包含植物乳杆菌ATG-K2或植物乳杆菌ATG-K6的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物的制作方法

包含植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物
技术领域
1.本发明涉及包含植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物，更详细地，涉及可以通过包含植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分来用在脂质相关代谢性疾病的预防及治疗的组合物。


背景技术：

2.慢性肝疾病、2型糖尿病及心脏病等代谢疾病的增加与肥胖率的上升有关。重度肥胖的患者中约有90％诊断为非酒精性脂肪性肝病(nafld)，约37％诊断为非酒精性脂肪性肝炎，约10％诊断为肝硬变。
3.非酒精性脂肪性肝病的特征在于，在没有过度摄入酒精的情况下，脂肪细胞的5％以上积聚有脂肪，这是最常见的肝疾病。在这种状态下，虽在初期阶段不引起症状，但可能发展为包括肝纤维症、肝硬变及癌症在内的严重的肝疾病。
4.糖，尤其是果糖会激活使非酒精性脂肪性肝病恶化的肝脂肪生成程序。肝几乎独自处理所有的果糖，果糖在肝中主要通过脂肪从头合成(de novo lipogenesis；dnl)来代谢为中性脂肪。果糖来源前体起到srebp-1c、c/ebpα之类的转录因子的营养调节因子的作用，调节糖异生与脂肪从头合成的基因的表达。摄取果糖增加肝的糖异生及脂肪从头合成，增加血糖及中性脂肪水平。
5.非酒精性脂肪性肝病的另一病因为氧化应激。肝中发生的脂肪积聚引起脂质生成过氧化，这会促进炎症及纤维化等多种反应。因此，以往提出将水飞蓟素或维生素e等抗氧化剂用作非酒精性脂肪性肝病的治疗剂。但至今尚未开发出对非酒精性脂肪性肝病的标准药理治疗剂。
6.另一方面，现今已查明益生菌主要起到抑制肠内有害菌并帮助排便活动的功能，据报告，还有助于皮肤保湿、在紫外线引起的皮肤损伤中保持皮肤健康、女性阴道健康、改善免疫过敏反应导致的皮肤状态、减少体脂等，还给精神疾病等带来影响。
7.现在，对于益生菌的研究主要集中在免疫和肠健康的研究中，虽然因其与抗氧化、抗炎症、免疫等的改善相关而具有肝功能改善效果的可能性，但有关于此的研究仍处于不足的状态。
8.在多种发酵食品的生产中起到重要作用的植物乳杆菌是乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)中最重要的一种。在土壤和人的肠道内等多种环境中发现了植物乳杆菌，认为其具有作为益生菌的可能性。
9.于是，本发明人在进行有关利用乳酸菌的脂质相关代谢性疾病的改善方法的多种研究的过程中，确认到植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6在脂质相关代谢性疾病的预防和治疗中的优秀效果，从而完成本发明。


技术实现要素：

10.技术问题
11.本发明的目的在于，提供包含从发酵蔬菜中分离的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
12.本发明的目的在于，提供包含从发酵蔬菜中分离的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
13.技术方案
14.为了实现上述目的，本发明提供一种包含选自由植物乳杆菌atg-k2(lactobacillus plantarum atg-k2，保藏编号：kctc 13577bp)的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
15.本发明提供一种包含选自由植物乳杆菌atg-k6(lactobacillus plantarum atg-k6，保藏编号：kctc 13570bp)的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
16.本发明提供一种包含选自由植物乳杆菌atg-k2(保藏编号：kctc 13577bp)的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
17.并且，本发明提供一种包含选自由植物乳杆菌atg-k6(保藏编号：kctc 13570bp)的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
18.上述组合物可以减少作为肥胖指标的体重增加率及体脂。
19.上述组合物可以减少作为肝损伤指标的谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)及碱性磷酸酶(alp)的酶活性。
20.上述组合物可以减少血清中性脂肪、血清总胆固醇、空腹血糖及瘦蛋白，可以增加血清高密度脂蛋白(hdl)胆固醇、脂联素、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)及过氧化氢酶(cat)。
21.上述组合物可以减少肝组织中性脂肪和肝组织总胆固醇，可以减少肝组织脂质过氧化物(mda)。
22.上述组合物可以减少作为脂质代谢相关指标的作为脂质生成相关指标的srebp-1c(甾醇调解元件结合转录因子1(sterol regulatory element binding transcription factor 1))信使核糖核酸(mrna)、c/ebp-α(ccaat/增强子结合蛋白α(ccaat/enhancer-binding protein alpha))信使核糖核酸及脂肪酸合酶(fas，fatty acid synthase)信使核糖核酸的表达。
23.上述组合物可以减少作为脂肪酸氧化相关指标的乙酰辅酶a羧化酶(acc，acetyl coa carboxylase)信使核糖核酸的表达，可以增加肉毒碱棕榈酰转移酶(cpt-1，carnitine palmitoyltransferase 1)信使核糖核酸的表达。
24.上述组合物可以增加肠内菌群中的拟杆菌门(bacteroidetes)菌群，可以抑制厚壁菌门(firmicutes)菌群。
25.发明的效果
26.本发明涉及包含从发酵蔬菜中分离的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物，口服给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6后测量肝健康相关指标及抗肥胖指标的结果表明改善效果突出，因此可以轻松用作用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
27.本发明涉及包含从发酵蔬菜中分离的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物，口服给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6后测量肝健康相关指标及抗肥胖指标的结果表明改善效果突出，因此可以轻松用作用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
附图说明
28.图1为给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝组织照片(nc：正常饮食对照组(normal diet control)；hc：高脂肪/高果糖饮食对照组(hf/hf diet control)；pc：高脂肪/高果糖饮食和水飞蓟素组(hf/hf diet with silymarin)；k2：高脂肪/高果糖饮食和atg-k2组(hf/hf diet with atg-k2)；k6：高脂肪/高果糖饮食和atg-k2组(hf/hf diet with atg-k6)，以下相同)。
29.图2为给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的附睾脂肪照片。
30.图3a为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的谷丙转氨酶的酶活性的测量结果的柱状图，图3b为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的谷草转氨酶的酶活性的测量结果的柱状图，图3c为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的碱性磷酸酶的酶活性的测量结果的柱状图。
31.图4a为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的血清中性脂肪测量结果的柱状图，图4b为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的血清总胆固醇测量结果的柱状图，图4c为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的血清高密度脂蛋白胆固醇测量结果的柱状图，图4d为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的空腹血糖(fasting serum glucose)测量结果的柱状图，图4e为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的瘦蛋白(leptin)测量结果的柱状图，图4f为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的脂联素(adiponectin)测量结果的柱状图，图4g为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的超氧化物歧化酶(sod)测量结果的柱状图，图4h为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)测量结果的柱状图，图4i为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的过氧化氢酶(cat)测量结果的柱状图。
32.图5a为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝组织中性脂肪测量结果的柱状图，图5b为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝组织总胆固醇测量结果的柱状
图，图5c为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的脂质过氧化物测量结果的柱状图。
33.图6a示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的srebp1c的信使核糖核酸的表达程度，图6b示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的脂肪酸合酶的信使核糖核酸的表达程度，图6c示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的c/ebp的信使核糖核酸的表达程度，图6d示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的srebp1c的免疫印迹法分析结果，图6e示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的脂肪酸合酶的免疫印迹法分析结果，图6f示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的c/ebp的免疫印迹法分析结果。
34.图7a示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝中的乙酰辅酶a羧化酶(acc)的信使核糖核酸的表达程度，图7b示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝中的肉毒碱棕榈酰转移酶的信使核糖核酸的表达程度，图7c示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝中的磷酸化的单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(ampk)和总单磷酸腺苷激活的蛋白激酶的免疫印迹法分析结果，图7d示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝中的磷酸化的乙酰辅酶a羧化酶和总乙酰辅酶a羧化酶的免疫印迹法分析结果，图7e示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肝中的肉毒碱棕榈酰转移酶的免疫印迹法分析结果。
35.图8为示出给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的高脂肪/高果糖饮食大鼠与对照组的肠内菌群差异的柱状图。
具体实施方式
36.本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k2(保藏编号：kctc13577bp)的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
37.并且，本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k6(保藏编号：kctc 13570bp)的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
38.并且，本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k2的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
39.并且，本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k6的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
40.本发明的实施方式
41.在下述说明中，将只说明理解本发明的实施例所需的部分，应该留意的是，此外的
说明将在不混淆本发明要旨的范围内加以省略。
42.在以下说明的本说明书及发明要求保护范围中使用的术语或词汇不应解释为限定于通常或词典上的含义，而应从发明人可以为以最佳方法说明自己的发明而适当定义术语的概念的原则出发来解释为符合本发明的技术思想的含义和概念。因此，本说明书中记载的实施例和附图中示出的结构仅为本发明的优选实施例，而非代表本发明的所有技术思想，应该理解的是，在提出本技术的时间点，可以有替代它们的多种同等物和变形例。
43.以下，详细说明本发明。
44.本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k2的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
45.本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k6的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
46.包括本发明的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6在内的乳酸菌属于一般认为安全(gras，generally recognized as safe)，其安全性已经过长期验证。
47.本发明的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6属于具有韩国食品医药品安全厅公告的“可以通过乳酸菌增殖及有害菌抑制来帮助排便活动通畅”的功能性的益生菌。
48.本发明的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6为源自韩国忠清地区的发酵蔬菜中的乳酸菌。
49.在本发明中，“菌株的培养物”为包括在培养基中，例如在液体培养基中培养的培养液本身、过滤和/或离心分离上述培养液来去除菌株的上清液在内的含义。
50.在本发明中，“培养物的浓缩液及干燥物”可以为去除培养物中的液体培养基并只回收浓缩的菌体而经过离心分离或过滤的过程，但本发明并不限定于此。并且，浓缩的菌体可以根据通常的方法通过干燥、冷冻或冷冻干燥来以不使其失去活性的方式保存。
51.韩国授权专利第10-1930438公开了植物乳杆菌atg-k2、atg-k6或atg-k8具有预防和改善女性阴道炎的效果，但本发明确认到植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6具有预防、改善及治疗脂质相关代谢性疾病的效果，从而完成本发明。
52.作为上述组合物的预防或治疗对象的脂质相关代谢性疾病可以为糖尿病、高血脂症、脂肪肝、动脉硬化、高血压或心血管疾病，但不限定于此。已知生活环境、过度的营养摄入以及能量消耗的不足引起的肥胖为最根本的病因。肥胖是指脂肪细胞在体内增殖分化后，由此引起的脂肪过度急剧的状态，在能量吸收量比消耗量相对增加的情况下，经过脂肪细胞的数量和体积增加的过程，结果为脂肪组织的质量的增加。
53.上述用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物可以包含药学上可接受的载体。上述药学上可接受的载体可以包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油及肉豆蔻酸异丙酯等，但不限定于此。
54.并且，上述用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物可以制备为用于胃肠外给药的水溶性溶液，优选地，可以使用汉克氏溶液(hank's solution)、林格氏溶液(ringer's solution)或以物理方式缓冲的生理盐水等缓冲溶液等。水溶性注射(injection)悬浮液可以添加羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或糊精等能够增加悬浮液的粘度
的基质。
55.本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k2的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
56.并且，本发明提供包含选自由植物乳杆菌atg-k6的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液及干燥物组成的组中的一种以上作为有效成分的用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物。
57.上述用于预防及改善脂质相关代谢性疾病的保健食品组合物包括功能性食品、营养辅助剂、保健食品及食品添加剂等所有形态。上述保健食品组合物可以根据本发明所属技术领域中公知的通常方法制备为多种形态。
58.例如，作为保健食品组合物，可以制备为包含本发明的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的益生菌、酸奶、饮料或果汁等形态来饮用，或者通过颗粒化、胶囊化及粉末化来摄取。并且，可以将本发明的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6与公知的活性成分一同混合来制备为组合物的形态。
59.上述组合物可以减少作为肥胖指标的体重增加率及体脂。
60.如表3及图2所示，在下述实施例中，确认到因高脂肪/高果糖饮食增加的体重和附睾脂肪的脂肪球大小通过给药植物乳杆菌atg-k2和atg-k6而减少。因此，可知植物乳杆菌atg-k2和atg-k6可以用作减少体重增加率和体脂的抗肥胖物质。
61.上述组合物可以减少作为肝损伤指标的谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶的酶活性。
62.谷丙转氨酶为丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase)，谷草转氨酶为天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase)，碱性磷酸酶为碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)，它们的数值高表示肝损伤，它们的数值低表示肝功能的恢复。
63.如图3a至图3c所示，通过下述实施例确认到通过给药植物乳杆菌atg-k2和atg-k6在统计学上显著改善了因高脂肪/高果糖饮食而增加的谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶。
64.上述组合物可以减少血清中性脂肪(serum triglyceride；serum tg)和血清总胆固醇(serum total cholesterol：serum tc)，可以增加血清高密度脂蛋白胆固醇(serum hdl cholesterol)。
65.血液中的脂肪大体可以分为总胆固醇、低密度脂蛋白(ldl)胆固醇、高密度脂蛋白(hdl)胆固醇、中性脂肪等四种。低密度脂蛋白(ldl)胆固醇积聚在血管壁上诱发引起心血管疾病和脑血管疾病的动脉硬化。高密度脂蛋白(hdl)胆固醇起到将积聚在血管壁的胆固醇运输到肝的作用，具有预防动脉硬化的效果。总胆固醇为低密度脂蛋白胆固醇与高密度脂蛋白胆固醇的总称，中性脂肪是为储存从饮食中摄取的多余能量而生成的，平时储存在脂肪细胞中，需要时释放来用作能量。
66.并且，瘦蛋白从脂肪组织中分泌后，作用于大脑来抑制食欲并使体内代谢活跃，从而起到减少体重的作用。当脂肪细胞增加时，瘦蛋白的浓度提高，从而抑制饥饿感并中断饮食摄取。脂联素为脂肪细胞中分泌的蛋白质中的一种，在改善胰岛素抵抗性方面起到决定性因素的作用。因此，已知为可以治疗肥胖和糖尿病的物质。还查明具有防止动脉硬化的功
能。肥胖时体内脂联素的量减少，体脂减少增加脂联素的产生。
67.超氧化物歧化酶(sod，superoxide dismutase)为与抗氧化机制相关的酶类物质中的一种，为具有强力的抗氧化作用的酶。谷胱甘肽过氧化物酶(gpx，glutathione peroxidase)为具有通过分解体内产生的过氧化氢来防止细胞受损的抗氧化功能的酶。过氧化氢酶(cat，catalse)也是具有抗氧化功能的酶。
68.因此，减少血清中性脂肪和血清总胆固醇、空腹血糖及瘦蛋白，增加血清高密度脂蛋白胆固醇、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶意味着在脂质相关代谢性疾病的预防及治疗中有效。
69.在下述实施例中，为了获知植物乳杆菌atg-k2和atg-k6与脂肪代谢的关联性，测量了血中脂质水平。如图4a至图4i所示，通过高脂肪/高果糖饮食增加了血清中性脂肪和血清总胆固醇、空腹血糖及瘦蛋白，减少了血清高密度脂蛋白胆固醇、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶。然后，确认到通过给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6减少了血清中性脂肪和血清总胆固醇、空腹血糖、瘦蛋白，显著增加了血清高密度脂蛋白胆固醇、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶。尤其是高密度脂蛋白胆固醇，与作为阳性对照组的水飞蓟素给药组相比，给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6时高密度脂蛋白胆固醇更为增加，可知具有良好的效果。
70.上述组合物可以减少肝组织的中性脂肪和总胆固醇，可以减少肝组织的脂质过氧化物。
71.过氧化脂质是因细胞内的氧化应激增加，即，因自由基生成的增加及抗氧化防御力的减少而增加，该反应被证实为由多种毒性化合物或药物引起肝损伤的发生的最重要的机制中的一种。过氧化脂质通过作为脂质成分的不饱和脂肪酸暴露于氧中来产生，尤其，生物体内的过氧化现象易于发生在线粒体、微粒体、红细胞及血小板等富含不饱和脂肪酸和磷脂的细胞膜中。
72.因此，肝组织的中性脂肪和总胆固醇的减少、肝组织的脂质过氧化物的减少表示在脂质相关代谢性疾病的预防及治疗中有效。
73.通过下述实施例在肝组织中测量作为脂质代谢相关标记物的中性脂肪和总胆固醇的结果，如图5a至图5c所示，确认到通过高脂肪/高果糖饮食增加了肝组织的中性脂肪和总胆固醇，通过给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6显著减少了肝组织的中性脂肪和总胆固醇。
74.并且，测量肝组织的脂质过氧化物的结果，可知通过给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6显著减少了因高脂肪/高果糖饮食而增加的脂质过氧化物的含量。
75.上述组合物可以减少作为脂质生成相关指标的srebp-1c信使核糖核酸、c/ebp-α信使核糖核酸及脂肪酸合酶信使核糖核酸的表达。
76.srebp-1c、c/ebp-α及脂肪酸合酶为脂质生成相关指标，srebp-1c、c/ebp-α、脂肪酸合酶的信使核糖核酸的表达减少表示在脂质相关代谢性疾病的预防及治疗中有效。
77.通过下述实施例分析的结果，如图6a至图6f所示，确认到与高脂肪/高果糖饮食诱导组相比，在给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的组中，srebp-1c、c/ebp-α、脂肪酸合酶的信使核糖核酸的表达减少。
78.上述组合物可以见面少作为脂肪酸氧化相关指标的乙酰辅酶a羧化酶信使核糖核
酸的表达，可以增加肉毒碱棕榈酰转移酶信使核糖核酸的表达。
79.乙酰辅酶a羧化酶、肉毒碱棕榈酰转移酶为脂肪酸氧化相关指标，乙酰辅酶a羧化酶信使核糖核酸的表达减少和肉毒碱棕榈酰转移酶信使核糖核酸的表达增加表示在脂质相关代谢性疾病的预防及治疗中有效。
80.通过下述实施例分析的结果，如图7a至图7e所示，确认到肉毒碱棕榈酰转移酶的信使核糖核酸的表达减少，乙酰辅酶a羧化酶的信使核糖核酸的表达增加。
81.上述组合物可以增加肠内菌群中的拟杆菌门菌群，可以抑制厚壁菌门菌群。
82.人类的肠内微生物群大体分为四个门，即，作为革兰氏阴性菌的拟杆菌门和变形菌门(proteobacteria)、作为革兰氏阳性菌的厚壁菌门和放线菌门(actinobacteria)。其中，由拟杆菌属(bacteroides)构成的拟杆菌门与梭菌(clostridia)纲占大部分的厚壁菌门占大部分，小于10％的为其他门。在现有的研究中，若向野生型老鼠提供高脂肪高蛋白饮食，则会变化为增加厚壁菌门并减少拟杆菌门的微生物群。即使摄入相同的热量，接受肥胖的小鼠肠内微生物的无菌小鼠比接受瘦的小鼠肠内微生物的小鼠的体重增加。这个结果表示肠内微生物在能量积累和肥胖的发生中起到重要作用。在肥胖的人类的肠内微生物群中也观察到厚壁菌门/拟杆菌门(firmicutes/bacteroidetes)的比的增加，若提供低碳水化合物饮食或低脂肪饮食，则拟杆菌门的比例增加。
83.因此，可知肠内菌群中拟杆菌门菌群的增加和厚壁菌门菌群的抑制在脂质相关代谢性疾病的预防及治疗中有效。
84.通过下述实施例比较分析高脂肪/高果糖饮食诱导组与给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的组的肠内菌群的结果，确认到与高脂肪/高果糖饮食诱导组相比，给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的组的拟杆菌门菌群增加，厚壁菌门菌群被抑制，肠内菌群得到变化。
85.综合上述结果可知植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6通过如下方式在脂质相关代谢性疾病的预防和治疗中有效：1)减少作为肝损伤指标的谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶的酶活性；2)减少血清中性脂肪和血清总胆固醇、空腹血糖及瘦蛋白，增加血清高密度脂蛋白胆固醇、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶；3)减少肝组织中性脂肪和肝组织总胆固醇，减少肝组织脂质过氧化物；4)减少srebp1c信使核糖核酸、c/ebp-α信使核糖核酸及脂肪酸合酶信使核糖核酸的表达；5)减少乙酰辅酶a羧化酶信使核糖核酸的表达，增加肉毒碱棕榈酰转移酶信使核糖核酸的表达；6)增加肠内菌群中的拟杆菌门菌群，抑制厚壁菌门菌群。
86.实施例
87.以下，通过实施例及实验例详细说明本发明。但是，下述实施例及实验例仅用于例示本发明，本发明的内容不限定于下述实施例及实验例。
88.以下，在本发明的实施例及实验例中，植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6可以表示包含植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的菌株、上述菌株的培养物、上述培养物的浓缩液、上述培养物的干燥物或它们的混合物作为有效成分的含义。
89.实验材料
90.1.准备植物乳杆菌atg-k2和植物乳杆菌atg-k6
91.在37℃的温度下在mrs(man rogosa sharpe)培养基(difco laboratories公司，
美国(usa))中培养发酵蔬菜来源的乳酸菌植物乳杆菌atg-k2(保藏编号：kctc 13577bp)和植物乳杆菌atg-k6(保藏编号：kctc 13570bp)16小时。在4℃的温度下离心以8000rpm的转速离心分离15分钟来收集k2及k6细胞后，使用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，pbs)洗涤3次。最后，使细胞在12.5％的海藻糖(trehalose)、10％的脱脂牛奶(skim milk)、0.125％的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)(w/v)溶液中悬浮，使用fd8508冷冻干燥机(ilshinbiobase公司，韩国(korea))进行冷冻干燥。将干燥的粉末按照不同品系(strain)以5
×
108cfu的浓度溶于磷酸盐缓冲溶液(pbs)中使用。
92.2.实验设计
93.从orient bio公司(京畿道(gyeonggi-do)，韩国)获得6周龄的wistar大鼠(wistar rat)作为实验动物，经过1周的适应时间确认所有个体没有异常反应后，通过随机完全区组设计(randomized complete block design)进行分组。饲育环境为在温度20℃-25℃、湿度50％-55％中保持12小时的明暗交替，以自由摄取的方式提供固体饲料及水。
94.实验组分为正常对照组(normal diet control group，nc，10％的热量来自脂肪(10％calories from fat)；d12450b；research diets inc公司)的9只以及作为高脂肪/高果糖饮食组的给予45％高脂肪饮食(45％的热量来自脂肪(45％calories from fat)；d12451；research diets inc公司)及给予10％高果糖饮食的对照组(高脂肪/高果糖饮食对照组(high fat/high fructose diet control group)，hc)的33只，经8周的时间诱导非酒精性脂肪肝。诱导时间结束后，将脂肪肝诱导组通过随机完全区组设计重新分为正常对照组(normal diet control)、高脂肪高果糖对照组(hf/hf diet control，hc)、阳性对照组(水飞蓟素(silymarin)100mg/kg/b.w.，positive control，pc)、植物乳杆菌atg-k2组(k2)、植物乳杆菌atg-k6组(k6)等共5个组，每天上午10点30分口服给药各试验物质持续8周时间。每周测量一次体重，饮食为自律供给，通过测量每次给予时提供的量与剩余量的重量来确认组间的饮食效率。
95.上述阳性对照组中给药的水飞蓟素为强力的抗氧化剂，起到抗氧化作用，通过保护肝的细胞膜来从毒素中保护肝，起到帮助肝的再生的作用。
96.所有实验动物的饲育管理都是在得到嘉泉大学动物实验伦理委员会的认证后遵守相关规定来进行的(认证编号：giacuc-r2019014)。
97.3.实验动物的处理
98.使饲育结束的实验动物禁食12小时后进行安乐死。在4℃的温度下以300rpm的转速离心分离通过心脏穿刺(cardiac puncture)采取的血液15分钟来取得血清后，在-80℃的温度下保管直至用于分析。在采血后马上摘出脏器组织，使用生理盐水洗涤后用过滤纸去除水分后测量重量，然后将所有试样保管在-80℃的极低温冷藏箱(deep freezer)中保管来使用。
99.表1
[0100][0101]
实验方法
[0102]
向由高脂肪/高果糖饮食诱导非酒精性脂肪肝的大鼠口服给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6来检测如下与健康相关的标记物。
[0103]-测量体重及器官(肝、附睾脂肪)的重量
[0104]-肝组织病理学检查(苏木精伊红(h&e)染色，油红o(oil-red o)染色)
[0105]-测量肝功能相关的酶(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶)
[0106]-测量血中脂质水平标记物(血清中性脂肪、血清总胆固醇、血清高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、瘦蛋白、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物、过氧化氢酶)
[0107]-测量肝组织脂质代谢程度(肝组织中性脂肪、肝组织总胆固醇、肝组织过氧化物)
[0108]-测量脂质生成相关信使核糖核酸(srebp-1c、脂肪酸合酶、c/ebp)
[0109]-测量脂肪酸氧化相关信使核糖核酸(乙酰辅酶a羧化酶、肉毒碱棕榈酰转移酶)
[0110]-测量肠内菌群的变化
[0111]
(1)检测抗肥胖效果
[0112]
为了检测抗肥胖效果，确认了作为肥胖指标的体重增加率及附睾脂肪的脂肪球的大小。
[0113]
(2)测量肝损伤指标
[0114]
为了确认发酵蔬菜来源的乳酸菌的肝功能改善，分别利用各自对应的检测试剂盒(assay kit)(asanpharm公司，华城(hwaseong)，韩国)在实验动物的血清中测量作为肝损伤指标的谷草转氨酶(ast，aspartate aminotransferase)、谷丙转氨酶(alt，alanine aminotransferase)、碱性磷酸酶(alp，alkaline phosphate)。
[0115]
(3)测量血清指标
[0116]
分别使用tg-s、t-cho、hdl-cho试剂盒(kit)(asanpharm公司，华城(hwaseong)，韩国)测量中性脂肪(triglyceride，tg)、总胆固醇(total cholesterol，tc)、高密度脂蛋白(hdl，high density lipoprotein)胆固醇。
[0117]
使用血糖仪试剂盒(blood glucose meter kit)(handok公司，首尔(seoul)，韩
国)测量空腹血糖，使用酶联免疫吸附测定试剂盒(enzyme-linked immunosorbent assay(elisa)kit)(r&d system公司，明尼阿波利斯(minneapolis)，明尼苏达州(mn)，美国)测量脂联素和瘦蛋白。
[0118]
分别使用超氧化物歧化酶活性比色测定试剂盒(superoxide dismutase activity colorimetric assay kit)(上海蓝基生物科技有限公司，上海(shanghai)，中国(china))、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(glutathione peroxidase assay kit)(上海蓝基生物科技有限公司，上海，中国)、过氧化氢酶检测试剂盒(gatalase assay kit)(上海蓝基生物科技有限公司，上海，中国)测量作为抗氧化指标的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶。
[0119]
(4)测量肝组织指标
[0120]
为了在实验动物的肝组织中测量脂质含量，测量了肝的中性脂肪(hepatic tg)和总胆固醇。利用folch法萃取肝组织的脂质后，使用tg-s和t-cho试剂盒(asanpharm公司，华城，韩国)进行分析。在肝组织中使用脂质过氧化物检测试剂盒(lipid hydroperoxide(lpo)assay kit)预处理脂质过氧化物后，向96孔培养板中分别加入50μl的样品(sample)、450μl的三氯甲烷-甲醇溶剂混合物(chloroform-methanol solvent mixture)、50μl的发色剂(chromogen)(fts试剂(reagent)1、2)后在室温下培养5分钟，然后利用酶联免疫吸附测定(elisa)(biolog公司，美国)在500nm的波长中测量吸光度。
[0121]
(5)肝组织病理学检查(苏木精伊红染色、油红o染色)
[0122]
使用10％的福尔马林溶液(formalin)(sigma-aldrich公司，美国)固定肝组织样品后，经过乙醇脱水过程后，制备3μm-4μm厚度的石蜡切片，使用苏木精伊红(hematoxylin and eosin，h&e)染色后，进行组织学分析。以不同病变部位选择代表性的照片，根据各切片以低倍率(x100)、高倍率(x400)拍摄组织病理学(histopathological)照片。
[0123]
使用油红o染色gun-sucrose-fixed肝部分后，使用显微镜观察并拍摄照片。
[0124]
(6)信使核糖核酸及表达量
[0125]
使用实时逆转录聚合酶链式反应(real-time rt(reverse transcription)-pcr(polymerase chain reaction))分析肝组织中作为与脂肪生成相关的信号传递物质的srebp-1c、c/ebp-α、脂肪酸合酶以及与脂肪酸氧化相关的乙酰辅酶a羧化酶、肉毒碱棕榈酰转移酶的信使核糖核酸的表达。使用均质机(homogenizer)(polyton pt-mr 3100，kinematica ag公司，卢塞恩(luzern)，瑞士(switzerland))使肝组织均质化后，使用核糖核酸提取试剂盒(rna extraction kit)(intron biotechnology公司，京畿道，韩国)分离总核糖核酸(total rna)后，使用iscript互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(iscript cdna synthesis kit)(biorad公司，赫拉克勒斯(hercules)，加利福尼亚(ca)，美国)合成互补脱氧核糖核酸(cdna)。使用合成的互补脱氧核糖核酸进行实时逆转录聚合酶链式反应(real-time rt-pcr)，通过abi quantstudio 3(applied biosystems公司，福斯特城(foster city)，美国)设备使用sybr green master mix(takara bio公司，大津(otsu)，日本(japan))进行分析。本发明的实验中使用的引物序列(primer sequence)如表2所示，信使核糖核酸的表达使用β-肌动蛋白(β-actin)作为对照。
[0126]
表2
[0127][0128]
(7)统计分析
[0129]
所有数值以平均数
±
标准差的方式表示，通过如下方式进行统计分析：实施单因素方差分析(one-way anova)后，使用邓肯多重范围检验(duncan’s multiple range test)实施事后检验来检测组间的显著性。所有统计处理使用spss 25(spss inc公司，芝加哥(chicago)，伊利诺伊(illinois)，美国)进行评估，将p值(p-value)为0.05以下的情况判定为在统计学上具有显著性。
[0130]
实验结果分析
[0131]
1.体重增加率
[0132]
参照表3，确认到高脂肪高果糖饮食诱发了大鼠的体重增加，而植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6饮食组的体重增加率低。
[0133]
表3各组的体重增加率
[0134][0135]
2.肝健康改善效果
[0136]
为了在诱导脂肪肝的大鼠动物模型中了解植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6对肝健康的改善效果，对肝组织进行苏木精伊红染色并分析。如图1所示，与正常饮食组相比，高脂肪/高果糖饮食组因脂肪积聚而诱发非酒精性脂肪肝，通过肉眼观察可以确认，诱发非酒精性脂肪肝的脂肪肝通过植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6得到显著改善。并且，通过油红o染色再次确认到上述发现。
[0137]
3.附睾脂肪的脂肪球大小
[0138]
如图2所示，在对附睾脂肪进行苏木精伊红染色来比较时，确认到高脂肪/高果糖饮食组中的脂肪球变大，而附睾脂肪的脂肪球通过植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6变小。因此，可知植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6具有减少体脂的效果。
[0139]
4.作为肝损伤指标的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的酶活性
[0140]
为了了解植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6对肝功能和损伤的效果，测量了血清的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的酶活性。结果如图3a至图3c所示，可知因高脂肪/高果糖饮食增加的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶通过给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6得到统计学上显著的改善。
[0141]
5.测量血中脂质水平
[0142]
为了了解植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6与脂肪代谢的关联性，测量了血清中性脂肪、血清总胆固醇、血清高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、瘦蛋白、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶。
[0143]
结果如图4a至图4i所示，因高脂肪/高果糖饮食增加的血清中性脂肪、血清总胆固醇、空腹血糖、瘦蛋白，通过给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6得到显著减少。因高脂肪/高果糖饮食减少的高密度脂蛋白胆固醇、脂联素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶，在给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6时得到增加。尤其，在给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6时，显出高密度脂蛋白胆固醇比作为阳性对照组的水飞蓟素给药组增加的良好效果。
[0144]
6.测量肝组织的脂质代谢
[0145]
在肝组织中测量了作为脂质代谢相关标记物的肝组织的中性脂肪和总胆固醇。结果如图5a至图5c所示，因高脂肪/高果糖饮食增加的肝组织的中性脂肪、总胆固醇，通过给药发酵蔬菜来源的乳酸菌得到显著减少。并且，测量肝组织的脂质过氧化物的结果，可知因高脂肪/高果糖饮食增加的脂质过氧化物含量，在给药发酵蔬菜来源的乳酸菌时得到显著减少。
[0146]
7.分析脂质代谢相关指标信使核糖核酸的表达
[0147]
(1)为了了解发酵蔬菜来源的乳酸菌的分子机制，通过逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)和免疫印迹法(immunoblotting)检查脂质生成相关基因srebp-1c、脂肪酸合酶、c/ebp的表达。如图6a至图6f所示，通过分析结果可知与非酒精性脂肪肝诱导组相比，植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6给药组中的脂质代谢相关指标srebp-1c、脂肪酸合酶、c/ebp的信使核糖核酸的表达减少。
[0148]
(2)为了确认植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6给肝脂质代谢带来的影响，通过实施荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)测量与脂肪酸氧化相关的基因乙酰辅酶a羧化酶和肉毒碱棕榈酰转移酶的表达。如图7a-图7b所示，与非酒精性脂肪肝诱导组相比，植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6给药组的乙酰辅酶a羧化酶的信使核糖核酸的表达低，肉毒碱棕榈酰转移酶信使核糖核酸的水平高。
[0149]
为了确认植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6是否激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶的信号传递，进行了免疫印迹法分析。如图7c-图7d所示，处理植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6后，两种标记物种的磷酸化水平都提高了。并且，如图7e所示，与非酒精
性脂肪肝诱导组相比，植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6处理组中的肉毒碱棕榈酰转移酶蛋白的表达也提高了。
[0150]
8.测量肠内菌群的变化
[0151]
分析植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6给肠内微生物群落带来的影响。每个实验组各采集三个实验用试管的新鲜粪便后马上在-80℃的温度下冷冻。使用新一代碱基序列分析设备miseq platform从通过冷冻的试样中提取的宏基因组脱氧核糖核酸(metagenomic dna)中获得16s核糖体核糖核酸(rrna)的v3-v4区域的扩增子序列(amplicon sequence)，利用其分析由植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6引起的肠内菌群变化。
[0152]
如图8所示，确认到植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6乳酸菌处理实验组(k2、k6)与无处理实验组(nc)或水飞蓟素处理阳性(pc)对照组一样，增加拟杆菌门菌群，抑制厚壁菌门菌群，从而可以显出改变肠内菌群的作为益生菌的效果。
[0153]
到此，对与本发明一实施例的包含植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物相关的具体的实施例进行了说明，但应该明白的是，在不脱离本发明范围的情况下，可以由多种实施变形。
[0154]
因此，本发明的范围不应局限于说明的实施例来决定，而应由随附的发明要求保护范围以及与之同等的内容来决定。
[0155]
即，应该理解的是，前述的实施例仅为全面的例示，而非限定，比起详细的说明，本发明的范围在随附的发明要求保护范围中示出，应该理解的是，发明要求保护范围的含义、范围以及从其等价概念中导出的所有变更或变形的形态都应包括在本发明的范围中。
[0156]
产业上的可应用性
[0157]
本发明涉及包含从发酵蔬菜中分离的植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6作为有效成分的用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物，口服给药植物乳杆菌atg-k2或植物乳杆菌atg-k6后测量肝健康相关指标及抗肥胖指标的结果表明改善效果突出，因此可以轻松用作用于预防及治疗脂质相关代谢性疾病的组合物。
[0158]
序列表自由文本(free text)
[0159]
序列1为srebp-1c的用于实时逆转录聚合酶链式反应的正向引物碱基序列。
[0160]
序列2为srebp-1c的用于实时逆转录聚合酶链式反应的反向引物碱基序列。
[0161]
序列3为脂肪酸合酶的用于实时逆转录聚合酶链式反应的正向引物碱基序列。
[0162]
序列4为脂肪酸合酶的用于实时逆转录聚合酶链式反应的反向引物碱基序列。
[0163]
序列5为c/ebpα的用于实时逆转录聚合酶链式反应的正向引物碱基序列。
[0164]
序列6为c/ebpα的用于实时逆转录聚合酶链式反应的反向引物碱基序列。
[0165]
序列7为乙酰辅酶a羧化酶的用于实时逆转录聚合酶链式反应的正向引物碱基序列。
[0166]
序列8为乙酰辅酶a羧化酶的用于实时逆转录聚合酶链式反应的反向引物碱基序列。
[0167]
序列9为肉毒碱棕榈酰转移酶的用于实时逆转录聚合酶链式反应的正向引物碱基序列。
[0168]
序列10为肉毒碱棕榈酰转移酶的用于实时逆转录聚合酶链式反应的反向引物碱
基序列。
[0169]
序列11为β-肌动蛋白的用于实时逆转录聚合酶链式反应的正向引物碱基序列。
[0170]
序列12为β-肌动蛋白的用于实时逆转录聚合酶链式反应的反向引物碱基序列。