使用CCR3抑制剂改善视网膜相关疾病结果的方法与流程

physician，june 2020，p.e5)。
7.糖皮质激素递送的ivt也已在视网膜相关疾病患者中进行了探索。然而，抗vegf ivt治疗通常与较少的副作用和眼部并发症有关。(kuppermann bd et al.，ophthalmologica，234：40-54(2015))。例如，ivt递送的糖皮质激素可具有高发生率的白内障形成和类固醇诱导的青光眼。(hadayer a et al.，expert opin drug delivery，13(8)：1083-91(2016)和corpus k et al.，philipp j ophthalmol，40：52-56(2015))。此外，体内几乎所有细胞都对糖皮质激素敏感，产生人类健康不期望的多效性作用。(quatrini l et al.，cell mol immunol，18：269-78(2021))。
8.遗憾的是，每月ivt注射抗ivt已经与地图样萎缩的不良影响相关联。(desai，sj等人，《当前眼科报告》(curr opthalmol.rep.)(2017年2月01日))。在namd中，人们严重担心眼压升高和青光眼风险增加。(fowler sc和schneider ew，more frequent dosing for refractory namd？，retina specialist，may 13，2020)。此外，ivt注射可能与严重的不良事件有关，例如眼内炎、视网膜脱离和外伤性白内障。目前，没有有效的侵袭性较低的治疗方法，从而强调了对用于治疗amd(例如以口服形式)的非ivt递送的抗vegf类疗法的未满足需求。除了缓解和逆转症状以及对患者视敏度的显著有害影响之外，这类治疗还具有增加依从性的额外益处。ivt注射会增加成本和患者的风险，对患者和护理人员来说都是一种负担。对冷链和预装瓶和注射器的要求涉及大量的财务投资。即使以双月一次的方式进行注射，患者也经常需要更频繁地访问视网膜专家办公室进行诊断测试，以确保视网膜的稳定性。由于他们的视力状况，这些访问经常涉及护理人员。最近的估计表明，在开车时间、等待时间、治疗、康复和预约时间之间，每次就诊可能需要10多个小时的总时间。由于患者和护理人员的负担，医生和患者都试图创建“治疗和延长方案”，其减少注射和就诊的频率。然而，随着时间的推移，这些减少的注射频率会导致治疗结果的下降。
9.在已经探索对于抗vegf治疗辅助的糖皮质激素治疗的情况下，仍然存在实际和安全问题。眼内植入糖皮质激素(地塞米松)与ivt递送的抗vegf药物联合在降低新生血管性amd中抗vegf注射频率方面表现出适度的疗效；最好的情况是，辅助治疗可以将抗vegf注射之间的间隔延长不到30天。此外，眼植入物在植入物的使用期限内(例如，3-4个月)连续释放糖皮质激素，从而需要不断地暴露于受试者。(kuppermann，同上)。此外，植入物过期，需要将替代植入物侵入性地重新插入患者的眼睛中。(corpus，同上)
10.抗vegf治疗的机制基础也存在风险。vegf，特别是vegf-a在视网膜中具有生理细胞保护作用。调节vegf表达和活性可能对多种细胞类型有毒。(ambati，j.等人，《神经元》(neuron)75(1)：26-39，2012年7月)。有证据表明，抗vegf-a疗法还可以在短期内促进视网膜脉管系统的生理改变以及长期的rpe毒性。(papadopoulou dn等人，《眼科学》(ophthalmology)116(9)：1755-61(2009)；sacu s等人，《眼科研究与视敏度学》(invest.ophthalmol.vis.sci.)52(6)：3046-50(2011)；以及rofagha s等人《美国眼科学杂志》(am.j.ophthalmol.)159(5)：915-24(2015))
11.使用阿柏西普、雷珠单抗和贝伐单抗等抗vegf药物的另一个缺点是需要频繁给药，例如每月一次(q4wk)或每两个月一次(q8wk)，甚至频繁如每月两次。(peden mc et al.，retina specialist，jun：28-32(2016))。如此频繁的给药不仅导致更高的成本和对受影响眼睛的重复侵入性注射，而且大量患者已被证明在标准治疗后对抗vegf药物反应不佳
或无反应。此外，随着时间的推移，许多患者在反复施用后经历了抗vegf药物疗效的丧失，变得难以治疗。(id.)。通过光学相干断层扫描(oct)或血管造影术观察到，在51.5％的接受ivt雷珠单抗的患者和67.4％的接受ivt贝伐单抗的患者中，在每月注射两年后，视网膜持续存在流体。(id.)类似地，19.7％至36.6％的每月或每两个月接受一次ivt阿柏西普治疗的患者在1年后通过oct或血管造影术发现有活动性渗出。(id.)
12.尽管抗vegf疗法有望用于治疗包括namd在内的视网膜疾病，但仍需要新的药物和方法来克服ivt抗vegf药物的缺点。


技术实现要素：

13.本公开的方法通过使用c-c基序趋化因子受体3(ccr3)通路拮抗剂，通过在初治患者和难治患者中降低此类药剂的必要给药频率，在改善ivt抗vegf给药方案的结果方面出人意料地有效。与使用抗vegf剂、类固醇或两者组合的先前方法相比，这些方法提供了出乎意料地在稳健性和持久性方面更大的响应。接受小分子ccr3拮抗剂联合抗vegf药物治疗的初始患者需要显著更低频率的抗vegf药物剂量，而那些患有难治性疾病的患者令人惊讶地经历了重新开始的敏感性。
14.本公开提供了治疗患者的视网膜相关疾病的方法，包括例如干湿性年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变(伴有和不伴有黄斑水肿)、近视性脉络膜新生血管和地图样萎缩。所述方法的方面包括用ccl11/ccr3通路拮抗剂和抗vegf剂的给药方案治疗患者，以降低抗vegf剂的推荐频率。该方法还包括施用ccl11/ccr3通路拮抗剂以使患有难治性疾病的患者对抗vegf剂重新敏感。
15.本说明书中提及的所有公开和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如每个单独的公开或专利申请经特定并且单独地指示以引用的方式并入一般。
附图说明
16.图1、图2和图3是报告三名患有初始单侧wamd(即一只眼睛有wamd)的受试者基于snellen的视敏度比的图表。受试者分别称为患者病例1、患者病例2和患者病例3。x-轴描绘了化合物1 ccr3拮抗剂最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。图表顶部的注释注解了视网膜形态特征的变化，特别是中央凹，导致决定用抗vegf药物重新治疗。snellen视力表是临床实践中常用且公认的视敏度测试。参见aflibercept(eylea)：treatment of neovascular(wet)age-related macular degeneration(wamd)[互联网]。ottawa(on)：canadian agency for drugs and technologies in health；2015aug.附录5，validity of outcome measures。
[0017]
图4和图5报告了患有难治性双侧wamd(即双眼都有wamd)的受试者每只眼睛中基于snellen的视敏度比。受试者被称为患者病例4。x-轴描绘了化合物1最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。
[0018]
图6、图7和图8报告了在三名患有初始单侧wamd的受试者中读取的etdrs字母数量。x-轴描绘了化合物1最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。图表顶部的注释注解了视网膜形态特征的变化，特别是中央凹，导致决定用抗vegf药物重新治疗。读取的etdrs字母数量是从图1到3中基于snellen的视敏度比转换而
来的。参见beck rw et al.，am j ophthalmol.135.194-205(2003)。
[0019]
图9和图10报告了在患有难治性双侧wamd的受试者的两只眼睛中读取的etdrs字母数量。x-轴描绘了化合物1最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。图表顶部的注释注解了视网膜形态特征的变化，特别是中央凹，导致决定用抗vegf药物重新治疗。
[0020]
图11、图12和图13报告了三名患有初始单侧wamd的受试者的中央视网膜厚度(crt)。x-轴描绘了化合物1 ccr3拮抗剂最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。与前面的图一样，随着时间的推移，还记录了视网膜下液、视网膜内液和脉络膜新生血管(cnv)的状态。
[0021]
图14和图15报告了患有难治性双侧wamd的受试者的中央视网膜厚度。x-轴描绘了化合物1最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。随着时间的推移，还记录了视网膜下液、视网膜内液和脉络膜新生血管(cnv)的状态。
[0022]
图16、图17和图18报告了三名患有初始单侧wamd的受试者的中央视网膜色素上皮(rpe)脱离高度。x-轴描绘了化合物1 ccr3拮抗剂最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。与前面的图一样，随着时间的推移，还记录了视网膜下液、视网膜内液和脉络膜新生血管(cnv)的状态。
[0023]
图19和图20报告了患有难治性双侧wamd的受试者的中央视网膜色素上皮(rpe)脱离高度。x-轴描绘了化合物1 ccr3拮抗剂最后一剂施用后的时间。箭头报告了抗vegf药物在玻璃体内(ivt)施用时的时间。与前面的图一样，随着时间的推移，还记录了视网膜下液、视网膜内液和脉络膜新生血管(cnv)的状态。
[0024]
图21是描绘每个受试者的治疗顺序的图表。患者病例1至3(初始单侧受试者)在抗vegf ivt注射前每天两次(bid)接受口服化合物1，持续6周。抗vegf药剂次之间的时间以月(“mo”或“mos”)表示。抗vegf药剂次之间的平均月数在标有“未治疗的均值”的框中报告，括号中显示标准偏差(sd)。
[0025]
对于患有难治性双侧wamd的受试者(患者病例4)，在用化合物1治疗之前，左眼接受了11次抗vegf ivt治疗，右眼接受了18次抗vegf ivt治疗。(化合物1治疗后)剂次之间的平均月数在标有“难治性的均值(refract mean)”的框中报告。
[0026]
图22是报告受试者1-3(初始)和受试者4(难治性)的每只抗vegf ivt治疗眼的剂次之间的天数、剂次之间的月数(或自最后一次剂量以来)、没有抗vegf注射的平均月数和标准偏差、剂次之间的月数范围、每月剂次和每年剂次的表格。
[0027]
本说明书中提及的所有公开和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如每个单独的公开或专利申请经特定并且单独地指示以引用的方式并入一般。
具体实施方式
[0028]
将pct专利公开号wo2018/187473、美国专利申请号12/727,318、美国专利申请号13/596,225、美国专利申请号14/175,082、美国专利申请号13/267,417、美国专利申请号14/160,646、美国专利申请号14/572,889、美国专利申请号13/851,547、美国专利申请号13/851,564和美国专利申请号13/851538通过引用以它们的全部并入本文，如同在本文叙述。
[0029]
提供了治疗视网膜相关疾病症状的方法，所述方法包括施用来自下文论述的化合物和化学式的化合物以及抗vegf剂。本公开的一个方面包括降低向诊断患有视网膜相关病症或疾病例如湿性年龄相关性黄斑变性的受试者施用抗vegf剂的频率的方法，该方法包括：向受试者施用ccr3抑制剂；在施用ccr3抑制剂之后向受试者施用抗vegf剂；并且以低于推荐频率或在标准实践中给出频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂。在本公开的其他方面，以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂可以包括用各种不同的抗vegf剂代替一个或多个后续剂量。例如，第一个后续剂量可以是雷珠单抗，而一个或多个额外的后续剂量可以是贝伐单抗、阿柏西普或布洛赛珠单抗。因此，本公开考虑了混合抗vegf剂。在本公开的方面，当在初始施用中提供第一抗vegf剂并且在后续施用中提供第二抗vegf剂，并且第一和第二抗vegf剂不同时，在后续施用中的给药频率低于第二抗vegf剂的推荐频率(即，相比降低)或低于标准实践中给出的第二抗vegf剂的频率。
[0030]
本公开的其他方面包括使用ccr3拮抗剂作为ccr3抑制剂。本公开的其他方面包括使用嗜酸细胞活化趋化因子-1拮抗剂作为ccr3抑制剂。本公开的另一个方面包括使用小分子试剂作为ccr3抑制剂或ccr3拮抗剂。本公开的又一方面利用化合物1作为小分子试剂。本公开的另一方面利用不通过玻璃体内或其他类型的注射递送到眼睛中的ccr3抑制剂。本公开的另一方面利用口服施用至被诊断患有视网膜相关病症或疾病的受试者的ccr3抑制剂。
[0031]
本公开的其他方面包括利用针对血管内皮生长因子(vegf)的抗体或抗体片段。其他方面包括利用选择性结合或抑制vegf活性的所述抗体。此类抗体的实例可包括，作为示例而非限制，贝伐单抗、雷珠单抗和布洛赛珠单抗。本公开的其他方面包括使用重组融合蛋白作为抗vegf剂。此类融合蛋白可以是例如但不限于阿柏西普。
[0032]
本公开的另一方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中所述推荐频率大于或等于每十二个月十二剂次(即，在十二个月的窗口内施用大于或等于十二剂次)。其他方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率低于每六个月一剂次。其他方面包括向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率小于每五个月一剂次。其他方面包括向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率小于每四个月一剂次。其他方面包括向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率小于每三个月一剂次。额外的方面包括向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率小于每两个月一剂次。
[0033]
进一步的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月十一剂次。进一步的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月十剂次。进一步的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月九剂次。进一步的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月八剂次。额外的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月七剂次。
[0034]
额外的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月六剂次。额外的方面包括以低于推荐频率的频率
向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月五剂次。额外的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月四剂次。额外的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月三剂次。额外的方面包括以低于推荐频率的频率向受试者施用额外的后续剂量的抗vegf剂，其中推荐频率大于或等于每十二个月两剂次。本公开的另一方面包括上述频率的等同物(例如，每十二个月十二剂次的频率也可以理解为包括每月一剂次，每十二个月六剂次的频率也可以理解为包括每两个月一剂次等)。本公开的另一个方面包括不规则的给药频率(例如，每十二个月十二剂次的频率也可以理解为包括可能不遵循绝对规律的时间表的十二个月内十二剂次，例如在一个半月施用十二剂次中的两次，只要十二剂次全部在十二个月期间内施用)。本公开的另一个方面包括通过玻璃体内或其他方式，通过注射到眼睛中向受试者施用抗vegf剂。
[0035]
本公开的另一方面进一步包括观察或诊断被诊断患有湿性年龄相关性黄斑变性(或其他视网膜相关疾病)并在已施用ccr3/嗜酸细胞活化趋化因子-1通路拮抗剂如ccr3拮抗剂的给药方案后已接受一个或多个额外的后续剂量的抗vegf剂的受试者眼睛的形态或功能变化。换言之，在本文所述的任何方法中，该方法任选地进一步包括检查受试者的眼睛以检测眼睛的形态或功能变化。另一个方面进一步包括基于观察或诊断被诊断患有湿性年龄相关性黄斑变性或其他视网膜病症或疾病的受试者眼睛的形态或功能变化的结果，确定是否施用额外的后续剂量的抗vegf剂。任选地，本文所述的任何方法可进一步包括在检查受试者的眼睛后施用一个或多个剂次的抗vegf剂，或可包括延迟向受试者一次或多次进一步施用抗vegf剂。本公开的进一步方面包括前述方法，其中形态变化选自增加的视网膜内液、增加的视网膜内液、增加的脉络膜新生血管和增加的中央视网膜色素上皮脱离高度。本公开的另外方面包括前述方法，其中功能变化选自降低的视力。形态或功能特征的变化的类型和程度将很容易由医师或其他本领域普通技术人员确定。本公开的另外方面包括前述方法，其中功能变化选自中央视网膜厚度(crt)、中央黄斑厚度(cmt)或csf厚度的临床相关变化，csf厚度是指视网膜的中央1mm子域中的视网膜厚度。另一个方面包括临床相关的crt、cmt或csf的功能变化，如从光学相干断层扫描(oct)确定的。
[0036]
本公开的另一方面包括降低向诊断患有视网膜相关病症或疾病的受试者施用抗vegf剂的频率的方法，该方法包括同时施用抗vegf剂和ccr3抑制剂，其中抗vegf剂的施用频率低于推荐频率或在标准实践中给出的频率。另一方面包括前述的同时施用抗vegf剂与ccr3抑制剂，其中抗vegf剂的施用频率基于受试者眼睛中的形态或功能变化进行调整。额外的方面包括施用负荷剂量的抗vegf剂，并且从负荷剂量期开始向前同时施用ccr3抑制剂或在抗vegf负荷剂量期完成后开始同时施用ccr3抑制剂。
[0037]
本公开的又额外的方面包括首先向关于视网膜相关病症的治疗未接受治疗的受试者施用ccr3抑制剂，然后施用抗vegf剂。
[0038]
在本文所述的任何方法中，ccr3抑制剂可以在施用抗vegf剂的约360天内施用(例如，在施用抗vegf剂的约330天内、约300天内、约270天内、约240天内、约210天内、约180天内、约150天内、约120天内、约90天内、约75天内、约60天内、约45天内、约30天内、约14天内、约7天内、约3天内或约1天内)。例如，ccr3抑制剂可以在初始抗vegf剂施用之前约1-180天之间施用(即，在本公开的方法的上下文中，在初始向受试者施用抗vegf剂后六个月内、三
个月内、两个月内、一个月内、三周内、两周内或一周内)。在本文描述的方法的各个方面，可以施用ccr3抑制剂，直到受试者眼睛的形态或功能变化保证施用抗vegf剂。ccr3抑制剂的施用可以在开始抗vegf剂后继续，但这不是必需的。或者，该方法包括停止施用ccr3抑制剂。
[0039]
本公开进一步提供了一种治疗患有视网膜相关疾病的受试者的方法，该方法包括向患有视网膜相关疾病并且先前用ccr3抑制剂治疗的受试者施用抗vegf剂，其中所述抗vegf剂的施用频率低于抗vegf剂的推荐频率。任选地，受试者在施用抗vegf剂后六个月内用ccr3抑制剂治疗。
[0040]
本公开的其他方面包括前述方法，其中受试者已被诊断为例如但不限于干性黄斑变性(干性amd)、分枝(brvo)或中央(crvo)视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病、糖尿病视网膜病(伴有或不伴有黄斑水肿)、糖尿病黄斑水肿(dme)和地图样萎缩。
[0041]
a.ccr3拮抗剂
[0042]
i.化合物1及其类似物
[0043]
本公开的方法进一步包括向受试者施用化合物1。化合物1是ccr3的小分子拮抗剂，其特异性和选择性地结合ccr3。
[0044][0045]
化合物1的结构和化学类似物也被考虑用于本公开的方法中。此类类似物及其结构和化学式的实例可在以下文字中找到：pct专利公开号wo2018/187473、美国专利申请号12/727,318、美国专利申请号13/596,225、美国专利申请号14/175,082、美国专利申请号13/267,417、美国专利申请号14/160,646、美国专利申请号14/572,889、美国专利申请号13/851,547、美国专利申请号13/851,564和美国专利申请号13851538，其全部内容以引用的方式并入，如同在本文中阐述一样。
[0046]
在本文所述的任何方法中，ccr3抑制剂可包含式1的化合物：
[0047]
[0048]
其中
[0049]
a为ch2、o或n-c
1-6
烷基；
[0050]
r1选自
[0051]
·
nhr
1.1
、nmer
1.1
；
[0052]
·
nhr
1.2
、nmer
1.2
；
[0053]
·
nhch
2-r
1.3
；
[0054]
·
nh-c
3-6
环烷基，而任选地一个碳原子被氮原子置换，而所述环任选地被选自选自由以下组成的群组的一个或两个残基取代：c
1-6
烷基、o-c
1-6
烷基、nhso
2-苯基、nhconh-苯基、卤素、cn、so
2-c
1-6
烷基、coo-c
1-6
烷基；
[0055]
·c9或10
双环，而一个或两个碳原子被氮原子置换，并且所述环系统通过氮原子键结到式1的基本结构，而所述环系统任选地被选自由以下组成的群组的一个或两个残基取代：c
1-6
烷基、coo-c
1-6
烷基、c
1-6
卤烷基、o-c
1-6
烷基、no2、卤素、cn、nhso
2-c
1-6
烷基、甲氧基-苯基；
[0056]
·
选自nhch(吡啶基)ch2coo-c
1-6
烷基、nhch(ch2o-c
1-6
烷基)-苯并咪唑基的基团，其任选地被卤素或cn取代；
[0057]
·
或1-氨基环戊基，其任选地被甲基-噁二唑取代；
[0058]r1.1
为苯基，其任选地被一个或两个选自由以下组成的群组的残基取代：c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
卤烷基、c
1-6
亚烷基-oh、c
2-6
亚烯基-oh、c
2-6
亚炔基-oh、ch2con(c
1-6
烷基)2、ch2nhconh-c
3-6
环烷基、cn、co-吡啶基、conr
1.1.1r1.1.2
、coo-c
1-6
烷基、n(so
2-c
1-6
烷基)(ch2con(c
1-4
烷基)2)o-c
1-6
烷基、o-吡啶基、so
2-c
1-6
烷基、so
2-c
1-6
亚烷基-oh、so
2-c
3-6
环烷基、so
2-哌啶基、so2nh-c
1-6
烷基、so2n(c
1-6
烷基)2、卤素、cn、co-吗啉基、ch
2-吡啶基或杂环，所述杂环任选地被一个或两个选自由c
1-6
烷基、nhc
1-6
烷基和＝o组成的群组的残基取代；
[0059]r1.1.1
是h、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、c
1-6
卤烷基、ch2con(c
1-6
烷基，)2、ch2co-氮杂环丁烷基、c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基、ch
2-哌喃基、ch
2-四氢呋喃基、ch
2-呋喃基、c
1-6
亚烷基-oh或噻二唑基，其任选地被c
1-6
烷基取代；
[0060]r1.1.2
是h、c
1-6
烷基、so2c
1-6
烷基；
[0061]
或r
1.1.1
和r
1.1.2
一起形成四元、五元或六元碳环，其任选地含有一个置换所述环的碳原子的n或o，任选地被选自由c
1-6
烷基、c
1-4
亚烷基-oh、oh、＝o组成的群组的一个或两个残基取代；
[0062]
或者
[0063]r1.1
为苯基，其中两个相邻的残基一起形成五元或六元碳环芳族或非芳族环，其任选地彼此独立地含有一个或两个置换所述环的碳原子的n、s或so2，其中所述环任选地被c
1-4
烷基或＝o取代；
[0064]r1.2
选自
[0065]
·
杂芳基，其任选地被选自由以下组成的群组的一个或两个残基取代：c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基、ch2coo-c
1-6
烷基、conr
1.2.1r1.2.2
、cor
1.2.3
、coo-c
1-6
烷基、conh2、o-c
1-6
烷基、卤素、cn、so2n(c
1-6
烷基)2或任选地被选自由c
1-6
烷基组成的群组的一个或两个残基取代的杂芳基；
[0066]
·
杂芳基，其任选地被五元或六元碳环非芳族环取代，所述环彼此独立地含有两
个置换所述环的碳原子的n、o、s或so2；
[0067]
·
芳族或非芳族c
9或10
双环，而一个或两个碳原子被n、o或s置换，各自任选地被选自由n(c
1-6
烷基)2、conh-c
1-6
烷基、＝o组成的群组的一个或两个残基取代；
[0068]
·
杂环非芳族环，其任选地被吡啶基取代；
[0069]
·
4，5-二氢-萘并[2，1-d]噻唑，其任选地被nhco-c
1-6
烷基取代，
[0070]r1.2.1
是h、c
1-6
烷基、c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基、c
1-4
亚烷基-苯基、c
1-4
亚烷基-呋喃基、c
3-6
环烷基、c
1-4
亚烷基-o-c
1-4
烷基、c
1-6
卤烷基或五元或六元碳环非芳族环，其任选地彼此独立地含有一个或两个置换所述环的碳原子的n、o、s或so2，任选地被4-环丙基甲基-哌嗪基取代
[0071]r1.2.2
为h、c
1-6
烷基；
[0072]r1.2.3
是五元或六元碳环非芳族环，其任选地彼此独立地含有置换所述环的碳原子的一个或两个n、o、s或so2；
[0073]r1.3
选自苯基、杂芳基或吲哚基，其各自任选地被选自由以下组成的群组的一个或两个残基取代：c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、o-c
1-6
烷基、o-c
1-6
卤烷基、苯基、杂芳基；
[0074]
r2选自由以下组成的群组：c
1-6
亚烷基-苯基、c
1-6
亚烷基-萘基和c
1-6
亚烷基-杂芳基；其各自任选地被选自由以下组成的群组的一个、两个或三个残基取代：c
1-6
烷基、c
1-6
卤烷基、o-c
1-6
烷基、o-c
1-6
卤烷基、卤素；
[0075]
r3为h、c
1-6
烷基；
[0076]
r4为h、c
1-6
烷基；
[0077]
或r3和r4一起形成ch
2-ch2基团。
[0078]
化合物1的拮抗效力在几种人类ccr3依赖性测定中确定(参见wo2018/187473)。通过受体结合测定，确定化合物1的效力，ic
50
测量为4.0
±
1.8nm，且ki为3.2
±
0.6nm。使用人类ccr3转染的chem1-gα15细胞的钙流入测定的ic
50
测定为0.9
±
0.2nm。以ic
a0
为42.5
±
43.5nm实现化合物1对人类嗜酸细胞活化趋化因子-1的拮抗作用诱导人类全血中的嗜酸性细胞形状变化。
[0079]
还在不同的分析中确定了其它几种哺乳动物物种的效力。物种包括食蟹猴(猕猴)、小鼠、大鼠和犬科动物。关于受体结合测定，化合物1对小鼠ccr3的ki为124.3
±
0.9nm，且ic50为87.3
±
5.6nm。对于大鼠ccr3，本发明研究药物的ki为1488.6
±
127.6nm，且ic50为1719.0
±
129.9nm。
[0080]
ii.额外的ccr3拮抗剂
[0081]
1.小分子
[0082]
本公开的一个方面是ccr3小分子拮抗剂，其是人ccr3的有效和选择性拮抗剂。本公开的另一方面是ccr3小分子拮抗剂，其在一种或多种不同测定中表现出500nm或更低的抑制浓度50(ic50)。本公开的又一方面是ccr3小分子拮抗剂，其在一种或多种不同测定中表现出200nm或更低的抑制浓度50(ic50)。本公开的进一步方面是ccr3小分子拮抗剂，其在一种或多种不同测定中表现出100nm或更低的抑制浓度50(ic
a0
)。本公开的另一方面是ccr3小分子拮抗剂，其在一种或多种不同测定中表现出50nm或更低的抑制浓度50(ic
50
)。本公开的又一方面是ccr3小分子拮抗剂，其在一种或多种不同测定中表现出10nm或更低的抑制剂浓度50(ic
50
)。“ic
50”是激动剂配体诱导的响应减少一半的抑制剂浓度。本公开的一个方面
是响应可以是结合ccr3拮抗剂(包括小分子和抗体拮抗剂)的ccr3受体蛋白的活性、ccr3转染细胞中的钙流入、嗜酸性粒细胞形状改变、ccr3内化或趋化性(迁移)测定。
[0083]
确定ccr3小分子拮抗剂的ic
50
值的各种测定是本领域普通技术人员熟知的。
[0084]
嗜酸性粒细胞形状变化测定(esc)
[0085]
嗜酸性粒细胞响应免疫和趋化因子而发生剧烈的形状变化，这可以在嗜酸性粒细胞形状变化(esc)测定中进行测量。例如可以使用与30nmol/l的嗜酸细胞活化趋化因子-1在37℃下温育7分钟的全血样品进行测定。然后将样品在冰上固定20分钟，然后在室温下将红细胞裂解15分钟。esc是通过流式细胞仪使用前向散射(fsc)作为细胞大小的量度和侧向散射(ssc)作为粒度的量度来确定的。然后计算并绘制esc的抑制百分比以确定ic
a0
。
[0086]
ccr3内化
[0087]
ccr3配体诱导的内化是嗜酸性粒细胞对刺激信号的功能反应的关键步骤。可以使用与30nmol/l嗜酸细胞活化趋化因子-1在37℃下温育30分钟的血样来确定ccr3拮抗剂对ccr3内化的抑制作用。然后将样品与别藻蓝蛋白(apc)缀合的抗ccr3的抗体在室温下避光温育30分钟，然后进行红细胞裂解和细胞固定。然后清洗样品并通过流式细胞术分析fsc、ssc和apc荧光。然后计算并将ccr3内化的抑制百分比绘图。
[0088]
钙流入(钙动员)测定
[0089]
ccr3 ca
2
动员研究可以如前所述进行(white rj，et al.，j biol chem，275(47)：36626-31(2000))。可以使用负载fluo 3的rbl-2h3-ccr3细胞和使用荧光成像读板器(flipr)的基于微量滴定板的测定来进行该测定。rbl-2h3-ccr3细胞在有5％co2的t-150烧瓶中在含有10％胎牛血清的rpmi 1640培养基中在37℃生长至汇合。通过移除培养基从t-150烧瓶中移除细胞，然后在室温下用5ml的versene处理细胞5分钟。然后将细胞在rpmi 1640培养基、10％胎牛血清中洗涤一次，随后以40,000个细胞/孔接种到黑色无菌96孔中并温育18-24小时。在测定当天，除去培养基并用含有l-谷氨酰胺、0.1％牛血清白蛋白、4μm fluo-3乙酰氧基甲酯(fluo-3/am；molecularprobes，inc.，eugene，or)和1.5mm磺吡酮的earle盐的100μl earle基本必需培养基替换。然后将板在37℃下温育60分钟，去除培养基并用不含fluo-3/am的相同培养基替换，然后将板在37℃下温育10分钟。将细胞洗涤三次并在37℃下在含1.5mm磺吡酮的100μl测定缓冲液(120mm nacl，4.6mm kcl，1.03mm kh2po4，25mm nahco3，1.0mm cacl2，11mm葡萄糖，20mm hepes(ph 7.4)中温育。然后将板放入flipr中进行分析。定量加入激动剂(嗜酸细胞活化趋化因子-1)后荧光的最大变化。确定每种拮抗剂浓度的最大激动剂诱导的ca
2
动员百分比，ic
a0
定义为抑制了33nm嗜酸细胞活化趋化因子-1诱导的最大响应的50％的拮抗剂浓度。
[0090]
趋化性(迁移)测定
[0091]
嗜酸性粒细胞(表达ccr3)的趋化响应性可以使用chemotx
tm
板确定(参见wise el，j biol chem，282(38)：27935-43(2007))。在存在或不存在ccr3拮抗剂的情况下，将补充有0.1％bsa的rpmi的测定缓冲液装载重复浓度的激动剂。这些溶液以31μl的最终体积应用于趋化室的下部孔中。将过滤器放置到位，并将相同测定缓冲液中的2
×
105个嗜酸性粒细胞应用于上表面。在5％co2存在下(潮湿)37℃温育5小时后，计算穿过5μm孔过滤器的迁移嗜酸性粒细胞的数量，提供迁移的细胞数量。拮抗剂的抑制作用越大，观察到的迁移就越少。
[0092]
本公开的另一方面是在受体置换结合测定(也称为受体结合测定)中具有200nm或
更小的ki值的ccr3小分子拮抗剂。ki值是解离常数，它描述了抑制剂和受体之间的结合亲和力。本公开的额外方面是在受体置换结合测定中具有100nm或更小的ki值的ccr3小分子拮抗剂。本公开的又一额外方面是在受体置换结合测定中具有50nm或更小的ki值的ccr3小分子拮抗剂。本公开的又另外方面是在受体置换结合测定中具有10nm或更小的ki值的ccr3小分子拮抗剂。受体置换的ic50值也可以针对ccr3受体结合来确定，并且它是抑制50％的激动剂配体(嗜酸细胞活化趋化因子-1)与ccr3受体结合所需的拮抗剂浓度的量度。
[0093]
受体置换结合测定
[0094]
ccr3小分子拮抗剂的解离常数(ki)值可以使用本领域普通技术人员已知的技术确定。类似地，ccr3拮抗剂的ic
5o
值可以用这种技术确定。确定受体如ccr3的解离常数的受体置换结合测定的实例类似地使用放射性配体置换(参见warrior u，et al.，j biomol screening，8(3)：324-31(2003)和becker om et al.，pnas，101(31)：11304-309(2004))。首先在10μm浓度下用k562细胞膜(包含ccr3受体)和放射性配体重复测试未标记(冷)拮抗剂化合物。通过在10-10m(.1nm)和10-4m(.1mm)之间测量的全浓度剂量响应曲线验证在10μm时显示＞50％抑制的命中。放射性配体是[125i]嗜酸性细胞活化趋化因子(0.1nm，kd＝0.7nm)。
[0095]
因此，本公开考虑在本文所述方法的背景下使用其他小分子ccr3拮抗剂(而非本公开的化合物1及其类似物)。许多其他小分子ccr3拮抗剂是本领域普通技术人员已知的。这些包括由pease je和horuk r，expert opin drug discov，9(5)：467-83(2014)以及expert opin ther patents 19(1)(2009)公开的ccr3拮抗剂，例如(例如并且不限于)asm8、gsk766994、gw824575、dpc168、bms-639623、qap-642、azd3778、sb-328437、ym-344031、化合物80、化合物27、化合物32、ym 344484、化合物3a(astra zeneca)、化合物3b(astra zeneca)、az10565259、az12436092、2-(4-氟苯基)-4-(2-(1-异烟酰哌啶-4-基)-4-(4-硝基苯基)丁基)-1，5-二甲基-1，2-二氢-3h-吡唑-3-酮(astra zeneca)、化合物20(astra zeneca)和化合物60(astra zeneca)。本公开的方面可以使用这些分子作为小分子ccr3拮抗剂，作为ccr3抑制剂。
[0096]
本公开的其他方面包括在美国专利号7,705,153、美国专利号9,206,186、美国专利号8,030,303、美国专利号7,935,700和国际专利申请序列号pct/ep2004/002496中公开的小分子作为小分子ccr3拮抗剂的施用。
[0097]
本公开考虑了其中ccr3抑制剂包含来自下表的ccr3拮抗剂化合物的方面：
[0098]
[0099]
[0100]
[0101][0102]
本公开进一步考虑了这样的方法：其中ccr3抑制剂由以下小分子ccr3拮抗剂之一组成(在美国专利号10,130,634(吗啉化合物)和7,935,700(吗啉化合物)中进一步描述，其ic 50值低于50nm，许多低于10nm，这些文献通过引用整体并入本文，特别是关于它们对以下化合物的描述)：
[0103]
(2s)-[4-(羧甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺
[0104]
(2s)-[4-(羧甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺氢溴酸盐
[0105]
(2s)-[4-(3-氨基苯基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0106]
(2s)-[4-(3-氨基甲酰基-4-羟基苯基)噻唑-2-基硫基]n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0107]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}[4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺，
[0108]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}[4-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺，
[0109]
(2s)-(4-氨基甲酰基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0110]
(2s)-{4-[(2-氨基-2-氧乙基)氨基羰基]噻唑-2-基-硫基}-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0111]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}[4-(5-甲基-1，2，4-噁二唑-3-基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺盐酸盐，
[0112]
(2s)-(5-氨基-8h-茚并[1，2-d]噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0113]
(2s)-(4-羧基苯硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0114]
(2s)-{4-[(2-氨基-2-氧乙基)氨基羰基]苯硫基}n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0115]
(2s)-{4-[(2-羧乙基)氨基羰基]噻唑-2-基硫基}n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺盐酸盐，
[0116]
(2s)-(5-乙酰氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0117]
(2s)-4-(4-氨基甲酰基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}丁基酰胺盐酸盐，
[0118]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}[4-(1h-四唑-5-基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺，
[0119]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}([1，3]噻唑并[5，4-b]吡啶-2-基硫基)乙酰胺，
[0120]
(2s)-(e)-[4-(2-氨基甲酰基乙烯-1-基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0121]
(2s)-[4-(氨基甲酰基甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0122]
(2s)-[4-(氨基甲酰基甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0123]
(2s)-(4-羧基-5-甲基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0124]
(2s)-(4-氨基甲酰基-5-甲基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0125]
(2s)-(4-氨基甲酰基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3-氯-4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0126]
(2s)-[4-(2-氨基-2-氧乙基)氨基羰基噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0127]
(2s)-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3-氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0128]
(2s)-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0129]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}(嘧啶-2-基硫基)乙酰胺，
[0130]
(2s)-(3-乙酰基-2-氧代-2h-色烯-6-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0131]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}(6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基硫基)乙酰胺，
[0132]
(2s)-[6-(氨基甲酰基甲基)吡嗪-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0133]
(2s)-4-(环戊磺酰基)-n-{[4-(3-氯-4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}丁基酰胺，
[0134]
(2s)-[4-(羧甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0135]
(2s)-[4-(羧甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺氢溴酸盐，
[0136]
(2s)-[4-(2-羧基丙-2-基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0137]
(2s)-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0138]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}-(6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基硫基)乙酰胺，
[0139]
(2s)-[4-(羧甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0140]
(2s)-[4-(羧甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0141]
(2s)[4-(3-氨基苯基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0142]
(2s)-[4-(3-氨基甲酰基-4-羟基苯基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0143]
(2s)-n{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}-[4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基硫基]
乙酰胺，
[0144]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}-[4-(3，4-二甲氧基苯基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺，
[0145]
(2s)-(4-氨基甲酰基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0146]
(2s)-{4-[(2-氨基-2-氧乙基)氨基羰基]噻唑-2-基硫基}-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0147]
(2s)-n{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}-[4-(5-甲基-1，2，4-噁二唑-3-基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺盐酸盐，
[0148]
(2s)-(5-氨基-sh-茚并[1，2-d]噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0149]
(2s)-(4-羧基苯硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0150]
(2s)-{4-[(2-氨基-2-氧乙基)氨基羰基]苯硫基}-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0151]
(2s)-{4-[(2-羧乙基)氨基羰基]噻唑-2-基硫基}n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺盐酸盐，
[0152]
(2s)-(5-乙酰氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0153]
(2s)-4-(4-氨基甲酰基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}丁酰胺盐酸盐，
[0154]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}-[4-(1h-四唑-5-基)噻唑-2-基硫基]乙酰胺，
[0155]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}-([1，3]噻唑并[5，4-b]吡啶-2-基硫基)乙酰胺，
[0156]
(2s)-(e)-[4-(2-氨基甲酰基乙烯-1-基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0157]
(2s)-[4-(氨基甲酰基甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0158]
(2s)-[4-(氨基甲酰基甲基)噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0159]
(2s)-(4-羧基-5-甲基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0160]
(2s)-(4-氨基甲酰基-5-甲基噻唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0161]
(2s)-(4-氨基甲酰基噻唑-2-基硫基)-n-{5[4-(3-氯-4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0162]
(2s)-[4-(2-氨基-2-氧乙基)氨基羰基噻唑-2-基硫基]-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0163]
(2s)-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3-氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙
酰胺，
[0164]
(2s)-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0165]
(2s)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}-(嘧啶-2-基硫基)乙酰胺，
[0166]
(2s)-(3-乙酰基-2-氧代-2h-色烯-6-基硫基)-n-{[4-(3，4-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0167]
(2s)-n{[4-(3，4-二氟苄基)吗啉-2-基]甲基}-(6-氧代-1，6-二二氢哒嗪-3-基硫基)乙酰胺，
[0168]
(2s)-[6-二氯苄基)吗啉-2-基]甲基}乙酰胺，
[0169]
(2s)-4-(环戊磺酰基)-n-{[4-(3-氯-4-氟苄基)吗啉-2-基]甲基}丁酰胺。
[0170]
本公开进一步考虑了这样的方法：其中ccr3抑制剂由以下苯氧基或苯磺酰胺小分子ccr3拮抗剂之一组成(在美国专利号9,206,186中进一步描述，通过引用整体将其并入本文，特别是关于其对以下化合物的描述)，所有这些化合物的结合ic
50
均小于100nm，钙流入测定ic
50
小于100nm：
[0171]
n-(r)-( )-(1-氮杂-双环[2.2.2]辛-3-基)-5-氰基-2-(3，5-二氯-苯氧基)-苯磺酰胺，
[0172]
5-氰基-2-(3，5-二氯-苯氧基)n-(2-二甲氨基-乙基)-n-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)乙基]-苯磺酰胺，
[0173]
4-(3，5-二氯-苯氧基)-3-[(3s)-(1h-吲哚-3-基甲基)-哌嗪-1-磺酰基]-苄腈，
[0174]
4-(3，5-二氯苯氧基)-3-{[2-(1h-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1-哌嗪基]磺酰基}苄腈盐酸盐。
[0175]
本公开还考虑了这样的方法：其中ccr3抑制剂由美国专利号7,705.153所述的双哌啶ccr3拮抗剂组成，该专利通过引用整体并入本文，其全部都表现出3nm和50nm之间的ki值。
[0176]
2.抗体
[0177]
任选地，本公开的方法包括向受试者施用对ccr3或其配体嗜酸细胞活化趋化因子-1/ccl11特异的抗体。此类抗体是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于mab320-sp和mab155-sp(r&d systems，minneapolis，mn)、ma5-23831(thermofisher scientific，waltham，ma)和cat#12-1939-42(invitrogen，waltham，ma)。其他实例可以在senechal s et al.，lab investig 82：929-39(2002)和williams tj，front.immunol.6(84)(2015)中找到(cat-213，ico-008，贝替木单抗)。抗体可以全身施用(例如，iv)或通过ivt注射施用。
[0178]
b.共晶体和盐、制剂、剂型/成分和剂量
[0179]
本公开进一步考虑了其中化合物1或其类似物的共晶体和盐作为ccr3抑制剂施用的方面。本公开进一步考虑了使用化合物1及其类似物的制剂的方面。化合物1及其类似物(或本文所述的任何ccr3抑制剂)的各种剂型、成分和剂量的用途也被本公开考虑并且适用于本文所述的任何方法中。这些方面的实例可以在pct专利公开号wo2018/187473、美国专利申请号12/727,318、美国专利申请号13/596,225、美国专利申请号14/175,082、美国专利申请号13/267,417、美国专利申请号14/160,646、美国专利申请号14/572,889、美国专利申
请号13/851,547、美国专利申请号13/851,564和美国专利申请号13851538中找到，将它们通过引用并入，如同本文所述。
[0180]
c.定义
[0181]
本文未具体定义的术语应当给出本领域技术人员将根据本公开和上下文给出的含义。然而，如说明书中所使用的，除非有相反的说明，否则以下术语具有指示的含义并遵守以下约定。
[0182]
术语“约”表示指定值的多于或少于5％。因此，大约100分钟也可以读为95到105分钟。
[0183]
必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如本文中和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括多个此类细胞并且提及“肽”包括提及一种或多种肽及本领域技术人员已知的其等价物，例如多肽，等等。
[0184]
在描述本发明的方法时，术语“宿主”、“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，是指根据所公开的方法需要这种治疗的任何哺乳动物。这样的哺乳动物包括例如人类、绵羊、牛、马、猪、犬科动物、猫科动物、非人类灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些方面，受试者是非人类哺乳动物。在一些方面，受试者是农场动物。在其他方面，受试者是宠物。在一些方面，受试者是哺乳动物。在某些情况下，受试者是人。其他受试者可以包括家养宠物(例如，狗和猫)、家畜(例如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠，例如，在疾病动物模型中)以及非人类灵长类动物(例如黑猩猩和猴子)。因此，本发明的受试者包括但不限于哺乳动物，例如人类和其他灵长类动物，例如黑猩猩和其他猿类和猴类；等等，其中在某些方面受试者是人类。术语受试者还意在包括任何年龄、体重或其他身体特征的人或生物体，其中受试者可以是成人、儿童、婴儿(包括早产儿)或新生儿。
[0185]
如本文所用，“治疗”是指(i)疾病或病症的预防，或(ii)疾病或病症的症状的减轻或消除中的任一种。治疗可以是预防地(在疾病发作之前)或治疗地(在疾病发作之后)实现的。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。因此，本文所用的术语“治疗(treatment)”涵盖对哺乳动物中与年龄相关的疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病的消退。治疗可导致多种不同的身体表现，例如基因表达的调节、组织或器官的再生等。治疗剂可在疾病发作之前、期间或之后施用。正在发生的疾病的治疗，其中治疗稳定或减少患者的不期望临床症状，是特别令人感兴趣的。此类治疗可以在受影响组织中的功能完全丧失之前进行。可以在疾病的症状阶段期间，并且在一些情况下，在疾病的症状阶段之后，施用主题疗法。
[0186]
如本文所用，术语“推荐频率”是指由监管机构批准的无论是产品标签还是其他文件都已强制或建议的药剂随时间的施用速率。所述监管机构可以是例如美国食品药品监督管理局、欧洲药品管理局、药品和医疗器械管理局(日本)、中国食品药品监督管理局或其他类似的国家或地区当局。对于标签外或批准前或未经批准的使用，“推荐频率”是指如本领域普通技术的医疗保健提供者对于适应症普遍认可的药剂随时间的施用速率，无论是该领域的专家推荐的还是在一般惯例中使用的。在这两种情况下，该术语还包括如本领域普通
技术人员所理解的在标准实践中给出的频率。
[0187]
如本文所用，术语“负荷剂量”是指向受试者施用每月剂量的抗vegf剂持续不超过六个月的时间段，随后是可变给药方案的实践。因此，术语“负荷剂量”包括(但不限于)在六个月的过程中施用六剂次，在五个月的过程中施用五剂次，在四个月的过程中施用四剂次，在三个月的过程中施用三剂次，或在两个月的过程中施用两剂次。在本公开的一个示例性方面，该方法包括施用抗vegf剂的初始“负荷剂量”，其包括施用三次的月剂次(即，每三个月每月一剂次)，然后以在剂次之间改变的频率施用随后的额外剂次的抗vegf剂(即，间隔不是每月一次，和/或低于抗vegf剂的推荐给药频率)。可变给药方案可以是prn(临时(pro re nata)或根据需要)或遵循规定的方案，例如每两个月或每三个月给药一次。(schmidt-erfurth u et al.，br j ophthalmol，，98：1144-67(2014)和ba j et al.，drug design，develop therapy，9：5397-405(2015))。在各个方面，可变给药方案不包括每月施用抗vegf剂。
[0188]
阿柏西普
[0189]
用于新生血管(湿性)amd的源自fda批准标签的阿柏西普推荐频率(可在www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2017/125387s054lbl.pdf在参考id 4102905下获得，通过引用并入本文)是前3个月每4周(每月)通过玻璃体内注射2mg(0.05ml)(负荷剂量)，随后是每8周(2个月)通过玻璃体内注射2mg(0.05ml)。根据标签，虽然阿柏西普可以每4周2mg那么频繁地给药，但当阿柏西普每4周给药时，与每8周给药相比，大多数患者并未显示出额外的疗效。一些患者可能需要在前12周(3个月)后每月给药。
[0190]
对于阿柏西普的最常见用途namd，标记剂量将导致每年7-8剂(每月1剂)。正如在引言中提到的，由于使用负担，抗vegf剂的标记使用并不总是与这些药剂在实践中的使用相关联。两项回顾性分析评估了接受ivt抗vegf治疗的初治新生血管性amd患者的两个大型诉求(claims)数据库。评估了抗vegf治疗的强度及其与namd患者视敏度变化的关系。在阿柏西普治疗的第一年，每位患者每年的平均注射次数为5.1(每月.43)至7.3(每月0.61/中位数为7(每月0.58)，反映了治疗负担和延长治疗持续时间的愿望。第二年，注射4.8次(每月0.4)，但视力仍然下降。(maccumber m，yu，js，sagkriotis a，et al.injection intervals in treatment-naive neovascular amd patients who received anti-vegf agents：an analysis of the iris registry.american academy of ophthalmology，san francisco，2019：po471)。
[0191]
经确定，与接受固定、频繁的抗vegf治疗的患者相比，接受较少抗vegf注射的患者经历了视觉结果更差。(ciulla ta et al.，ophthalmology retina，4：19-30(2020))。此外，即使在这种次优治疗模式下，诉求数据库中超过33％的患者在治疗的第一年和第二年都要求阿柏西普的治疗频率低于8周，这表明需要频繁的随访和注射。
[0192]
对于静脉阻塞(rvo)后的黄斑水肿，阿柏西普的推荐剂量为2mg(0.05ml)，每4周(每月)通过玻璃体内注射施用。
[0193]
对于糖尿病性黄斑水肿(dme)，阿柏西普的推荐剂量是前5次注射，每4周(每月)通过玻璃体内注射施用2mg(0.05ml)，然后每8周(2个月)一次玻璃体内注射2mg(0.05ml)。根据标签，虽然阿柏西普可以每4周(每月)2mg那么频繁地给药，但当阿柏西普每4周给药时，与每8周给药相比，大多数患者并未显示出额外的疗效。一些患者在前20周(5个月)后需要
lucentis，最多三个月，如果需要，患者可以再治疗。
[0202]
对于雷珠单抗的最常见用途，标记剂量将导致每年12剂(每月1剂)。正如在引言中提到的，由于使用负担，抗vegf剂的标记使用并不总是与这些药剂在实践中的使用相关联。两项回顾性分析评估了接受ivt抗vegf治疗的初治新生血管性amd患者的两个大型数据库。评估了抗vegf治疗的强度及其与namd患者视敏度变化的关系。在雷珠单抗治疗的第一年，每位患者每年的平均注射次数为4.9(0.41)至7.3(每月0.61，中位数为7(每月0.58)，反映了治疗负担和延长治疗持续时间的愿望。第二年，注射4.5次(每月0.38)，但视力仍然下降。maccumber m，yu，js，sagkriotis a，et al.injection intervals in treatment-neovascular amd patients who received anti-vegf agents：an analysis of the iris registry.american academy of ophthalmology，san francisco，2019：po471。经确定，与接受固定、频繁的抗vegf治疗的患者相比，接受较少抗vegf注射的患者经历了视觉结果更差。(ciulla ta et al.，ophthalmology retina，4：19-30(2020))。
[0203]
布洛赛珠单抗
[0204]
用于新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性(wamd)的源自fda批准标签的布洛赛珠单抗推荐频率(可在www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2019/761125s000lbl.pdf在bla参考id 761125下获得，通过引用并入本文)为前三剂每月6mg(0.05ml的120mg/ml溶液)(大约每25-31天)(负荷剂量)，然后是每8-12周(由医师决定)一剂6mg(0.05ml)。布洛赛珠单抗是一种人血管内皮生长因子(vegf)抑制剂，在单剂量小瓶中通过玻璃体内注射施用。布洛赛珠单抗与vegf-a的三种主要同工型(例如vegf110、vegf121和vegf165)结合，这阻止与受体vegfr-1和vegfr-2的相互作用。这抑制了内皮细胞增殖、新血管形成和血管通透性。布洛赛珠单抗也正在研究用于治疗糖尿病性黄斑水肿(dme)和继发于视网膜静脉阻塞的黄斑水肿。对于dme，试验每4周使用6mg/0.05ml，持续12个月(可在www.clinicaltrials.gove/ct2/show/nct03917472登录号nct03917472下获取，将其通过引用并入本文)。它还在研究用于治疗糖尿病性视网膜病变(dr)，剂量为6mg，三次，间隔6周(3x q6w)，然后每12周一次，共93周(www.clinicaltrials.gov/ct2/show/nct04278417登录号nct04278417，将其通过引用并入本文)。布洛赛珠单抗也被研究作为视网膜静脉阻塞的治疗方法，包括分支视网膜静脉阻塞(brvo)和中央视网膜静脉阻塞(crvo)。对于brvo，治疗为每4周6mg，共注射6次，随后进行48周的个体灵活治疗(ift)(www.clinicaltrials.gov/ct2/show/nct03802630登录号nct03802630，将其通过引用并入本文)。对于crvo，治疗也是每4周6mg，共注射6次，随后进行48周的个体灵活治疗(ift)(www.clinicaltrials.gov/ct2/show/nct03810313登录号nct03810313，将其通过引用并入本文)。
[0205]
因此，“以低于推荐频率的频率”或“以低于标准实践中给出的频率的频率”是指，在本公开的各个方面，抗vegf剂的后续施用的施用时间间隔长于推荐的剂次频率或标准实践中给出的剂次频率所采用的剂次之间的时间。在各个方面，剂次之间的时间比抗vegf剂的推荐给药频率中的剂次之间的时间长至少30天。例如，剂次之间的时间任选地是至少(或大于)四周、至少(或大于)六周、至少(或大于)八周、至少(或大于)10周、至少(或大于)12周、至少(或大于)14周、或至少(或大于)16周。在各个方面，剂次之间的时间任选地比推荐的给药频率长至少四周，比推荐的给药频率长至少六周，比推荐的给药频率长至少八周，比
推荐的给药频率长至少10周，比推荐的给药频率长至少12周，比推荐的给药频率长至少14周，或比推荐的给药频率长至少16周。因此，仅用于说明，fda推荐的布洛赛珠单抗给药方案是每8-12周一剂6mg(0.05ml)，并且本方法包括施用ccr3抑制剂，在施用ccr3抑制剂后向受试者施用布洛赛珠单抗，然后施用额外的后续剂量的布洛赛珠单抗，使得剂次之间的时间例如超过12周(导致给药频率低于推荐频率)。
[0206]
如本文所用，与抗vegf治疗相关的术语“难治性”是指对持续ivt施用抗vegf剂表现出不完全、差或下降的响应或者尽管积极治疗延长的时间期间但仍抗治疗的受试者。该术语还包括分类为对抗vegf无响应、不响应、顽固或抗性的受试者，或对抗vegf表现出耐受性、对抗vegf治疗表现出快速耐受性或对抗vegf治疗顽固的受试者。该术语还包括，例如，受namd影响的受试者的眼睛尽管至少每月连续注射三至五次抗vegf药物仍显示出持续的液体收集，在至少6个月的常规抗vegf治疗后持续渗出，在以每月间隔六次ivt注射抗vegf剂中的最后一次后超过30天时光谱域oct(sd-oct)上的持续液体，以及在临床检查和成像研究中明显的持续渗出(荧光素血管造影术或纤维血管色素上皮脱离(ped)上泄漏，sd-oct上有视网膜内液(irf)或视网膜下液(srf))或与基线相比，以每月间隔连续注射六次后出血增加。(参见例如yang s et al.，drug design，development and therapy，10：1857-67(2016))。
[0207]
d.视网膜相关疾病适应症
[0208]
i.黄斑变性
[0209]
黄斑变性是用于描述疾病家族的术语，所述疾病的特征都在于与脉络膜、布鲁赫膜、视网膜色素上皮细胞和/或神经视网膜异常相关的中心视敏度的进行性丧失。这些病症包括影响老年受试者的非常常见的病状-例如年龄相关性黄斑变性(amd)以及在某些情况下可以在生命的前十年中检测到的罕见的早期发作的营养不良。其他黄斑病变包括北卡罗来纳州黄斑营养不良、贝斯特氏症(best disease)和malattia leventinese。
[0210]
amd是65岁以上个体永久性视敏度丧失的主要原因，目前影响约1500万美国人。amd影响黄斑中的光敏感光细胞和色素上皮细胞，黄斑是眼睛视网膜的中心。虽然早期病例可能不会导致完全失明，但是这种疾病会破坏中心视敏度，使阅读、观看电子显示器屏幕和驾驶困难到不可能。它没有治愈记录，从未表现出自发缓解，并且有效治疗受到限制，患者和护理人员承受相当大的负担，还有副作用，并且必须持续个体寿命的持续时间。
[0211]
视网膜是神经细胞的复杂网络，其将光变成神经冲动，其传递到大脑，在那里它们被解释为视觉图像。视网膜的中央部分称为黄斑，负责阅读和其它详细工作所需的视敏度。黄斑的损伤导致视敏度不佳。影响黄斑的最常见疾病过程是amd。在患有amd的患者中，黄斑中的视网膜光感受器和色素上皮细胞在数年内死亡。细胞死亡和逐渐视敏度丧失通常直到60岁或以上才开始，因此称为年龄相关的黄斑变性。
[0212]
有两种类型的amd：干性黄斑变性和湿性黄斑变性。干性黄斑变性虽然更常见，但通常导致不太严重，更渐进的视敏度丧失。受早期或中间干性amd影响的患者由于感光细胞及其紧密相关物视网膜色素上皮(rpe)细胞的死亡而导致中央视敏度逐渐丧失，其中沉积了复杂的蜡质淀粉样蛋白混合物，称为
‘
玻璃疣’。光感受器，作为视网膜中实际上
‘
看到’光的细胞，对视敏度至关重要。巨噬rpe细胞是光感受器存活、起作用和更新所必需的。干性amd的晚期形式，称为地图样萎缩，约占amd的10-15％。地图样萎缩(ga)导致光感受器、rpe
和下面的脉络膜毛细血管萎缩。这些萎缩性暗点通常从外围开始，但随着时间的推移会形成一个环，最终会在中央凹周围闭合，导致完全失明。患者最初表现为周边视觉盲点逐渐增大，导致严重的视力障碍。ga可导致失明，而不会发展为新生血管性或湿性amd。目前没有治疗地图样萎缩的方法。患有湿性黄斑变性的患者在视网膜下形成新血管。随着光感受器和rpe细胞缓慢退化，血管倾向于从脉络膜中的正常位置生长到视网膜下方的异常位置。这种异常的新血管生长称为脉络膜新生血管(cnv)。异常血管渗漏和出血，导致出血、肿胀、瘢痕组织和严重的中央视敏度丧失。只有10％的amd患者有湿型或渗出型，但它引起amd所致的所有失明的90％。ccr3抑制剂的用途之一是治疗由诸如wamd、damd和地图样萎缩等疾病引起的炎症和新血管形成(通过特定机制)。
[0213]
ii.视网膜静脉阻塞(rvo)
[0214]
在静脉阻塞阻止氧气耗尽的血液流出眼睛的脉管系统时发生视网膜静脉阻塞，也称为rvo。由于眼睛中氧气耗尽的血液流量减少，富氧血液被抑制无法到达视网膜的表面层，导致缺氧状态。作为响应，视网膜的表面层产生促血管生成因子，其促成异常黄斑水肿和新血管形成的发展。对于静脉闭塞的位置，rvo可称为crvo(中央)或brvo(分支)。ccr3抑制剂的用途之一是治疗由rvo引起的黄斑水肿和新血管形成。
[0215]
iii.糖尿病性视网膜病变
[0216]
糖尿病视网膜病变是糖尿病的并发症，可导致失明。糖尿病视网膜病变可在患有1型或2型糖尿病的受试者中出现，这与失去对血糖含量的控制有关。长期缺乏血糖控制会导致视网膜血管受损，最终通过新血管形成的信号传导对视网膜组织造成损害，从而导致炎症、疤痕和水肿。随后对这些血管的生长进行不适当的调节，导致血管容易泄漏。在早期形式疾病中可能不明显的症状包括受试者视敏度中的斑点或飞蚊症、视敏度模糊、视敏度波动、色觉受损、视野暗/空白区域和视敏度丧失，通常影响双眼。
[0217]
存在两种类型的糖尿病性视网膜病变：早期糖尿病性视网膜病变，或非增殖性糖尿病性神经病变(npdr)和晚期糖尿病性视网膜病变或增殖性糖尿病性神经病变。npdr的特点是新生血管形成和血管生长不太明显；然而，视网膜血管壁变弱并且可能出现微动脉瘤。这些微动脉瘤会突出并将液体和血液泄漏到视网膜中。随着越来越多的血管被阻塞，npdr变得更加严重。视网膜神经纤维以及黄斑(视网膜的中央部分)会肿胀，这种病状称为黄斑水肿。在晚期糖尿病性视网膜病变(或增生性糖尿病性视网膜病变)中，已经受损的血管关闭，导致新的异常血管生长，并且出血并渗入眼睛的玻璃体变得更常见。由新血管生长引起的瘢痕组织会导致视网膜脱离以及眼压升高-最终导致视神经和青光眼的损伤。当视网膜内有液体渗漏时，这称为糖尿病性黄斑水肿(dme)，这是pdr的后遗症，其在视网膜下方或内部积聚液体，导致视力丧失。
[0218]
dme虽然在dr级联反应中是晚期，但通常是糖尿病性视网膜病变的首发症状。这是将患者带到医生处的常见症状，因为它是糖尿病性视网膜病变的急性、常见表现。目前的抗vegf药物已经标记了dme和/或糖尿病性视网膜病变的适应症。尽管在讨论dr的潜在疾病时这两个术语有时可以互换使用，但dr包含范围更广的无症状到非常严重和立即威胁视力的疾病，类似于术语amd。ccr3抑制剂的用途之一是治疗由dr和dme引起的黄斑水肿和新血管形成。
[0219]
iv.近视性cnv
[0220]
病理性近视或近视力会由于视网膜层的拉伸而导致脉络膜新生血管形成，从而导致新血管的产生。这种疾病可以发生在年轻患者身上，但在老年患者中更为常见。raecker me et al.，diagnosis and treatment of cnv in myopic macular degeneration，eyenet mag，(apr2015)：35-37。ccr3抑制剂的用途之一是治疗由cnv引起的新血管形成。
[0221]
v.早产儿视网膜病变
[0222]
影响早产婴儿，早产儿视网膜病变(rop)是一种与氧毒性和局部缺氧相关的眼病。这些病状被认为促进rop的发展。所述疾病的潜在病理生理学是缺氧条件导致刺激促血管生成因子，从而导致血管的无序生长，导致瘢痕形成和视网膜脱离。一些患有rop的患者可以使其处于轻度状态并且在没有治疗干预的情况下完全恢复，但在其他患者中它可以导致永久性失明。所述疾病的确切原因尚不清楚，但主要的假设是补充氧气通过血管收缩引起局部视网膜缺氧，引发新血管形成，或正常血管过程被补充氧气减弱，但当突然切除时导致血管迅速增殖和纤维血管疾病。手术和治疗干预是目前治疗该疾病严重形式的疗法。手术治疗可以包括巩膜扣带术和/或玻璃体切除术治疗视网膜脱离，以及一些低剂量抗vegf治疗的实验，尽管抑制vegf在婴儿中的长期影响尚不清楚，因为它在婴儿整个快速生长的身体中的血管生成中具有广泛作用。然而，激光诱导的光凝固是目前rop治疗的主要方法。ccr3抑制剂可用于预防与rop相关的新血管形成。
[0223]
e.改善视网膜相关疾病的诊断和监测方法
[0224]
i.引言
[0225]
本公开进一步提供了诊断视网膜相关疾病的方法。这类方法可以包括，例如但不限于，视敏度(va)测试(包括但不限于最佳校正视敏度)、黄斑变性或阿姆斯勒方格表(amsler grid)、具有扩张瞳孔的视网膜检查、眼底照相、荧光血管造影术或光学相干断层扫描(oct)，其可以确定此类终点为视网膜中央厚度(crt)。本文所述的任何技术可用于检查受试者的眼睛以确定是否需要使用抗vegf剂进行治疗。
[0226]
ii.视敏度(va)
[0227]
可以诊断或确定疾病进展/改善的一种方法是测试视敏度。用于测试视敏度的方法是本领域普通技术人员所熟知的。视敏度测试受试者视敏度的清晰度，通常使用“视敏度表”，其中最常见的是斯内伦测视敏度图(snellen eye chart)。其它视敏度测试方法包括使用早期治疗糖尿病视网膜病变研究(etdrs)图表，与其它va测试一样，可用于诊断和测量患有视网膜相关疾病(例如但不限于黄斑变性、视网膜中央静脉阻塞、早产儿视网膜病和糖尿病性视网膜病变)的受试者视敏度的进展/改善。(参见bokinni，y等人，《眼睛》(eye)29：1085-91(2015))。
[0228]
确定患者视敏度改善的一种优选方法是确定受试者在治疗后是否能够在治疗之前识别斯内伦、etdrs或其它类似图表上的更多字母。由于这类视敏度测试需要受试者和医学专业人员之间的沟通(例如，大声朗读信件)，因此在临床前研究中对动物模型进行测试时难以获得视敏度的类似读数。临床视网膜实践中使用的视敏度测试通常测试最佳矫正视敏度(bcva)或通过矫正(其可以是眼镜、隐形眼镜等)获得的视敏度，因为该测试不涉及潜在的屈光矫正，而是视网膜的潜在健康。
[0229]
视敏度作为临床终点之优势在于可与依赖于观察视网膜血管形成或新血管形成的其它视觉测试(例如眼底照相/观察、荧光素血管造影术或甚至光学相干断层扫描)无关。
也就是说，如果对视敏度的改善效果不是由于影响视网膜脉管系统的机制，那么该测试仍然可以揭示治疗的功效，并且是患者机能的一种重要和真实的量度。
[0230]
iii.黄斑变性/阿姆斯勒方格表
[0231]
通常用于诊断黄斑变性和确定疾病进展的一种方法是使用阿姆斯勒(黄斑变性)方格表，其方法是本领域普通技术人员所熟知的。方格表包含与外观与方格纸类似的正方形，暗线形成正方形网格，并且在正方形的中间形成暗点。连续覆盖每只眼睛，受试者将每只眼睛聚焦在暗点上，并注意网格的任何线条是否破损、扭曲、成波浪或模糊。
[0232]
iv.利用瞳孔扩张的综合视网膜检查
[0233]
利用瞳孔扩张的全面视网膜检查是一种方法，通过所述方法可以由如验光师或眼科医师的从业者直接观察视网膜，并且是本领域普通技术人员所熟知的。从业者向受试者施用扩张眼药水。眼药水可以具有两种类型的散瞳药物，可以一起施用或分开施用。一种刺激使瞳孔扩张的肌肉收缩(例如，苯肾上腺素)，另一种类型放松使瞳孔收缩的肌肉(例如，环戊酸盐)。瞳孔扩张允许从业者在眼睛检查期间更好地观察视网膜的较大视野。
[0234]
利用瞳孔扩张的全面视网膜检查允许眼科医生诊断和确定各种眼睛和视网膜相关疾病的疾病进展，所述视网膜相关疾病例如(作为实例而非限制)青光眼、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞和年龄相关性黄斑变性。可通过眼底照相确定的这些疾病的迹象包括视网膜中血管的膨胀或泄漏、视网膜中或视网膜下血管的异常生长，以及视网膜黄斑的恶化。
[0235]
v.眼底照相
[0236]
类似于利用瞳孔扩张的视网膜检查，眼底照相是一种方法，通过所述方法可以直接拍摄视网膜并且是本领域普通技术人员所熟知的。(saine，pj等人，《眼底照相综述》，眼科照相：视网膜照相、血管造影和电子成像(ophthalmic photography：retinal photography，angiography，and electronic imaging)，butterworth-heinemann medical(第2版))。所述程序包括瞳孔扩张，患者坐在眼底照相机前。闪光灯将光线发射到患者的眼睛，产生眼底照片或视网膜图像。可以用各种彩色滤光片进行照相，或者可以给患者施用如荧光素的剂量以帮助成像。
[0237]
眼底照相机是连接到照相机的专用低功率显微镜。镜头的接受角度可以产生不同的输出。本领域普通技术人员认为30度角是视网膜的正常视角。广角眼底照相机能够拍摄45到140度之间的图像，而窄角眼底照相机具有20度或更小的视角。
[0238]
与利用瞳孔扩张的全面视网膜检查一样，眼底照相允许眼科医生诊断和确定各种眼睛和视网膜相关疾病的疾病进展，所述视网膜相关疾病例如(作为实例而非限制)青光眼、早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞和年龄相关性黄斑变性。可以通过眼底照相确定的这些疾病的迹象包括视网膜中血管的膨胀或泄漏、视网膜中或视网膜下血管的异常生长、暗点或纤维化疤痕，以及视网膜黄斑的恶化。
[0239]
vi.荧光素血管造影术
[0240]
荧光素血管造影术是一种可以评估视网膜血管的方法，并且是本领域普通技术人员所熟知的。它最常用于诊断或测量以新血管生长为特征的任何视网膜疾病中脉络膜新生血管的进展，包括但不限于wamd、dme、rvo和rop。
[0241]
将荧光素染料注射到受试者的静脉中(其眼睛之前已经扩张)，以使染料行进到眼
睛和视网膜的脉管系统。在注射染料之前，拍摄视网膜的基线照片。当确定染料已进入视网膜脉管系统时，在一到几分钟的间隔内拍摄视网膜的附加照片。观察照片，眼科医生可以确定是否发生了血管生长和是否有任何染料从血管中泄漏，这有助于他们了解新的和脆弱的血管所产生的位置，以及是否正在发生泄漏到视网膜中。
[0242]
vii.光学相干断层扫描(oct)
[0243]
oct是一种非侵入性测试，提供视网膜的高分辨率横截面图像，并使用光波产生图像。(fujimoto，jg等人，《肿瘤形成》(neoplasia)，2(1-2)：9-25(2000年1月))。oct允许对视网膜的每个相异层进行成像。因此，给眼科医生提供了可以通过其绘制视网膜并确定其厚度的方法。视网膜中央厚度如果增加可以表示中央视网膜下方或内部的液体积聚，即
‘
视网膜肿胀’，并且可以通过oct测量。获得的值通常是csf厚度，它是指视网膜的中央1mm子域中的视网膜厚度。作为示例而非限制，oct允许：在视网膜的任何地方精确测量受试者视网膜的中央视网膜厚度(crt)；在视网膜中央部分(黄斑)精确测量受试者视网膜的中央黄斑厚度(cmt)；以及在视网膜的中央1mm子域中精确测量受试者视网膜的中央子域厚度(csf或csft或cst)。进行oct测试以及确定crt、cmt和cst的方法是本领域技术人员所熟知的。
[0244]
可以使用滴眼剂进行oct，所述滴眼剂扩张瞳孔并且允许更好地检查受试者的视网膜。一旦瞳孔完全扩张，oct扫描仪可以以非侵入方式扫描受试者的眼睛。oct可以帮助诊断许多视网膜相关病状/疾病，包括黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、青光眼、糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变。
[0245]
viii.血管造影术oct(angio-oct/aoct/oct-a)
[0246]
血管造影术oct是一种非侵入性技术，其对视网膜和脉络膜微血管系统进行成像。(fingler j et al.，investig ophthalmol vis sci，49(11)：5055-59(2008))。激光反射用于移动红细胞的表面，从而描绘出微血管。因此，为了获得受试者视网膜的扫描，可注射染料是不必要的。随着时间的推移进行多次扫描，这允许检测具有高、中、低到无血流速度的区域。
[0247]
angio-oct可用于诊断和研究多种视网膜病况。(参见sousa dc et al.，optical coherence tomography angiography，eyewiki，american academy of ophthalmology，(2019)(可在eyewiki.aao.org/optical_coherence_tomography_angiography获取)。这些包括干性和湿性年龄相关性黄斑变性(waheed nk et al.，developments in ophthalmology 56：91-100(2016)和de carlo te et al.int j rein vitr.1(1)：5(2015))、糖尿病性视网膜病变(samara wa et al.，ophthalmology，124(2)：235-44(2017))、中心性浆液性脉络膜视网膜病变(de carlo te et al.，ophthalmic surgery，lasers imaging rein.47(2)：128-33(2016))、视网膜中央静脉阻塞(wakabayashi t et al.，investig ophthalmology vis sci，58(4)：2087(2017))、黄斑毛细血管扩张症(zhang q et al.，retina，35(11)：2285-99(2015))、脉络膜新生血管膜(querques l et al.，br j ophthalmol，309162(2016))、青光眼(de carlo te et al.int j rein vitr.1(1)：5(2015))和葡萄膜炎(kim ay et al.，am j ophthalmol，171：101-12(2016))。angio-oct和oct也可用于检测视网膜下液(srf)、视网膜内液(irf)、脉络膜新生血管(cnv)和视网膜色素上皮(rpe)厚度和脱离(faridi a et al.，ophthalmol retina，1(4)：294-303(2017))，其可用于监测受试者视网膜的形态特征。angio-oct发展迅速，广域aoct可以提供更大的视
网膜横截面，并且各种类型的oct和aoct可以提供更高层次的细节，从而获得更好的图像分辨率。
[0248]
f.确定是否需要使用抗vegf疗法进行治疗或再治疗的方法
[0249]
本公开的方法任选地进一步包括检查受试者的眼睛以确定已经用ccr3抑制剂治疗的受试者是否应该用抗vegf疗法治疗。确定步骤可以包括在方法中，而不管受试者是否是未治疗过的(即，以前没有用抗vegf剂治疗过)、是否以前已经治疗过并且对抗vegf疗法有响应、或者是否是抗vegf疗法难治的。在各个方面，该方法进一步包括基于确定是否应该治疗受试者，向受试者施用抗vegf疗法。确定受试者是否应该用抗vegf剂治疗的方法包括使用任何一种或多种合适的技术(例如本文所述的技术)检查受试者的眼睛。
[0250]
例如，该方法可以包括使用例如oct确定患有视网膜病症/病况的眼睛的中央视网膜厚度(crt)是否增加。在本公开的一个方面，响应于增加的50μm、100μm、150μm、200μm或更多的crt，提供额外剂量的抗vegf剂。(参见例如patel av et al.，int ophthalmol clin，55(4)：103-12(2015)，其通过引用整体并入本文)。可选地或另外地，该方法可包括确定是否应基于视敏度下降或最佳矫正视敏度下降1个字母、2个字母、3个字母、4个字母、5个字母或更多来施用抗vegf疗法。(参见例如id.和martin df et al.，ophthalmology，119(7)：1388-98(2012)，其通过引用整体并入本文)。可选地或另外地，该方法可以包括确定是否应该基于新的持续性出血、oct上的液体增加、荧光素血管造影术上的渗漏时的染料渗漏、变形(扭曲的图像)或暗点(盲点)的报告或受试者报告的其他视力变化来确定是否应该施用抗vegf治疗。可选地或另外地，该方法可包括确定是否存在活动性脉络膜新生血管的迹象，oct上是否存在视网膜下、视网膜内或亚rpe流体，是否存在视网膜下或视网膜内出血，是否存在持续性视网膜下或视网膜内出血，是否相对于上次就诊时视敏度下降而没有其他解释、是否荧光素血管造影术上的病变大小相对于上次血管造影图增加、或是否有荧光素血管造影术上的漏出。(参见martin见上和catt程序手册，2011年，可在www.med.upenn.edu/cpob/assets/user-content/documents/cattmanualofproceduresjan2011.pdf获取，其通过引用整体并入本文。)然后该方法可以包括施用一剂或多剂随后剂量的抗vegf剂。
[0251]
确定受试者是否应该用抗vegf剂治疗可以例如在对医生、眼科医生或其他合格的医疗保健专业人员的随访中进行。根据患者的要求，或者根据需要，这样的访问可以是定期的(例如，每月一次)。
[0252]
g.试剂、装置和试剂盒
[0253]
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂、装置和试剂盒。主题试剂、装置和试剂盒可以有很大变化。感兴趣的试剂和装置包括上述关于在受试者中施用ccr3抑制剂的方法提及的那些。
[0254]
除了上述组分之外，主题试剂盒进一步包含用于实践主题方法的说明书。这些说明书可以各种形式存在于主题试剂盒中，其中一种或多种可以存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是在合适的介质或基底上的印刷信息，例如，在其上打印信息的一张或多张纸，在试剂盒的包装中，在包装说明书中等。另一种方法是计算机可读介质，例如磁盘、cd、便携式闪存驱动器等，其上已经记录了信息。可能存在的另一种方式是可以通过因特网使用以访视远程站点处的信息的网站地址。试剂盒中可以存在任何方便的构件。
[0255]
提供以下实施例是为了说明而不是为了限制。
[0256]
h.实施例
[0257]
i.药物制剂
[0258]
施用于患有视网膜相关疾病的受试者的医药组合物可以使用美国专利申请公开第2013/0266646号、第2016/0081998号、美国专利第8,278,302号、第8,653,075号、re 45323、第8,742,115号、第9,233,950号和第8,680,280号中公开的实施例合成、制备和配制，所述专利全部内容通过引用并入本文。其他ccr3抑制剂也在上面第0节中详细描述。
[0259]
ii.研究产品
[0260]
本发明的研究产品(“化合物1”)符合以下化学结构：
[0261][0262]
相关领域的普通技术人员将认识到，先前在美国专利申请12/727,318、13/596,225、14/175,082、13/267,417、14/160，646、14/572,889、13/851,547、13/851,564、13/851,538和pct专利申请号wo2018/187473中描述的化合物、共晶、盐和制剂也可用于这些实施例中。相关领域的普通技术人员还将认识到，上述任何ccr3拮抗剂也可用于这些实施例中。
[0263]
本发明的研究产品以100mg、200mg和400mg膜包衣片剂形式提供，其具有双凸形、圆形或椭圆形和暗红色。片剂通过干法制粒法制备，并含有微晶纤维素、磷酸氢盐、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、聚乙烯醇、二氧化钛、聚乙二醇、滑石、氧化铁红和氧化铁黄作为非活性成分。与研究产品匹配的安慰剂片剂通过直接压片法生产并含有相同的非活性成分。
[0264]
i.临床实施例
[0265]
i.难治性受试者眼睛
[0266]
患有难治性湿性年龄相关性黄斑变性(wamd)的受试者每天两次(bid)口服施用400mg化合物1 ccr拮抗剂，总剂量为每天800mg。化合物1的治疗方案持续6周。该6周方案的难治性受试者被描述为在至少连续3次(相隔约4-6周)ivt抗vegf注射后具有持续的视网膜下液、视网膜内液和视敏度没有改善。
[0267]
在由6周的化合物1 ccr拮抗剂治疗组成的临床试验结束后，并且在没有额外治疗的情况下进行了四周的临床试验随访后，患有严重的治疗前双侧疾病的受试者重新接受其医生的正常治疗，并且根据标准原则(例如oct/血管造影oct(angio-oct或aoct)或中心凹视网膜下液(srf)/视网膜内液(irf)或ped上的新cnv活性)指导的医师判断，用a-vegf剂治疗或再治疗。通过玻璃体内注射施用不同的α-vegf剂(在图4-5、9-10、14-15、19-21和表d和h中描述)。对于阿柏西普，每次玻璃体内注射给予0.05ml中的2mg。对于贝伐单抗，每次玻璃体内注射给予0.05ml中的1.25mg。对于雷珠单抗，每次玻璃体内注射给予0.05ml中的0.5mg。布洛赛珠单抗当时未获批准，未用于这些临床实施例。
[0268]
所有oct测试均使用revo nx(optopol technology，波兰)进行。使用覆盖7x7 mm区域的3维(3d)扫描方案(1024a-扫描x 64断层图像)。自动测量视网膜中央厚度(crt)(软件版本9.6)。操作员检查了中央凹的检测和层分割的准确性。如有必要，通过将指针移动到所需位置手动校正中央凹位置和视网膜外边界。在这种情况下，重新计算中央黄斑厚度值。人工评估视网膜下和视网膜内液体的存在。srf被定义为视网膜色素上皮和感觉视网膜之间的低反射空间，而irf被定义为视网膜内的低反射卵形或圆形空间。srf和irf与外视网膜小管(ort)和退行性irf不同。后者未被识别为cnv活动迹象。监测了在oct血管造影术上看到的cnv活动迹象，例如新生血管。此外，还注意到脂质渗出物和rpe升高的扩大。
[0269]
目前正在探索不同的方法来克服难治性namd。这些包括更换抗vegf药物，导致再敏化的成功非常有限；增加抗vegf剂量，导致再敏化仅适度改善；以及增加抗vegf给药频率，导致srf的消退改善但功能改善有限。(fowler sc和schneider ew，more frequent dosing for refractory namd？，retina specialist，may 13，2020)。
[0270]
尽管有明确的数据突出了标准化给药或给药频率的值，但图4-5、9-10、14-15、19-21和表d和h中描述的结果完全出乎意料和令人惊讶。这些实施例中使用的抗vegf剂的剂量没有改变，但srf、irf和cnv的消退更明显。更令人惊讶的是，难治性眼睛需要显著降低的ivt抗vegf施用频率(例如，与所有眼睛的标准介质7.3相比，每年需要0.69至1.37剂)，以及在这些非响应性患者的实践中可能更高的每年给药频率。(参见图21和22以及jang l等人的回顾性分析，graefes arch clin exp ophthalmol，253(8)：1211-16(2015)，也参见fowler sc和schneider ew，more frequent dosing for refractory namd？，retina specialist，may 13，2020)。此外，难治性眼睛的再敏化达到了意想不到的程度。例如，阅读etdrs字母的数量得到改善和稳定(图9-10和表d)。这也是出乎意料的，因为难治性患者往往不会在护理标准下表现出改善，而是仅仅为了维持他们的视觉或解剖状态，他们通常需要每月(或更频繁地)注射，而且这些特定的受试者已经严重受损。
[0271]
crt稳定并再次对抗vegf ivt注射有响应(图14-15和表d)。中央视网膜色素上皮脱离高度也降低，并且可以通过不频繁的抗vegf ivt注射来维持(图19-21和表d)。此外，由irf和srf的存在以及cnv的存在确定的液体渗出再次得到响应并通过抗vegf ivt施用成功控制，即使给药频率显著降低(表h)。化合物1 ccr3/嗜酸细胞活化趋化因子-1通路拮抗剂和ivt抗vegf方案的组合似乎是互补的并且以协同方式起作用。令人惊讶的是，在注射抗vegf之前施用的选择性抗炎剂产生了明显更显著和持久的效果。
[0272]
ii.未治疗过的受试者眼睛
[0273]
新诊断的患有继发于wamd的脉络膜新生血管(cnv)的受试者每天两次(bid)口服施用400mg化合物1 ccr拮抗剂，总剂量为每天800mg。临床试验治疗方案包括6周的化合物1，然后是4周的安全性随访(第7周和第8周为办公室访问，第10周通过电话随访)，没有额外的化合物1治疗。每周进行一次受试者治疗访问，其中记录通过etdrs测量的bcva的平均变化，进行裂隙灯和sd-oct，并测量眼压。然后，受试者在临床试验后与他们的医生一起恢复常规治疗，并且根据标准原则(例如oct/angio-oct(aoct)或增加的中心凹视网膜下液(srf)/视网膜内液(irf)上的新cnv活性)指导的医师判断，用α-vegf剂治疗或再治疗。通过玻璃体内注射施用不同的α-vegf药剂(在图1-3、6-8、11-13和16-18、21以及表a-c和e-g中描述)。对于阿柏西普，每次玻璃体内注射给予0.05ml中的2mg。对于贝伐单抗，每次玻璃体
内注射给予0.05ml中的1.25mg。对于雷珠单抗，每次玻璃体内注射给予0.05ml中的0.5mg。
[0274]
所有oct测试均使用revo nx(optopol technology，波兰)进行。使用覆盖7x7mm区域的3维(3d)扫描方案(1024a-扫描x 64断层图像)。自动测量视网膜中央厚度(crt)(软件版本9.6)。操作员检查了中央凹的检测和层分割的准确性。如有必要，通过将指针移动到所需位置手动校正中央凹位置和视网膜外边界。在这种情况下，重新计算中央黄斑厚度值。人工评估视网膜下和视网膜内液体的存在。srf被定义为视网膜色素上皮和感觉视网膜之间的低反射空间，而irf被定义为视网膜内的卵形或圆形空间，反射率量低。srf和irf与外视网膜小管(ort)和退行性irf不同。后者未被识别为cnv活动迹象。监测了在oct血管造影术上看到的cnv活动迹象，例如新生血管。此外，还注意到脂质渗出物和rpe升高的扩大。
[0275]
在现实世界的研究中，对于贝伐单抗、阿柏西普和雷珠单抗，初始抗vegf ivt治疗中每位患者每年的平均注射次数为7.3，或者对于贝伐单抗或雷珠单抗，每个标签为12次注射。(ciulla ta et al.，ophthalmology retina，4：19-30(2020))。相比之下，化合物1 ccr3/嗜酸细胞活化趋化因子-1通路拮抗剂和随后的抗vegf ivt治疗的组合产生了显著较低的平均注射次数，与药剂成分(即阿柏西普、贝伐单抗或雷珠单抗)无关。用贝伐单抗治疗的患者病例1平均每年需要少于一剂(0.667)(参见图1、6、11、16和22以及表a和e)。用阿柏西普治疗的患者病例2平均每年最多需要少于3剂(2.36)。(参见图2、7、12、17和22加表b和f)。患者病例3用雷珠单抗治疗一次，随后用贝伐单抗治疗，平均每年需要大约1剂(1.23)。(见图3、8、13、18和22加表c和g)。
[0276]
与回顾性分析相比，这些未治疗过的患者所需的ivt抗vegf注射频率显著降低。(ciulla，同上)。在另一项回顾性研究中，即使ivt抗vegf注射的时机是针对prn给药方案(临时(pro re nata)、prn或“按需”给药)，平均剂量范围为每年4.9至8剂(wykof cc et al.，jmcp，24(2-a)：s3-s15(2018))。因此，ccr3/嗜酸细胞活化趋化因子-1通路拮抗剂(化合物1)和各种抗vegf剂的这种组合的效果是出乎意料地显著降低了抗vegf ivt注射的推荐频率。ivt注射频率的这种下降将显著降低成本、医生就诊以及患者的不愉快和侵入性程序。
[0277]
在抗vegf剂给药频率较低的回顾性分析中，crt、视网膜内和视网膜下液的发生以及色素上皮脱离往往随着时间的推移产生锯齿曲线。也就是说，峰和谷的半规则模式，与在接受更频繁给药的人群中产生的更平滑的曲线相反。(参见waldstein sm et al.，ophthalmology 123：1521-29(2016)和jaffegj，et al.，ophthalmology，123：1856-64(2016))。出乎意料的是，与在这些措施中通常观察到的标准护理抗vegf治疗的半规则锯齿模式相比，来自患者病例1至3的未治疗过患者都经历了相对扁平的视觉和解剖模式，尽管抗vegf ivt治疗的频率显著降低。
[0278]
iii.表格
[0279]
表a，患者病例1
[0280]
未治疗过的单侧疾病
[0281][0282][0283]
表b，患者病例2
[0284]
未治疗过的单侧疾病
[0285][0286][0287]
表c，患者病例3
[0288]
未治疗过的单侧疾病
[0289][0290]
表d，患者病例4
[0291]
难治性双侧疾病
[0292]
[0293][0294]
*在使用化合物1(compd 1)治疗之前，受试者的右眼接受了11次雷珠单抗注射，左眼接受了18次雷珠单抗注射。
[0295]
表e，患者病例1
[0296]
未治疗过的单侧疾病
[0297]
存在视网膜下液(srf)、视网膜内液(irf)或脉络膜新生血管(cnv)
[0298]
*angio-oct仅执行这些访问，其余的etdrs、oct，仅临床检查
[0299][0300]
表f，患者病例2
[0301]
未治疗过的单侧疾病
[0302]
存在视网膜下液(srf)、视网膜内液(irf)或脉络膜新生血管(cnv)
[0303]
*angio-oct仅执行这些访问，其余的etdrs、oct，仅临床检查
[0304][0305][0306]
表g，患者病例3
[0307]
未治疗过的单侧疾病
[0308]
存在视网膜下液(srf)、视网膜内液(irf)或脉络膜新生血管(cnv)
[0309]
*angio-oct仅执行这些访问，其余的etdrs、oct，仅临床检查
[0310]
[0311][0312]
表h，患者病例4
[0313]
难治性双侧疾病
[0314]
存在视网膜下液(srf)、视网膜内液(irf)或脉络膜新生血管(cnv)
[0315]
*angio-oct仅执行这些访问，其余的etdrs、oct，仅临床检查
[0316]
[0317]
[0318]