低氧胁迫和昆虫病原线虫协同处理韭蛆的方法

1.本发明涉及昆虫防治技术领域，特别是涉及一种低氧胁迫和昆虫病原线虫协同处理韭蛆 的方法。


背景技术：

2.韭蛆会对三十余种植物的生长造成威胁，是我国韭菜生长的毁灭性害虫。目前对于韭蛆 的防治方法，主要具有以下四种：
3.一，农业防治
4.可因地制宜选择抗性品种、与其他作物(葱、蒜等除外)轮作、扒土晒根、土壤暴晒。施 用草木灰和氨肥，疏松土壤的同时也可以起到一定程度杀灭韭蛆的作用。我们小组建议韭菜 收割之后立即在上方覆防虫网，减弱甚至阻止韭菜浓烈的气味对韭菜迟眼蕈蚊成虫的吸引力， 直至伤口愈合、气味消失后再去掉防虫网(为发表结果)。可以通过对韭菜田灌水，抑制韭蛆 活动减轻其为害。科学适量使用腐熟沼液浇灌韭菜，破坏成虫产卵环境，也可以降低韭蛆的 危害能力。
5.二，物理方法
6.可以在韭菜田使用防虫网隔离，有效防止韭蛆成虫的侵害；使用黄色或者黑色粘板黏附 成虫，糖醋液以及诱虫灯诱杀韭蛆成虫，播种前用日晒高温覆膜法杀死一部分韭蛆，该方法 仅适宜在夏季日照充足时对韭蛆进行防治。然而物理手段对韭蛆的防治效果甚微，只能短期 内实现减轻虫害的作用，不足以对每年多代发生的韭蛆虫害进行持续防治。
7.三，化学防治
8.种植户常常利用有机磷类、氨基甲酸酯类和新烟碱类等化学农药灌根的方式防治韭蛆， 如辛硫磷、吡虫啉、毒死蜱、高效氯氰菊酯等。但是，由于韭蛆栖息部位和危害场所隐蔽， 为了最大程度杀死潜伏在土壤中的韭蛆以维持韭菜的产量，生产者有时会盲目加大药剂使用 量。不仅如此，常年连续过度使用农药已经致使韭蛆抗药性增加，丁倩等报道韭蛆对辛硫磷、 毒死蜱的抗药性分别为755倍、696倍。
9.四，生物防治
10.目前对眼蕈蚊科害虫的生物防治已有较多研究，如用病原线虫防治蘑菇上的lycoreellaauripila、用捕食螨防治根蛆等。韭蛆的生物防治措施包括苦参碱、阿维菌素abamectin、苏 云金杆菌、白僵菌、枯草芽孢杆菌等微生物的使用。近年来，研究者一直尝试利用昆虫病原 线虫对韭蛆进行生物防治，在韭蛆为害前期释放(北方为春分、秋分)，使韭蛆患败血症死亡。 但是在利用植物源或微生物源杀虫剂防治韭蛆时，其较高的生产成本和相对复杂的土壤生物 和非生物环境成为其推广应用的主要限制因子。


技术实现要素：

11.本发明的目的是针对韭蛆防控中存在的技术问题，而提供低氧胁迫和昆虫病原线虫协同 处理韭蛆的方法。
12.为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
13.低氧胁迫和昆虫病原线虫协同处理韭蛆的方法，包括以下步骤：
14.步骤1，利用低氧试剂淹没韭蛆进行预处理，所述低氧试剂中溶解氧的浓度小于4mg/l；
15.步骤2，通过接种昆虫病原线虫的方式继续处理韭蛆。
16.在上述技术方案中，所述步骤1中的预处理时间为1.5～2.5小时，优选为2小时。
17.在上述技术方案中，所述步骤2中的昆虫病原线虫为斯氏线虫或异小杆线虫。
18.在上述技术方案中，所述溶解氧的浓度低于2mg/l，进一步的，所述溶解氧的浓度低于 1.5mg/l。
19.在上述技术方案中，所述低氧试剂包括水和除氧剂。
20.在上述技术方案中，所述除氧剂为焦亚硫酸盐、亚硫酸盐中一种或任意比例的多种，所 述焦亚硫酸盐优选为焦亚硫酸钠或焦亚硫酸钾，所述亚硫酸盐优选为亚硫酸钠或亚硫酸钾， 更为优选的，所述除氧剂为焦亚硫酸钠。
21.在上述技术方案中，所述除氧剂在所述低氧试剂中的质量百分比大于0小于10％，优选 为0.1～1％，更优选为0.4～1％。
22.在上述技术方案中，处理土盆中的韭蛆时，先利用所述低氧试剂浸泡种植有植物的土盆， 再向所述土盆中接种昆虫病原线虫。
23.在上述技术方案中，处理大田中的韭蛆时，收集地表5-10cm的土壤，集中低氧试剂浸泡， 回填至大田，在大田中接种昆虫病原线虫；收集地表5-10cm的土壤，集中低氧试剂浸泡，接 种昆虫病原线虫处理12-60h后，回填至大田中。
24.本发明的另一方面，低氧胁迫和昆虫病原线虫协同作用在防治昆虫中的应用。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.1.本技术研究发现溶解氧浓度和水淹时长会影响韭蛆和昆虫病原线虫的存活，韭蛆和昆 虫病原线虫的死亡数随溶解氧浓度降低而显著升高。
27.2.对供试韭蛆进行水淹预处理，再接种昆虫病原线虫的平板试验结果显示，水淹预处理 以及添加昆虫病原线虫均使韭蛆死亡数增加，溶解氧浓度和昆虫病原线虫种类对水淹预处理 韭蛆的死亡数均有显著影响。
28.3.水淹预处理加强了昆虫病原线虫的致死能力，二者起到了协同增效的作用，可应用于 盆栽植物或大田植物中韭蛆的处理，适用范围广泛。
附图说明
29.图1是溶解氧浓度对hb线虫死亡率的影响；
30.图2是溶解氧浓度对sf线虫死亡率的影响；
31.图3是低氧水淹预处理与昆虫病原线虫结合对韭蛆的防治效果；epn-表示未接种epn， sf表示接种steinernema feltiae、hb表示接种heterorhabditis bacteriophora。a-j表示从 12h-120h的10次调查结果。ck表示未经淹水处理。
32.图4是不同亚硫酸盐低氧胁迫对韭蛆的影响；
33.图5是不同浓度焦亚硫酸钠对韭蛆的影响。
34.附图中的dissolved oxygen为溶解氧浓度，flooding time为水淹时间；
35.附图中的epn(entomopathogenic nematodes)为昆虫病原线虫。
具体实施方式
36.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例 仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.实验材料
38.迟眼蕈蚊(bradysia odoriphaga yang et zhang)：从天津武清区绿色韭菜实验基地挖取被 韭蛆侵害的韭菜根系带回实验室。准备若干9cm的一次性培养皿，在培养皿内部放入一层圆 形滤纸片并滴加10ml灭菌水以维持湿度，在培养皿中添加3段韭菜，用小毛笔从受害韭菜根 部或鳞茎部挑取韭蛆，放入准备好的培养皿中备用。
39.昆虫病原线虫epns：斯氏线虫steinernema feltiae(sf)、异小杆线虫heterorhabditisbacteriophora(hb)由美国农业部农业研究所(usda-ars)david博士赠送，并在本实验室进 行保种扩繁。准备24孔板，每孔放置一条健康有活力的大蜡螟幼虫，取epns溶液估测其密 度，保证每个孔内加入约100ijs，置于恒温避光培养箱25℃培养。约48h后大蜡螟死亡，两 天后将大蜡螟尸体转移到white trap装置，一周左右收集大培养皿中的线虫溶液，用灭菌水 清洗3遍后转入细胞培养瓶，保存于14℃待用。
40.进行溶解氧电极的标定，标定方法参考pbj
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8608型便携式溶解氧测定仪说明书。称取 1g亚硫酸钠(分析纯)加入1l蒸馏水中，制备1g/l的过量亚硫酸钠母液，从母液中取出200ml 于另外大烧杯，将烧杯置于磁力搅拌器上，放入适合长度的转子，打开磁力搅拌器调整转速， 使转子在烧杯中稳定旋转，将无菌水清洗并调零后的溶解氧测定仪电极浸入被测溶液中(注 意不要有气泡)，随后向其中缓慢添加未经处理的蒸馏水，期间持续监测溶解氧浓度，直至溶 解氧浓度调整为目标浓度且数值稳定后(约1min)，读取数据，数据包括实时温度、溶解氧氧 浓度、饱和度和电极电流值。
41.对于充足氧(常氧)溶液的制备，由于溶解氧浓度与温度有关，蒸馏水中溶解氧溶度有 时低于7.5mg/l，需要用增氧泵对蒸馏水充氧，直至其浓度保持在8.0mg/l方可用于实施例 中的试验。
42.实施例1溶解氧浓度对线虫hb和sf的影响试验
43.试验包括两个因子(1)溶解氧浓度；(2)浸泡时间。
44.试验在50ml塑料杯中进行，每杯中分别加入配置好的溶解氧浓度为1.5mg/l、4.0mg/l、 8.0mg/l的溶液80ml，再快速加入10ul(10ijs/μl)活性较好的hb或sf线虫溶液(以保存 于细胞培养瓶的hb线虫溶液作为绝对对照)，用铝箔密封试验装置，阻挡水与外界空气进行 气体交换。试验设置6个淹水处理时间，即2h、4h、8h、16h、24h及48h，每处理组设 5个重复。处理相应时间后用显微镜计数并记录hb的死亡情况，镜下呈僵直、瘫痪态的线虫 为死亡。整个试验重复两次，共2
×4×6×
5＝240杯。溶解氧浓度对线虫hb的影响结果如图1 所示，溶解氧浓度对线虫hb的影响结果如图2所示。
45.由图1的结果可知，各个处理组中hb死亡率均高于对照组。两次试验中溶解氧浓度和 浸泡时间造成的hb死亡率表现出相似的趋势。试验1和试验2中，溶液溶解氧浓度对hb 的死亡率有显著的影响(试验1，f2,72＝5.79，p＝0.005《0.05；试验2，f2,72＝54.8，p《0.001)， 浸泡时间对hb死亡率也有显著影响(试验1，f5,72＝39.6，p《0.001；试验2，f5,72
＝49.1， p《0.001)。hb的死亡率随着溶解氧浓度的降低而增高，试验1中，溶解氧浓度为1.5mg/l 和4.0mg/l条件下，hb死亡率间无差异，但均高于8.0mg/l条件下hb死亡率；试验2中， 溶解氧浓度为1.5mg/l和4.0mg/l条件下，hb死亡率也有显著差异，溶解氧浓度为4.0mg/l 和7.5mg/l条件下，hb死亡率的差异也是显著的。随着淹水处理时间的延长，hb的死亡率 也逐步增大。试验1中，溶解氧浓度与浸泡时间无交互作用(f10,72＝1.4，p＝0.197)，而在 第二次试验中，溶解氧浓度与浸泡时间表现出交互作用(f10,72＝4.7，p《0.001)
46.由图2的结果可知，各个处理组中sf死亡率均显著高于对照组。溶解氧浓度对sf死亡 率有显著的影响(f2,162＝25.3，p《0.001)，浸泡时间对sf死亡率也有显著影响(f5,162＝255， p《0.001)。sf的死亡率随着溶解氧浓度的降低而增高，溶解氧浓度为1.5mg/l、4.0mg/l和 7.5mg/l条件下，sf死亡率的差异都是显著的。随着淹水处理时间的延长，线虫的死亡率也 逐步增大，浸泡2h、4h、8h、16h、24h或者48h后sf的死亡率间均有显著差异，死亡率分 别为27.7％、40.3％、60.1％、75.7％、86.7％和93.6％。溶解氧浓度与浸泡时间对sf死亡率的 影响也表现出交互作用(f10,162＝2.4，p《0.05)。
47.不同处理间sf的死亡率也是有显著性差异的(f18,189＝100.9，p《0.001)溶解氧浓度为 1.5mg/l溶液浸泡2h、4h、48h后，sf的死亡率分别为35.8％、49.7％、94.2％。溶解氧浓度 为8mg/l的情况下，浸泡2h、8h和48h后，sf的死亡率分别为23.9％％、54.4％、89.7％。
48.试验结果表明，溶解氧溶度和在溶液中浸泡的时间长短对s.feltiae和h.bacteriophora.的 存活均会产生不良影响，并且溶解氧浓度与浸泡时间之间还有交互作用。
49.随着溶解氧浓度的降低和浸泡时间的延长，两种epns的死亡率均会增大，但是似乎sf 更容易受到溶解氧浓度和水淹的影响，sf在溶解氧浓度为1.5mg/l的溶液浸泡2h后，就造 成sf 35.8％的死亡率，48h后其死亡率达到94.2％，即使是溶解氧浓度为8mg/l的条件下， 浸泡48h后，sf死亡率也高达89.7％，而同等条件下hb的死亡率仅仅约为sf的二分之一。 文献报道，利用水淹或者灌溉至少需要持续数天才可起到可观的杀灭韭蛆的效果，所以即使 是本实验中表现良好的hb，想要低氧水淹和epns同时发挥作用防治韭蛆也是不可行的。
50.实施例1的结果说明了hb和sf这两种品系对低氧或者淹水都是不耐受的，因此我们采 取对韭蛆用低氧水淹预处理后再接种hb和sf的方式来探究溶解氧浓度与昆虫病原线虫结合 对韭蛆的防治效果。
51.实施例2
52.试验包括2个因子：(1)四个溶解氧浓度：0、1.5、4、8mg/l；(2)昆虫病原线虫：无 epns，sf，hb。
53.共包括15个处理:
54.1)0mg/l；2)0mg/l，sf；3)0mg/l，hb；
55.4)1.5mg/l；5)1.5mg/l，sf；6)1.5mg/l，hb；
56.7)4mg/l；8)4mg/l，sf；9)4mg/l，hb；
57.10)8mg/l；11)8mg/l，sf；12)8mg/l，hb；
58.还有三个对照，13)不淹水且不添加epns；14)接种sf；15)接种hb。
59.第一步淹水预处理在100ml塑料杯中进行。从挑取于培养皿中备用的韭蛆中随机挑选10 条四龄幼虫，置于塑料杯底部，随后每杯分别加入配置好的不同溶解氧浓度的溶液80ml，用 铝箔密封试验装置，防止幼虫逸出并阻挡水与外界空气气体交换。低氧胁迫预处理2h，2h后 除去塑料杯中的溶液，将韭蛆缓慢转移至直径3厘米并添加有一张湿润滤纸的塑料培养皿中， 对照组中直接随机挑选10条备用韭蛆置于3cm并添加有一张湿润滤纸的塑料培养皿中。线 虫溶液接种量为100条(20ijs/μl)。分别在epns侵染12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、 96h、108h以及120h后观察韭蛆的死亡情况。用小毛笔触碰韭蛆，静止不动的为死亡状态。 每个处理组及对照组设5个重复，整个试验重复两次。共2
×
15
×
5＝150皿。结果如表1和图3 所示。
60.由表1和图3的结果可知，与对照组相比，经过淹水预处理后韭蛆死亡率均有所升高。 溶解氧浓度为0mg/l和1.5mg/l的溶液预处理韭蛆2h造成的死亡数始终无显著差异，4mg/l 造成的韭蛆死亡率始终高于8mg/l，36h、48h、84h以及之后的调查是有显著性差异的，同 时4mg/l造成的韭蛆死亡率始终显著低于0mg/l和1.5mg/l处理中韭蛆的死亡率。总体而 言，在一定范围内，随着溶解氧浓度的降低，韭蛆死亡数会增加。
61.两种epn侵染造成的韭蛆的死亡率均高于不接种epn的处理，在本试验取的10个检测 韭蛆死亡率的时间点，sf或hb的添加均使得韭蛆死亡数升高，sf始终显著高于对照，hb在 24h后的调查显示韭蛆死亡率显著高于对照。对于sf和hb的比较，12h-48h的四次调查结果 显示，sf对韭蛆的致死效果强于hb，但是在60h及更长时间调查时，接种hb后韭蛆的死亡 率超过了sf。
62.60h后，除了不添加epns，各处理韭蛆的死亡率均达到80％及以上，且死亡数不会再随 着侵染时间加长有显著的提高。
63.侵染24h之前，利用0mg/l及1.5mg/l溶液单独淹水2h致死韭蛆的数量高于单独接种 sf或hb，而4mg/l和8mg/l单独淹水处理对韭蛆致死能力低于单独接种线虫，由于sf和 hb侵染韭蛆后可以持续防治，36h后单独接种sf造成的韭蛆死亡率超过单独低氧水淹处理， 说明低氧水淹在短时间内有较好的防控，而sf可以持久地发挥作用，为节约除氧剂的使用， 建议可以选择1.5mg/l。36h调查还发现，8mg/l低氧水预处理后接种线虫的韭蛆死亡数超 过未预处理的效果，即水淹预处理加强了epns的致死能力，二者起到了协同增效的作用。
64.表1
[0065][0066]
溶解氧浓度和浸泡时间对韭蛆的死亡也是有显著影响的，两因子之间也存在交互作用， 淹水4h韭蛆的死亡率接近淹水2h死亡率的2倍。但是在极低溶解氧溶度甚至接近于完全缺 氧的条件中，溶解氧对韭蛆的影响不再随着氧浓度的降低而升高了，比如在溶解氧浓度为0 mg/l、0.5mg/l条件下，韭蛆死亡数是没有显著性差异的，即使在韭蛆恢复实验中也是相同 的结果。
[0067]
结果显示溶解氧浓度和epn对淹水预处理—韭蛆死亡数均有显著的影响，且在24h后表 现交互作用。首先，经过淹水预处理的韭蛆死亡率均高于直接侵染，可以肯定的是淹水预处 理可以提高韭蛆的死亡数。其次本试验证明了低氧胁迫也提高了韭蛆的死亡数，在一定的范 围内，韭蛆死亡数随溶解氧浓度的降低而升高，如本试验中4mg/l造成的韭蛆死亡率始终高 于8mg/l，同时4mg/l造成的韭蛆死亡率显著低于0mg/l和1.5mg/l处理。但是我们注意 到0mg/l和1.5mg/l的溶解氧浓度对韭蛆的死亡数始终不存在显著差异，即溶解氧浓度降低 到一定程度后，昆虫死亡率不再继续随溶解氧的降低而增高。第三，试验结果证明epn的添 加提高了韭蛆的死亡率，本试验中不论接种sf或hb，造成的韭蛆死亡数均高于不接种epns 的处理，10次调查均表明sf造成的死亡率显著高于对照，并且在12h—48h调查时，sf的致 死效果优于hb，侵染60h及更长时间检测时，hb反超了sf，而前人的研究表示，与sf相 比，hb防控韭蛆的效果更好，本试验中结论与前人有所区别的原因可能是关乎epns发挥作 用最适的环境相关。更重要的是，与单独低氧水淹或者使用epns相比，联合使用两种方法 起到了增效的作用。
[0068]
不同溶解氧浓度处理后进行基因水平的研究，通过与饱和溶解氧相比，中低溶解氧条件 下hif-1转录水平上调，饱和溶解氧条件下的低氧胁迫更倾向于能量补偿反应，而中低溶解 氧的低氧环境使更多的抗氧化损伤基因上调表达。
[0069]
控制水淹处理中溶解氧浓度在4mg/l以下的试剂可提高低氧诱导因子-1的表达，进一步 的讲，可提高低氧诱导因子-1的转录水平的表达或低氧诱导因子-1的蛋白水平的表达。
[0070]
实施例3除氧剂对韭蛆的影响
[0071]
四种亚硫酸盐低氧胁迫对韭蛆的影响：分别配置浓度为1％的焦亚硫酸钠溶液、焦亚硫酸 钾溶液、亚硫酸钠溶液、亚硫酸钾溶液。试验在100ml塑料杯中进行。从挑取于培养皿中备 用的韭蛆中随机挑选10条四龄幼虫，置于塑料杯底部，随后每杯中分别加入配置好的4种亚 硫酸盐溶液80ml，对照组塑料杯中加80ml自来水，用铝箔密封试验装置，防止幼虫逸出并 阻挡水与外界空气气体交换，处理4h后除去溶液，使韭蛆在空气中恢复2h测定死亡数。每 处理设9个重复，用小毛笔触碰韭蛆，静止不动的为死亡状态。整个试验重复两次，共2
×5×
9＝90 杯；结果如图4所示。由图4的结果可知，1％焦亚硫酸钠致死韭蛆的效果最佳，并且2小时 复苏率较小，可以初步认为是一种较好的对韭蛆进行低氧胁迫的除氧试剂。
[0072]
本技术还设计了不同浓度焦亚硫酸钠对韭蛆的影响：分别配置浓度分别为0.1％、0.2％、 0.4％及1％的焦亚硫酸钠溶液，对照组使用自来水。方法步骤同上，结果如图5所示。由图5 的结果可知，浓度为1％的焦亚硫酸钠对韭蛆致死程度最高、且2小时复苏率最小。
[0073]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视 为本发明的保护范围。