基于与门的可降解连接体用于功能负载的靶向递送的制作方法

metalloproteinases)、成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,fap)等。


技术实现要素：

6.一方面，本文提供一种用于连接靶向基团和功能负载的可降解连接体，其包括第一可降解位点、第二可降解位点、靶向基团连接位点和功能负载连接位点，其中所述靶向基团连接位点用于与所述靶向基团形成共价连接，所述功能负载连接位点用于与功能负载形成共价连接，所述第一降解位点和所述第二降解位点位于所述靶向基团连接位点和所述功能负载连接位点之间，仅在所述第一降解位点和所述第二降解位点均断裂时才导致所述靶向基团连接位点与所述功能负载连接位点的分离。
7.在一些实施方案中，所述第一降解位点与所述第二可降解位点具有不同的化学结构。
8.在一些实施方案中，所述第一降解位点和所述第二降解位点相对于所述所述靶向基团连接位点与所述功能负载连接位点为并联连接。
9.在一些实施方案中，所述第二降解位点在断裂前能够干扰所述第一降解位点的断裂。
10.在一些实施方案中，所述功能负载连接位点具有自消灭性基团，用于所述功能负载的释放。
11.在一些实施方案中，所述自消灭性基团包括1,2,4-三取代苯环结构。
12.在一些实施方案中，所述自消灭性基团具有式i或ii的结构
[0013][0014][0015]
在一些实施方案中，所述可降解连接体具有式iii的结构：
[0016][0017]
其中r1用于连接所述靶向基团，r2用于连接所述功能负载，所述第一可降解位点位于所述l1内，所述第二可降解位点位于l2内，以及y选自如下结构的任一个：
[0018][0019]
在一些实施方案中，所述l1具有式iv或式v的结构：
[0020][0021]
其中n1和n2独立地为0至20的整数，r’选自ch3、c6h5ch2和c6h5ch2o，r3和r4独立地具有式vi的结构，
[0022][0023]
其中n3为0至20的整数，u1选自-ch
2-、-ch2ch2o-、-och2ch
2-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-s-s-、-o-、-s-、-nh-、-sc-、-hc＝ch-、-hc≡ch-及其任意组合。
[0024]
在一些实施方案中，所述l1具有式vii或式viii的结构：
[0025][0026]
其中n4和n5独立地为0至20的整数，r”选自ch3、c6h5ch2和c6h5ch2o，r5和r6独立地具有式ix的结构，
[0027][0028]
其中n6为0至20的整数，u2选自-ch
2-、-ch2ch2o-、-och2ch
2-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-s-s-、-o-、-s-、-nh-、-sc-、-hc＝ch-、-hc≡ch-及其任意组合。
[0029]
在一些实施方案中，所述l2具有式x的结构，
[0030][0031]
其中l选自-val-cit-、-glu-val-cit-、-pro-gly-、-asp-glu-val-asp-和-asn-pro-val-、-val-gly-、-gly-gly-、-gly-gly-gly-或-ala-ala-asn-；
[0032]
n7和n8独立地为0至-20的整数；
[0033]
u3和u4独立地选自-ch2-、-ch2ch2o-、-och2ch2-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-s-s-、-o-、-s-、-nh-、-sc-、-hc＝ch-、-hc≡ch-及其任意组合。
[0034]
在一些实施方案中，式iii中r2具有式xi的结构
[0035][0036]
在一些实施方案中，式iii中r1具有式xii的结构
[0037][0038]
其中n9为0至20的整数；
[0039]
u5选自-ch
2-、-ch2ch2o-、-och2ch
2-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nh-、-nhc(＝o)-、-s-s-、-o-、-s-、-nh-、-sc-、-hc＝ch-和-hc≡ch-及其任意组合；
[0040]
r7选自如下结构的任一种：
[0041][0042][0043]
在一些实施方案中，所述可降解连接体具有式xiii的结构
[0044]
[0045]
在一些实施方案中，所述可降解连接体具有式xiv的结构
[0046][0047]
其中n10和n11独立地为0至20的整数，功能负载2为与所述功能负载相同或不同的分子。
[0048]
在一些实施方案中，所述可降解连接体具有式xv或式xvi的结构
[0049][0050]
其中n10为0至20的整数，r’选自ch3、c6h5ch2和c6h5ch2o。
[0051]
在一些实施方案中，所述靶向基团为抗体或其抗原结合片段。
[0052]
在一些实施方案中，所述功能负载或功能负载2为细胞毒素、放射性或荧光标签。
[0053]
另一方面，本文提供了包括上述可降解连接体的抗体药物偶联物(adc)。
[0054]
另一方面，本文提供了包括上述可降解连接体的靶向造影剂。
[0055]
另一方面，本文提供了一种靶向递送功能负载的方法，其包括将所述功能负载通过上述可降解连接体连接至靶向基团。
[0056]
本文提供的可降解连接体可作为抗体药物偶联物(antibody drug conjugate,
adc)、靶向造影剂以及诊疗一体化试剂的关键组成部分。该可降解连接体可以对肿瘤或其他病灶的微环境中的特定因素(ph、酶等)做出响应，降解而释放功能负载。进一步地，文提供的基于与门设计的可降解连接体，当且仅当组成与门的两个可降解位点都被降解断开时，完整的功能负载才被释放出来。本文提供的基于与门的可降解连接体用于抗体药物偶联物能够改进抗体药物偶联物的安全性和有效性，提高治疗窗口。本文提供的基于与门的可降解连接体用于靶向近红外荧光造影剂能够改进造影剂的肿瘤背景比(tumor background ratio，tbr)。本文提供的可降解连接体还可以用于前药(prodrug)设计、蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera，protac)技术以及核酸分子(sirna、mrna等)的靶向递送。
附图说明
[0057]
图1显示了基于与门的可降解连接体的一个实施方案的示意图。该可降解连接体中，第一个降解位点和第二个降解位点被置于一个环形寡肽中，只有当第一个降解位点和第二个降解位点都被降解时，细胞毒素负载才释放出来。为了使原药得到完整释放，环状多肽内包含含有1，2，4-三取代苯环的自消灭性基团与细胞毒素负载连接。
[0058]
图2显示了基于与门的可降解连接体的另一个实施方案的示意图。该可降解连接体中，第二可降解位点的降解依赖于第一可降解位点的降解。
[0059]
图3显示了显示了基于与门的可降解连接体的另一个实施方案的示意图。通过增加一个第一可降解位点，使得可以可控地释放另一功能载体(如药物分子)。
[0060]
图4显示了基于与门的可降解连接体的一个具体实例的制备过程。
[0061]
图5显示了包括图4中可降解连接体的偶联物的药物释放过程。
[0062]
图6显示了具有降解依赖关系的可降解连接体的另一个具体实例。通过该可降解连接体，可在靶细胞或组织中有序释放不同的功能载体。
具体实施方式
[0063]
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0064]“靶向基团”指与对应配体具有结合亲和力的基团。通过靶向基团与对应配体的识别和结合，可以使与该靶向基团连接的其他部分靠近对应配体或进入含有有该对应配体的细胞或组织。在靶向基团为抗原(例如细胞表面抗原或受体)的情况下，该靶向基团通常为抗体或其抗原结合片段。或者，靶向基团也可以为可以与特定受体结合的配体分子。靶向基团通常为多肽(例如抗体)，也可以为与对应配体具有结合亲和力的非肽类小分子。
[0065]“功能负载”指可在细胞中或体内发挥效应作用(例如诊断或治疗作用)的分子。功能负载的非限制性实例包括细胞毒素、酶、放射性标签、半抗原、荧光标签、磷光分子、化学发光分子、生色团、光亲和分子、带色粒子等。常用的细胞毒素例如包括吡咯苯并二氮杂卓类(pbd)、相思子毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素等。
[0066]“可降解连接体”指在一定的环境(例如ph)或蛋白酶作用下可在特定位点断裂的连接体。该环境可包括肿瘤微环境、溶酶体酸性环境或细胞外基质环境等。“可降解连接体”通常在循环系统中保持稳定，不会被降解而释放所连接的功能负载；在靶向基团的作用下
进入靶细胞或组织中后才被降解而释放功能负载。
[0067]“自消灭性基团(self-immolative moiety)”指具有发生分子重排倾向而导致与其连接的其他分子(例如功能负载)与其分开的基团。本领域已知多种自消灭性基团。优选地，该自自消灭性基团包括1,2,4-三取代的苯环结构。具体地，含有1，2，4-三取代苯环的自消灭性基团可基于文献中报道过的分子a(esser-kahn,aaron p.,et al.(2010),
‘
programmable microcapsules from self-immolative polymers’,journal of the american chemical society,132(30),10266-68.或b(jeffrey,sc,et al.(2006),
‘
development and properties of beta-glucuronide linkers for monoclonal antibody-drug conjugates.’,bioconjug chem,17(3),831-40)。
[0068][0069]“成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,fap)”为肿瘤相关成纤维细胞的特异性标志物之一，具有蛋白水解酶活性，其底物例如为含有gly-pro的寡肽。肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts，cafs)是肿瘤微环境的重要组成成分。研究发现cafs通过分泌各种生长因子、细胞因子、趋化因子等促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移(yamamura,y.,asai n,enomoto a,kato t,mii s,kondo y,et al.akt-girdin signaling in cancer-associated fibroblasts contributes to tumor progression.cancer research.2015 mar 1；75(5):813-23.pubmed pmid:25732845)。近90％的上皮原性恶性肿瘤(包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤等)的cafs出现fap-α的过表达，fap-α主要定位于包膜和胞质，几乎不表达于正常组织及良性上皮肿瘤的间质中静息的成纤维细胞中，且罕有表达于肿瘤细胞。huax等研究发现在349切除的乳腺标本中，正常组织中fap-α表达阴性，导管内癌组织中表达阳性率为19.27％，在导管内癌伴微浸润的组织中表达阳性率为82.72％，而在浸润性导管癌组织中其表达阳性率为100％(hua x,yu l,huang x,liao z,xian q.expression and role of fibroblast activation protein-alpha in microinvasive breast carcinoma.diagnostic pathology.2011nov 8；6:111.pubmed pmid:22067528.pubmed central pmcid:3228672.)。目前研究发现fap-α促进肿瘤的发生、发展主要通过下面几个方式(bhowmick na,moses hl.tumor-stroma interactions.current opinion in genetics&development.2005feb；15(1):97-101.pubmed pmid:15661539.pubmed central pmcid:2819733)：(1)释放血管内皮生长因子，白细胞介素-8等血管生长相关因子，诱导肿瘤组织血管增生，从而有利于癌细胞的生长、侵袭；(2)通过细胞与细胞之间的接触，释放生长因子，分泌基质成分等促进肿瘤生长；(3)提供免疫隔离的间给肿瘤细胞，协助其逃逸机体防御系统；(4)表达细胞因子、蛋白酶及黏附分子等协助肿瘤、转移。
[0070]“与门(and gate)连接”为数字逻辑中实现逻辑与的逻辑门，仅当输入均为高电压
时，输出才为高电压；若输入中至多有一个高电压时，则输出为低电压。本文利用该术语来表示仅当可降解连接体中的两个可降解位点均被微环境因素降解时，才释放功能负载；当仅有一个可降解位点被微环境因素降解时，细胞毒素仍连接在偶联物(如adc)上，不能发挥其功能。换言之，本文中可降解连接体可在肿瘤微环境中相同的或不同的因素作用下降解两次。只有当两次降解成功时，包括该可降解连接体的偶联物(如adc)所负载的功能负载(如药物分子，如细胞毒素)才全部释放出来。
[0071]
实现与门连接的一种方式为两个可降解位点在可降解连接体中采取“并列连接”。这种情况下，两次降解通常彼此独立(参见图1)。运用与门原理，可把两个可降解位点(cleavable site)和自消灭性基团结合在环状肽中，生成基于这个环状肽的连接体，只有在微环境中同时具备两个因素时，才能释放原药。如果其中一个因素是肿瘤中广泛存在fap，则这一连接体可应用于针对多种肿瘤的adc中。fap为肿瘤相关成纤维细胞的特异性标志物之一，具有蛋白水解酶活性，其底物为含有gly-pro的寡肽。因此，对于例如与fap相关肿瘤的治疗，可以让一个可降解位点含有gly-pro，以使得在靶向基团作用下该可降解位点靠近肿瘤细胞表面fap，fap进而降解该位点。另一个降解位点可基于肿瘤微环境或其他肿瘤特异性酶来设，例如使用可被cathepsin b降解的含phe-lys的肽段，对凝血酶敏感的肽段以及分子内二硫键等。
[0072]
这种情形下，该可降解连接体可具有如下结构：
[0073][0074]
其中r1用于连接靶向基团，r2用于连接功能负载，第一可降解位点位于连接体1内，第二可降解位点位于连接体2内。显然，采用这种形式的并联连接时，只有连接体1中的降解位点和连接体2中的降解位点均降解，才会使与其连接的靶向基团和功能负载彼此分离，允许功能负载(如细胞毒素)发挥其功能。
[0075]
在一个更具体的实例中，可以按图4所示制备包括可降解连接体的偶联物(adc)。该偶联物中的可降解连接体中包括两个可降解位点。药物分子释放过程如图5所示。
[0076]
在上述方式下，该可降解连接体大体具有环形结构。在另一种实现与门连接的方式中，可降解连接体不必具有环形结构。在这种方式中，可降解连接体重的一次降解依赖于另一次降解。同样地，只有两次降解都发生时，才释放功能载体。
[0077]
参见图2，在一个具体实例中，第二个降解点可被连接在第一个降解点上的辅助基团掩盖，只有当第一个降解位点断裂之后，第二个降解位点才能断裂以释放药物。这一设计原理在靶向分子影像试剂中得到应用(li,hui,chang-hee lee,and injae shin(2019),
‘
preparation of a multiple-targeting nir-based fluorogenic probe and its application for selective cancer cell imaging’,organic letters,21 4628-31)。
[0078]
还可以在该方式基础上进一步改进。当第一次降解成功而第二次降解尚未开始
时，可以通过设计，选择性地释放部分药物分子，也可以选择不释放药物分子。如选择释放部分药物分子，该药物分子与第二次降解所释放的药物分子可以相同或不同。
[0079]
如图3所示，对这一设计原理加以拓展，则辅助基团上可进一步连接同一种或另一种药物分子，起到类似于旁观者效应的治疗效果。旁观者效应是adc发挥作用的重要机制之一，指随adc进入肿瘤细胞中并在肿瘤细胞中得到释放的毒素分子，主动或随肿瘤细胞的破裂逃出肿瘤细胞，而杀死周围其他的肿瘤细胞，由于部分毒素分子在肿瘤细胞内极性发生重大改变而难以穿过肿瘤细胞膜，可以影响到旁观者效应的有效发挥。选择性地在adc到达肿瘤周围而进入肿瘤细胞之前释放部分药物，有可能通过旁观者效应增强adc的疗效。辅助基团可以是peg分子。图6显示了这种药物释放方式的一个具体实例。
[0080]
可降解连接体可以看作是为了达到有效性和安全性之间平衡而做的一种妥协，adc在肿瘤之外把细胞毒素负载释放出来，是造成毒副作用的主要原因，也限制了adc上细胞毒素的毒性不能过强。基于与门的连接体，只有当肿瘤微环境中同时具备两个特异因素时才释放细胞毒素药物，相比只对肿瘤微环境中一个特异因素作出反应的连接体，能更有效地靶向肿瘤组织，减小对正常细胞的毒副作用。
[0081]
包括一个可降解位点和自消灭性基团的可降解连接体可见于多种adc分子中，是成熟的设计，能保证原药的释放。与其相比，采用与门设计的两个可降解位点以及任选地自消灭性基团，仅在两个点都降解断开的情况下释放功能负载(如原药)，为本文提供的新设计，可以让功能负载更精准地在靶细胞或组织中发挥作用。
[0082]
根据所连接的功能负载的不同，本文提供的可降解连接体可用于肿瘤或其他疾病的诊断、显像和治疗。