比为1:0.4～0.6。
17.最优选地，步骤s11中糙米粉和葛根粉的重量比为1:0.4。
18.优选地，步骤s11中糙米粉和葛根粉的总重量与水的重量比为1:4～16。
19.进一步优选地，步骤s11中糙米粉和葛根粉的总重量与水的重量比为1:8～12。
20.最优选地，步骤s11中糙米粉和葛根粉的总重量与水的重量比为1:8。
21.优选地，步骤s12中所述的加热是指在80～100℃下加热20～40min；所述的冷却是指冷却至30～40℃；
22.最优选地，步骤s12中所述的加热是指在90℃下加热30min；所述的冷却是指冷却至40℃。
23.优选地，步骤s12中所述的发酵菌液的接种体积为混合料液体积的3～5％。
24.最优选地，步骤s12中所述的发酵菌液的接种体积为混合料液体积的4％。
25.优选地，步骤s12中所述的发酵菌液为植物乳杆菌发酵菌液，其中植物乳杆菌的浓度为1x107～108cfu/ml。
26.优选地，步骤s13中的发酵是指在25～35℃下发酵12～24h。
27.最优选地，步骤s13中的发酵是指在30℃下发酵16h。
28.优选地，在步骤s13的发酵过程中加入葛根提取物。
29.发明人进一步研究中惊奇地发现，在本发明发酵过程中加入葛根提取物，可以进一步提升制备得的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用。
30.优选地，步骤s13中先将发酵原料混合物在25～35℃下发酵6～12h，接着加入葛根提取物，然后在25～35℃下继续发酵6～12h。
31.最优选地，步骤s13中先将发酵原料混合物在30℃下发酵8h，接着加入葛根提取物，然后在30℃下继续发酵8h。
32.发明人在研究中还发现，在发酵过程中，葛根提取物的加入时机不同，制备得到的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用的提升幅度是不同的；先将发酵原料混合物在25～35℃下发酵6～12h，接着加入葛根提取物，然后在25～35℃下继续发酵6～12h制备得到的糙米葛根发酵液，其美白作用以及抗氧化作用的提高幅度是最大的。
33.优选地，葛根提取物加入量与发酵原料混合物的用量比为3～6g：100ml。
34.最优选地，葛根提取物加入量与发酵原料混合物的用量比为5g：100ml。
35.优选地，所述的葛根提取物通过如下方法制备得到：取葛根粉，加入有机溶剂进行加热回流提取物得提取物液，将提取物液浓缩干燥后即得所述的葛根提物。
36.优选地，葛根粉与有机溶剂的重量体积比为1:5～10；
37.最优选地，葛根粉与有机溶剂的重量体积比为1:8。
38.优选地，所述的有机溶剂由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂；其中甲醇和乙酸乙酯的体积比为3～5:1。
39.发明人在研究中发现，在发酵过程中，加入采用不同有机溶剂提取得到的葛根提取物制备得到的糙米葛根发酵液，其对美白作用以及抗氧化作用的提升幅度大小差别是巨大的。发明人在研究中惊奇的发现：在发酵过程中，加入采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的葛根提取物制备得到的糙米葛根发酵液，其对美白作用以及抗氧化作用的提升幅度远远高于采用其它溶剂或其它溶剂的组合制备得到的糙米葛根发酵液。在发酵过程中，加入采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的葛根提取物制备得到的糙米葛根发酵液，其具有十分优异的美白作用以及抗氧化作用。
40.最优选地，甲醇和乙酸乙酯的体积比为4:1。
41.优选地，所述的加热回流提取是指在55～60℃下进行，提取时间为1.5～3h。
42.最优选地，所述的加热回流提取是指在60℃下进行，提取时间为2h。
43.本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的糙米葛根发酵液。
44.优选地，所述的糙米葛根发酵液在制备具有美白和/或抗氧化作用的产品中的应用。
45.优选地，所述的产品为化妆品、护肤品或药物。
46.有益效果：本发明提供了一种全新方法制备得到的糙米葛根发酵液；研究表明，以糙米粉和葛根粉为原料，采用本发明所述方法发酵得到的糙米葛根发酵液；与单单采用糙米粉为原料，采用本发明所述方法制备得到的糙米发酵液相比，其不仅具有较好的美白作用，同时其抗氧化作用得到了大幅的提高。进一步地，在本发明发酵过程中加入葛根提取物，可以进一步提升制备得的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用。尤其是，在本发明发酵过程中，加入采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的葛根提取物，可以进一步大幅提升制备得的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用，使得制备得到的糙米葛根发酵液具有十分优异的美白作用以及抗氧化作用。由于采用本发明所述方法制备得到的糙米葛根发酵液具有美白作用以及抗氧化作用；因此，将其作为有效成分用于制备具有美白作用和/或抗氧化作用的化妆品、护肤品或药物具有重要的应用价值。
具体实施方式
47.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
48.实施例1糙米葛根发酵液的制备
49.s11.取重量比为1:0.4的糙米粉和葛根粉混合，然后加入糙米粉和葛根粉总重量8倍重量的去离子水，搅拌均匀得混合料液；
50.s12.将混合料液在90℃下加热30min，加热结束后冷却至40℃，接着接种混合料液
体积4％的浓度为1x107cfu/ml的植物乳杆菌发酵菌液(植物乳杆菌gim1.191)，得发酵原料混合物；
51.s13.将发酵原料混合物在30℃下发酵16h，发酵结束后进行固液分离，取液体即得所述的糙米葛根发酵液。
52.实施例2糙米葛根发酵液的制备
53.s11.取重量比为1:0.4的糙米粉和葛根粉混合，然后加入糙米粉和葛根粉总重量8倍重量的去离子水，搅拌均匀得混合料液；
54.s12.将混合料液在90℃下加热30min，加热结束后冷却至40℃，接着接种混合料液体积4％的浓度为1x107cfu/ml的植物乳杆菌发酵菌液(植物乳杆菌gim1.191)，得发酵原料混合物；
55.s13.先将发酵原料混合物在30℃下发酵8h，接着加入葛根提取物，然后在30℃下继续发酵8h，发酵结束后进行固液分离，取液体即得所述的糙米葛根发酵液；
56.其中，葛根提取物加入量与发酵原料混合物的用量比为5g：100ml；
57.所述的葛根提取物通过如下方法制备得到：取葛根粉，加入8倍重量的体积比为4:1的甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂在60℃下进行加热回流提取2h得提取物液，将提取物液浓缩干燥后得所述的葛根提物。
58.实施例3
59.实施例3与实施例2的不同之处在于加入的葛根提物不同，其它的均相同。
60.所述的葛根提取物通过如下方法制备得到：取葛根粉，加入8倍重量的体积分数为95％的乙醇在60℃下进行加热回流提取2h得提取物液，将提取物液浓缩干燥后得所述的葛根提物。
61.实施例4
62.实施例4与实施例2的不同之处在于加入的葛根提物不同，其它的均相同。
63.所述的葛根提取物通过如下方法制备得到：取葛根粉，加入8倍重量的水在60℃下进行加热回流提取2h得提取物液，将提取物液浓缩干燥后得所述的葛根提物。
64.实施例5
65.实施例5与实施例2的不同之处在于加入的葛根提物不同，其它的均相同。
66.所述的葛根提取物通过如下方法制备得到：取葛根粉，加入8倍重量的甲醇在60℃下进行加热回流提取2h得提取物液，将提取物液浓缩干燥后得所述的葛根提物。
67.实施例6糙米葛根发酵液的制备
68.实施例6与实施例2的不同之处在于加入的葛根提物不同，其它的均相同。
69.所述的葛根提取物通过如下方法制备得到：取葛根粉，加入8倍重量的体积比为4:1的甲醇和丙酮组成的混合有机溶剂在60℃下进行加热回流提取2h得提取物液，将提取物液浓缩干燥后得所述的葛根提物。
70.对比例1糙米葛根发酵液的制备
71.s11.取重量比为1:0.4的糙米粉和葛根粉混合，然后加入糙米粉和葛根粉总重量8倍重量的去离子水，搅拌均匀得混合料液；
72.s12.将混合料液在90℃下加热30min，加热结束后冷却至40℃，接着接种混合料液体积4％的浓度为1x107cfu/ml的植物乳杆菌发酵菌液(植物乳杆菌gim1.191)，得发酵原料
混合物；
73.s13.在发酵原料混合物中加入葛根提取物，接着在30℃下发酵16h，发酵结束液体即得所述的糙米葛根发酵液；
74.其中，葛根提取物加入量与发酵原料混合物的用量比为5g：100ml；
75.葛根提取物的制备方法同实施例2。
76.对比例1与实施例2的区别在于，是在发酵前加入葛根提取物，而不是在发酵过程中加入葛根提取物。
77.对比例2糙米葛根发酵液的制备
78.s11.取重量比为1:0.4的糙米粉和葛根粉混合，然后加入糙米粉和葛根粉总重量8倍重量的去离子水，搅拌均匀得混合料液；
79.s12.将混合料液在90℃下加热30min，加热结束后冷却至40℃，接着接种混合料液体积4％的浓度为1x107cfu/ml的植物乳杆菌发酵菌液(植物乳杆菌gim1.191)，得发酵原料混合物；
80.s13.将发酵原料混合物在30℃下发酵16h，发酵结束后进行固液分离，取液体，加入葛根提取物混合均匀后即得所述的糙米葛根发酵液；
81.其中，葛根提取物加入量与发酵原料混合物的用量比为5g：100ml；
82.葛根提取物的制备方法同实施例2。
83.对比例2与实施例2的区别在于，在发酵结束后加入葛根提取物，而不是在发酵过程中加入葛根提取物。
84.对比例3糙米发酵液的制备
85.s11.取糙米粉，然后加入糙米粉8倍重量的去离子水，搅拌均匀得混合料液；
86.s12.将混合料液在90℃下加热30min，加热结束后冷却至40℃，接着接种混合料液体积4％的浓度为1x107cfu/ml的植物乳杆菌发酵菌液(植物乳杆菌gim1.191)，得发酵原料混合物；
87.s13.将发酵原料混合物在30℃下发酵16h，发酵结束后进行固液分离，取液体即得所述的糙米发酵液。
88.实验例
89.采用如下方法测试实施例1～6以及对比例1～2制备得到的糙米葛根发酵液和对比例3制备得到的糙米发酵液的美白作用以及抗氧化作用；测试结果见表1。
90.(1)斑马鱼胚胎法测定化妆品美白功效
91.1.1试验斑马鱼胚胎的处理
92.试验选用广东药科大学提供的ab系斑马鱼，挑选9hpf(受精后小时数的英文缩写，即“hours post-fertilization”)的健康斑马鱼胚胎随机置于6孔细胞培养板(50枚/孔)，每孔加入5ml试验溶液。设立对照组和样品组，每组3个重复，于28℃生化培养箱中孵育。正式试验前需先进行斑马鱼胚胎对样品溶液最大耐受浓度试验，即将样品溶液稀释不同倍数，至斑马鱼胚胎死亡率不超过10％。根据广州奥蓓斯化妆品有限公司评测部门试验经验，斑马鱼胚胎对于一般化妆品的最大耐受浓度为3.2mg/ml。斑马鱼胚胎在试验溶液中暴露72hpf后，用显微镜观察斑马鱼色素沉着情况并拍照记录。在每个孔中随机挑选20条幼鱼于培养皿中用pbs冲洗两遍，并将幼鱼转移到1.5ml离心管中，加入150μl脱氧胆酸钠溶液
(5mg/ml)，并在低温下超声制备成匀浆液。
93.1.2斑马鱼酪氨酸酶活力的测定
94.将匀浆液在4℃的条件下以10000r/min的速度离心5min，取上100μl上清液置于96孔板中，同时加入100μl左旋多巴溶液(5μmol/ml)，于37℃恒温生化箱中孵育1h。使用酶标仪检测各实验组od
475
的吸光值。
95.酪氨酸酶活性抑制率按下列公式计算：
[0096][0097]
1.3斑马鱼黑色素含量的测定
[0098]
除去ep离心管中的上清液，向管内沉淀物中加入150μl naoh溶液(1mol/l)，在80℃水浴锅中水浴加热10min，并震动使ep管中黑色素充分溶解。取100μl溶液置于96孔板中，用酶标仪检测各实验组od
405
的吸光值。
[0099]
样品对黑色素生成的抑制率按下列公式计算：
[0100][0101]
(2)糙米-葛根发酵液抗氧化性试验
[0102]
本次试验通过测定发酵液的超氧阴离子自由基清除率和dpph自由基清除率来检测样品的抗氧化性。
[0103]
2.1糙米-葛根发酵液超氧阴离子自由基清除率的测定
[0104]
准确称取1.211g三羟甲基氨基甲烷，加入适量去离子水溶解，再加入0.1mol/l hcl溶液45.8ml，定容到200ml，即为ph8.2浓度为50mmol/l tris-hcl缓冲液。
[0105]
准确称取0.302g邻苯三酚，加入0.01mol/l hcl溶液溶解定容至200ml，得到6mmol/l邻苯三酚溶液。
[0106]
取ph为8.2的tris-hcl缓冲液5.5ml于试管中，加入0.4ml样品溶液，置于37℃水浴锅中加热10min，然后加入预热过的邻苯三酚溶液0.1ml，混匀后精确处理5min，立刻用0.5ml浓盐酸打断反应，以tris-hcl缓冲液调零，测320nm处吸光值(ax)。用0.4ml去离子水代替样品溶液，其余试剂不变，作为实验对照组，于320nm处测定吸光值(a0)。
[0107]
样品超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：
[0108][0109]
2.2糙米-葛根发酵液dpph自由基清除率的测定
[0110]
准确称取dpph固体0.0039g，于50ml无水乙醇中溶解，操作过程需在包有锡箔纸的比色皿中进行，得到浓度为2
×
10-4
mol/l dpph溶液。使用dpph溶液全过程注意避光保存、避光操作。
[0111]
取1ml发酵液于9ml去离子水中，混匀，得到稀释10倍的样品溶液。
[0112]
取3ml的稀释样品液与3ml dpph溶液于试管中混匀，为a1管。
[0113]
取3ml的无水乙醇与3ml dpph溶液于试管中混匀，为a2管。
[0114]
取3ml的无水乙醇与3ml稀释样品液于试管中混匀，为a3管。
[0115]
使3支试管避光反应30min。反应完成后，用紫外分光光度计以无水乙醇调零，在波长517nm下分别测定a1、a2、a3管的吸光值(a1)、(a2)、(a3)。
[0116]
样品dpph自由基清除率计算公式如下：
[0117][0118]
表1.本发明糙米葛根发酵液的美白以及抗氧化作用测试结果
[0119][0120][0121]
由实施例1制备得到的糙米葛根发酵液的实验数据可以看出，以糙米粉和葛根粉为原料，采用本发明所述方法发酵得到的糙米葛根发酵液，相比于对比例3单单采用糙米粉为原料，采用本发明所述方法制备得到的糙米发酵液，其不仅具有较好的美白作用，同时还具有较好的抗氧化作用。
[0122]
从实施例2～6制备得到的糙米葛根发酵液的实验数据可以看出，其与实施例1相比，其美白作用以及抗氧化作用得到了有效的提高；这说明：在本发明发酵过程中加入葛根
提取物，可以进一步提升制备得的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用。
[0123]
从实施例2～6制备得到的糙米葛根发酵液的实验数据还可以看出，其与实施例1相比，不同实施例制备得到的糙米葛根发酵液，其对美白作用以及抗氧化作用的提升幅度的差别是巨大的；实施例2制备得到的糙米葛根发酵液，其美白作用以及抗氧化作用的远远高于实施例3～6；具有十分优异的美白作用以及抗氧化作用。这说明：在发酵过程中，加入采用不同有机溶剂提取得到的葛根提取物制备得到的糙米葛根发酵液，其对美白作用以及抗氧化作用的提升幅度大小差别是巨大的。在发酵过程中，加入采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的葛根提物制备得到的糙米葛根发酵液，其对美白作用以及抗氧化作用的提升幅度远远高于采用其它溶剂或其它溶剂的组合制备得到的糙米葛根发酵液。在发酵过程中，加入采用由甲醇和乙酸乙酯组成的混合有机溶剂提取得到的葛根提物制备得到的糙米葛根发酵液，其具有十分优异的美白作用以及抗氧化作用。
[0124]
从实施例2制备得到的糙米葛根发酵液的实验数据还可以看出，其美白作用以及抗氧化作用大幅高于对比例1和2制备得到的糙米葛根发酵液。这说明，在发酵过程中，葛根提取物的加入时机不同，制备得到的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用的提升幅度是不同的；只有在发酵过程中加入葛根提取物(即，先将发酵原料混合物在25～35℃下发酵6～12h，接着加入葛根提取物，然后在25～35℃下继续发酵6～12h)，才能大幅提高制备得到的糙米葛根发酵液的美白作用以及抗氧化作用；制备得到的糙米葛根发酵液才具有十分优异的美白作用以及抗氧化作用。