一种镓离子与酶共负载抗菌剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种镓离子和对微生物细胞壁或者生物膜基质具有降解能力的酶共负载抗菌剂、制备方法及其应用。除了可以实现对例如耐药细菌、真菌及其他微生物的高效的多重抗菌手段的结合外，还可进一步应用于眼部微生物或者皮肤微生物感染等感染性疾病的治疗。


背景技术：

2.微生物感染问题，例如细菌感染、真菌感染，已经成为公共卫生领域非常棘手的问题。虽然抗生素的使用在一定程度上抑制了微生物的增殖，但是另一方面也引起了多药耐菌的产生。同时微生物形成的生物被膜，进一步增强了微生物的耐药性，使得许多的抗生素逐渐的失效。相对于投入大量的研究成本与时间去开发新型的抗生素，寻找其他低成本，高效的杀菌途径显得更加重要。
3.金属离子，例如银离子，铜离子等，由于可以破坏微生物的表面蛋白、产生活性氧，细胞膜破坏等多种途径来抑制或者杀灭微生物，而受到广泛关注。但是常用的金属银离子抗菌剂，在获得强大抗菌能力的同时，其对正常细胞的毒性作用，也不能忽视，所以需要寻找更加安全的金属离子制剂。研究发现，微生物生长发育的过程中，对铁离子的摄取极其旺盛，通过干扰铁离子代谢过程，是一个抑制微生物的潜在途径。镓离子与铁离子具有极强相似的离子结构，可以作为“特洛伊木马”被微生物摄取，但是由于镓无法像铁离子一样，可以从高价态还原至低价态，从而导致了微生物的死亡。镓离子制剂，例如硝酸镓已经被美国食品药品监督管理局用于高钙血症的注射性治疗药物，其高剂量的使用下，依然具有明显的安全性。
4.镓离子虽然具有潜在的、安全性的抗微生物能力。但是针对感染性疾病，例如皮肤伤口感染，角膜伤口感染等疾病，其微生物通常以生物被膜的形成存在。生物被膜内部具有大量的多糖，蛋白质等基质材料，会阻隔抗生素或者金属离子的进入，从而大大降低抗菌剂的效果，增强微生物的耐药性。
5.综述所述，本发明提供一种结合破坏生物被膜和金属离子的组合策略，来克服难治性的微生物感染问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种镓离子和酶共负载抗菌剂及其制备方法和应用。该抗菌剂可以突破微生物细胞壁以及生物被膜的影响，进一步快速释放镓离子以产生活性氧，代谢干扰等途径，协同杀灭或者抑制微生物。该抗菌剂，除了有别于现有的抗生素疗法，减弱了微生物耐药的问题，同时使用的镓离子，酶和纳米载体相对于常用的金属银离子等抗菌剂具有明显的安全性优势。
7.为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：一种镓离子与酶共负载抗菌剂及其制备方法和应用，其采用的技术方法如下：
8.一种镓离子和酶共负载抗菌剂，按质量百分比计，包括：30％～90wt％纳米载体、1％～30wt％水溶性镓盐、1％～30wt％酶、1％～30wt％螯合剂，所述抗菌剂为非晶材料，镓以离子形态螯合于其中，所述的酶为对微生物细胞壁或者生物膜基质中成份具有降解或者破坏功能的酶。
9.一种镓离子和酶共负载抗菌剂的制备方法，包括：将纳米载体与酶在溶液中进行混合，通过相互作用，使纳米载体负载酶得到载酶纳米颗粒；所述的酶为对微生物细胞壁或者生物膜基质中成份具有降解或者破坏功能的酶；将螯合剂加入到制得的载酶纳米颗粒中，加入水溶性镓盐，使得镓结合；通过一段时间反应后，洗涤去除多余未反应材料，得到镓离子与酶共负载抗菌剂。
10.上述技术方案中，进一步地，所述的纳米载体为多孔二氧化硅，多孔碳，脂质体，聚乳酸，壳聚糖，树状高分子，金属中的一种或多种。
11.进一步地，所述的酶选自溶壁酶、溶菌酶、葡聚糖酶、纤维素水解酶、甘露聚糖酶、蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、几丁质酶的一种或多种。
12.进一步地，所述的螯合剂选自多巴胺、透明质酸钠、聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、海藻酸钙、明胶、纤维素衍生物中的一种或多种。
13.进一步地，所述抗菌剂为纳米颗粒，粒径为纳米尺度。
14.进一步地，所述的抗菌剂内还包括医药学上可接受的辅料。
15.进一步地，所述的溶液为水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液中的一种或多种。
16.本发明还提供一种感染性伤口抗菌促愈合药物，含有如上所述的抗菌剂。所述的感染性伤口为微生物感染，所述微生物为细菌或真菌。
17.本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明的优点在于提供了一种镓离子和酶共负载抗菌剂和及其制备方法。该抗菌剂是非抗生素型抗菌制剂，可以通过产生活性氧、干扰铁代谢、破坏或者降解微生物及其生物膜的微结构等多途径的抗菌手段的结合，避免了抗生素耐药的问题。同时，通过将对微生物微结构或者生物膜基质的酶与镓离子相结合，可以有效的改善金属离子的抗微生物能力，特别是降低生物膜基质对金属离子的阻隔效应。另外，所述的抗菌剂的主要成份都具有明显的生物相容性，其中金属镓离子相对于金属银离子，金属铜离子等传统等抗菌剂有效成份具有更好的安全性，和更低的细胞毒性。抗菌剂的关键成份，以纳米颗粒的形态呈现，再进一步的疾病应用时，可以有效的保护内部的活性成份，提高病灶部分的滞留和作用时间。
18.本发明利用酶结合金属离子的组合策略来协同破坏生物膜治疗感染问题，克服了如下技术难点：1)酶和金属离子在生物应用的时候，由于二者在面临例如温度、溶液盐度、降解蛋白等微环境的干扰时，常常会失去活性或者发生聚集。直接使用酶或者金属离子将极大的降低二者的抗菌能力。2)除了二者自身的活性降低，金属离子也会对酶的活性进行干扰，使得二者无法在同一时间都保持高的活性。因此，本发明使用纳米载体，同时负载金属镓离子和对生物膜或者细胞壁降解的酶，将金属镓离子和酶以特定方式进行组合，一方面通过纳米化，保护酶和金属镓，降低外界微环境对二者活性的影响，另一方面，本发明通
过先包覆酶，再通过螯合镓离子的方式，降低了镓离子对内部酶的直接接触概率，减少了金属镓离子对酶活性的破坏，从而实现了对耐药细菌、真菌等微生物及其生物被膜引起的感染进行治疗，且达到了极好的治疗效果。此外，本发明金属镓离子使用的是螯合的方式，而非形成结晶颗粒，提高了离子的释放速率，也降低了抗菌剂降解的难度，提高了抗菌剂生物应用的安全性。
附图说明
19.图1为实施例1合成的镓离子和酶共负载抗菌剂的透射电子显微(tem)照片。
20.图2为实施例2合成的镓离子和酶共负载抗菌剂的扫描电子显微(sem)照片。
21.图3为实施例3合成的镓离子和酶共负载抗菌剂的水合粒径分布图。
22.图4为实施例1合成的镓离子和酶共负载抗菌剂与真菌共培养之后的扫描电子显微(sem)照片。
23.图5为实施例2合成镓离子和酶共负载抗菌剂用于小鼠皮肤细菌感染愈合实验的效果图。
24.图6为实施例1合成镓离子和酶共负载抗菌剂用于小鼠角膜真菌感染伤口的效果图。
25.图7为本发明合成的镓离子和酶共负载抗菌剂的x射线衍射图谱，其中标准镓单晶和氧化镓单晶的图谱作为对照。
26.图8为本发明合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，与常见的纳米银抗菌剂的抗菌离子释放速率的对比。
27.图9为本发明合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，酶，以及酶与镓离子直接混合负载后的酶活性对比。
28.图10为本发明合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，与直接使用镓离子在细胞培养基和真菌培养基条件下的稳定性对比。
29.图11为本发明合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，硝酸镓，以及硝酸镓与酶混合使用下，作为滴眼液在感染性小鼠眼部病灶的活性镓离子的含量变化。
具体实施方式
30.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明。
31.本发明的一种镓离子与酶共负载抗菌剂，其制备方法包括如下步骤：(1)将纳米载体与酶在溶液中进行混合，通过相互作用，使载体负载酶。(2)将螯合剂加入到步骤(1)制备的载酶纳米颗粒中，加入水溶性镓盐，使得镓结合。通过一段时间反应后，最后通过洗涤，去除多余未反应的材料，得到镓离子与酶共负载抗菌剂。
32.在本发明的方案中，所述的步骤(1)中纳米载体与酶的质量比可以为0.01：1～100：1。所述的步骤(1)中纳米载体与酶混合的溶液包括但不局限于水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液等水溶性溶液以及合成条件下的极性与非极性溶液的单个或者混合溶液。所述的步骤(1)中纳米载体负载酶的方法，包括但不局限于超声震荡法、搅拌法、静电吸附法、共价键修饰法、微乳液法等常用的物理化学方法。所述的步
骤(1)中纳米载体负载酶的温度，包括但不局限0-50℃。所述的步骤(1)中纳米载体负载酶的时间，包括但不局限1s-72h。
33.进一步优选地，所述的步骤(2)中螯合剂的加入顺序，包括但不局限于在可溶性镓盐前加入、与可溶性镓盐同时加入、先加入一部分后再与可溶性镓盐同时加入另一部分。所述的步骤(2)中反应时间，包括但不局限1s-72h。
34.本发明中采用先将酶负载于纳米载体中，负载得到载酶纳米颗粒后再进行螯合镓离子的方案，相对于直接将酶与镓离子共同负载于纳米载体上或者先负载镓离子再负载酶的方案，本发明降低了镓离子和酶在作用前直接接触的概率，减少金属离子对酶活性的干扰，从而能够最大化的保护酶的活性，保证抗菌剂的协调抗菌效果
35.本发明所得到的的镓离子和酶共负载抗菌剂，是一种非晶态的材料，镓以离子形态螯合于其中，相对于采用常规方法制得的无机晶体颗粒的抗菌剂而言，本发明制得的抗菌剂在后续生物医药应用时，可以更有利于快速的镓离子释放，从而抗菌剂能够更快的降解，提高了其生物安全性。本发明的抗菌剂按质量百分比计，其成份包括纳米载体30％～90wt％、水溶性镓盐1％～30wt％、酶1％～30wt％、螯合剂1％～30wt％。所述的纳米载体包含多孔二氧化硅，多孔碳，脂质体，聚乳酸，壳聚糖，树状高分子，金属等纳米颗粒；优选为介孔二氧化硅，聚乳酸以及脂质体，其具有优异的酶包覆能力和生物安全性；所述的纳米颗粒的粒径在5-1000纳米。所述的镓盐为硝酸镓、氯化镓、醋酸镓、硫酸镓等水溶性镓盐。所述的酶包括溶壁酶、溶菌酶、葡聚糖酶、纤维素水解酶，甘露聚糖酶、蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、几丁质酶等可以对微生物细胞壁或者生物膜基质中成份具有降解或者破坏功能的酶的一种或者多种。所述的螯合剂为多巴胺、透明质酸钠、聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠、海藻酸钙、明胶、纤维素衍生物等生物医药高分子材料的一种或者多种；优选为多巴胺，当本发明中采用多巴胺作为螯合剂时，多巴胺与镓离子螯合会产生额外的拉曼光谱信号。可以通过监测螯合产生的拉曼信号来监控镓离子的释放以及在感染局部的药物分布情况，因此，得到的不仅为抗菌剂，而且是一种可实时监测镓离子释放情况的抗菌剂。
36.此外，本发明的抗菌剂可以作为感染性伤口抗菌促愈合药物，该药物还可以包含医药学内可接受的辅料，利用这些辅料，可以将所述纳米抗菌剂制备成适合临床使用的任何一种剂型，包括但不限于注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、凝胶剂、口服剂、膏剂、霜剂、喷剂等。可以应用于包括但不局限于微生物感染的皮肤伤口、微生物感染的眼部伤口等感染性疾病的抗菌治疗中。且通过实验可以证实该抗菌剂具有非常优异的治疗效果，可替代现有常规药物。
37.实施例1：
38.一种镓离子和酶共负载抗菌剂的制备方法，其步骤是：
39.(1)将纳米载体多孔硅与溶壁酶在水溶液中进行混合，其中多孔硅与溶壁酶的质量比为1：0.8，通过在4℃冰浴条件，通过探针超声震荡溶液5min，使纳米载体多孔硅负载溶壁酶。
40.(2)将盐酸多巴胺加入到步骤(1)制备的载溶壁酶纳米颗粒中，溶液为ph 9的tris-hcl缓冲液，搅拌反应2h后，随后再同时加入盐酸多巴胺和硝酸镓，使得镓结合，搅拌反应6h。最后通过洗涤，去除多余未反应的材料，得到镓离子与溶壁酶共负载抗菌剂。
41.图1为镓离子和酶共负载抗菌剂的tem照片，可以清晰的看出抗菌剂为多孔的纳米
颗粒的结构。将该例得到的镓离子和酶共负载抗菌剂与真菌共培养之后的扫描电子显微(sem)照片如图4所示，可以看出，经过抗菌剂的作用后，真菌发生了破碎和泄漏，其表面附着有大量的抗菌剂。将合成的镓离子和酶共负载抗菌剂用于小鼠角膜真菌感染伤口，其效果图如图6所示，通过监测不同对照组小鼠白色念珠菌感染的真菌性角膜感染情况，可以看出镓离子和酶共负载抗菌剂，在单次给药的情况下，比两性霉素b效果更佳，具有最好的杀菌促进角膜愈合的效果。此外，本发明制得的抗菌剂的xrd检测结果如图7所示，可以看出，该抗菌剂为非晶材料，镓以离子形式螯合于抗菌剂中，而非形成无机晶体颗粒，这更有利于镓离子的快速释放，与常规的纳米银抗菌剂相比，二者抗菌离子释放速率如图8所示；所合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，与直接使用镓离子在细胞培养基和真菌培养基条件下的稳定性对比如图10。
42.图11为本发明合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，硝酸镓，以及硝酸镓与酶混合使用下，分别作为滴眼液在感染性小鼠眼部病灶的活性镓离子的含量变化。采用本发明方法制得的抗菌剂可以更为有效的发挥酶与镓离子的抗菌作用，达到优异的治疗效果。
43.实施例2：
44.一种镓离子和酶共负载抗菌剂的制备方法，其步骤是：
45.(1)通过微乳液法，在二氯甲烷和水的溶液中，在4℃冰浴条件下，将溶菌酶负载到聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)纳米载体中，其中plga纳米载体与溶壁酶的质量比为10：1，使纳米载体plga负载溶菌酶。
46.(2)将盐酸多巴胺加入到步骤(1)制备的载溶菌酶纳米颗粒中，溶液为ph 9的tris-hcl缓冲液，随后加入氯化镓，使得镓结合，搅拌反应12h。最后通过洗涤，去除多余未反应的材料，得到镓离子与溶菌酶共负载抗菌剂。
47.图2为本例制得镓离子和酶共负载抗菌剂的sem照片，可以看出抗菌剂为纳米球形结构。将本例制得的镓离子和酶共负载抗菌剂用于小鼠皮肤细菌(绿脓杆菌)感染愈合实验，其效果图如图5。通过监测绿脓杆菌感染的对照组皮肤与感染后通过镓酶共负载抗菌剂处理的细菌感染伤口的愈合情况，可以看出镓离子和酶共负载抗菌剂具有很好的抗菌促愈合效果。
48.实施例3：
49.一种镓离子和酶共负载抗菌剂的制备方法，其步骤是：
50.(1)将纳米载体多孔碳与葡聚糖酶在水溶液中进行混合，其中多孔碳与葡聚糖酶的质量比为1：2，通过在25℃条件，通过搅拌24h，使纳米载体多孔碳负载葡聚糖酶。
51.(2)将盐酸多巴胺加入到步骤(1)制备的载葡聚糖酶纳米颗粒中，溶液为ph9的tris-hcl缓冲液，同时加入盐酸多巴胺和硝酸镓，使得镓结合，搅拌反应12h。最后通过洗涤，去除多余未反应的材料，得到镓离子与葡聚糖酶共负载抗菌剂。
52.本例制得的抗菌剂的尺寸分布如图3所示，可以看到抗菌剂具有纳米尺寸(约120纳米)，且分布均匀，未有大颗粒出现。
53.本发明抗菌剂采用特定的方法制得，该种方式可有效保护酶的活性及镓离子稳定性，所合成的镓离子和酶共负载抗菌剂，与酶，以及将酶与镓离子直接混合负载后进行酶活性对比，结果如图9。
54.最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，
尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。