用于靶向整合的方法与流程

技术特征：
1.一种用于将供体载体靶向整合到分离的真核细胞的预定基因组位置内的方法，所述方法包括：i)提供包含预定基因组位置的分离的真核细胞，所述预定位置包括：a. 包含第一dna酶的识别位点的核酸序列i1；b. 包含第二dna酶的识别位点的核酸序列e1；和c. 启动子核酸序列p1；ii)提供供体载体，其包含：a. 核酸序列i2；b. 目的核酸序列；c. 包含所述第二dna酶的识别位点的核酸序列e2；d. 编码第一选择标记物的核酸序列；e. 任选地编码第二选择标记物的表达盒；iii)在第一dna酶的存在下使供体载体与细胞接触，其中所述第一dna酶的存在使得供体载体的核酸序列i2和细胞的预定基因组位置中存在的核酸序列i1之间能够进行重组；iv)通过检测细胞中的第一选择标记物的表达，来选择具有在预定基因组位置处整合的供体载体的细胞，其中所述第一选择标记物的表达通过在预定基因组位置处的启动子核酸序列p1激活；和v)分离在上一步中选择的细胞。2.前述权利要求的方法，其进一步包括步骤vi)，其包括在第二dna酶的存在下，从权利要求1的步骤v)中分离的细胞的预定基因组位置处切除侧翼为核酸序列e1和e2的核酸序列，其中所述第二dna酶的存在使得核酸序列e1和e2之间能够进行重组，其中在所述细胞中侧翼为核酸序列e1和e2的核酸序列的存在是供体载体稳定整合到细胞的预定基因组位置内的指示。3.权利要求2的方法，其中步骤vi)构成步骤iii)的部分，或者在步骤iii)之后执行，例如在步骤iv)之后或在步骤v)之后执行。4.权利要求3的方法，其中步骤vi)在步骤v)之前执行。5.权利要求4的方法，其中步骤ii)的供体载体进一步包含e)编码第二选择标记物的表达盒，并且其中步骤v)中分离的细胞另外已基于其不表达第二选择标记物进行选择，其中所述第二选择标记物的表达表示供体载体已在与细胞的预定基因组位置不同的位置处整合。6.权利要求3的方法，其中步骤vi)在步骤v)之后执行，并且所述方法进一步包括在步骤vi)之后执行的步骤vii)，其包括分离其中侧翼为核酸序列e1和e2的所述核酸序列已从步骤vi)中分离的细胞的预定基因组位置处切除的细胞。7.权利要求6的方法，其中步骤ii)的供体载体进一步包含e)编码第二选择标记物的表达盒，并且其中步骤vii)中分离的细胞已基于其不表达第二选择标记物进行选择，其中所述第二选择标记物的表达表示供体载体已在与细胞的预定基因组位置不同的位置处整合。8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤ii)的供体载体的目的核酸序列包含至少一个表达盒，所述表达盒包含编码目的蛋白质的基因。9.当从属于权利要求2-7中任一项时的权利要求8的方法，其中切除的核酸序列缺乏所
述至少一个表达盒，所述表达盒含有编码目的蛋白质的基因。10. 前述权利要求中任一项的方法，其中步骤ii)的供体载体进一步包括：f．包含第一dna酶的识别位点的核酸序列i3；和g. 启动子核酸序列p2。11.当从属于权利要求9时的权利要求10的方法，其进一步包括执行将n种另外的供体载体序贯靶向整合到真核细胞的预定基因组位置内，其中n为≥ 1的整数；所述方法包括：(a)将第一种另外的供体载体整合到细胞的预定基因组位置内，其包括：viii. 提供权利要求5的步骤v)中分离的或者权利要求6或7的步骤vii)中分离的细胞；ix. 提供供体载体，其包含：a. 核酸序列i4，其在所述第一dna酶的存在下，能够与上一步提供的细胞中存在的相应核酸序列i3重组；b. 目的核酸序列；c. 核酸序列e2；d. 编码第一选择标记物的核酸序列；和e. 任选地编码第二选择标记物的表达盒；f. 任选地包含第一dna酶的识别位点的核酸序列i1和启动子核酸序列p1；x. 在第一dna酶的存在下将步骤ii)的供体载体引入细胞内，其中所述第一dna酶的存在使得供体载体的核酸序列i4和细胞的预定基因组位置中存在的核酸序列i3之间能够进行重组；xi. 通过检测细胞中的第一选择标记物的表达，来选择具有在预定基因组位置处整合的供体载体的细胞，其中所述第一选择标记物的表达通过在细胞的预定基因组位置处的启动子核酸序列p2激活；xii. 分离上一步中选择的细胞；xiii. 在第二dna酶的存在下，从步骤v中分离的细胞的预定基因组位置处切除侧翼为核酸序列e1和e2的核酸序列，其中所述第二dna酶的存在使得核酸序列e1和e2之间能够进行重组，其中在所述细胞中侧翼为核酸序列e1和e2的核酸序列的存在是供体载体稳定整合到细胞的预定基因组位置内的指示；xiv. 分离其中侧翼为序列e1和e2的所述核酸序列已从步骤vi)中分离的细胞的所述预定基因组位置处切除的细胞；(b)如果n大于在上一步中分离的细胞的预定基因组位置处整合的另外供体载体的数目，则将另外的供体载体整合到细胞的预定基因组位置内，其包括：iii. 提供在上一步中分离的细胞，所述细胞包含在预定基因组位置处整合的核酸序列i1；iv. 执行权利要求1或10的步骤ii)、权利要求1的步骤iii)-iv)、权利要求1或5的步骤v)、权利要求2-4或6中任一项的步骤vi)和权利要求6或7的步骤vii)；(c)如果n大于在上一步中分离的细胞的预定基因组位置处整合的另外供体载体的数
目，则将另外的供体载体整合到细胞的预定基因组位置内，其包括：iii. 提供通过执行上一步(b)获得的细胞，所述细胞包含在预定基因组位置处整合的核酸序列i3；iv. 重复步骤(a)ii至(a)ix和步骤(b)，直到细胞具有在预定基因组位置处整合的n种另外的供体载体。12.权利要求1-8中任一项的方法，其中：
‑ꢀ
权利要求1的步骤i)的细胞包含n个预定基因组位置，其各自分别包含核酸序列i，i11至i1
n
，其中所述i11至i1
n
彼此不同；
‑ꢀ
权利要求1的步骤ii)包括提供1至n种供体载体，所述1至n种供体载体各自分别包含核酸序列i21至i2
n
，其能够在所述第一dna酶的存在下，与所述供体载体的相应的i11至i1
n
核酸序列重组，并且所述1至n种供体载体各自包含第一选择标记物sm1至sm
n
，其中所述sm1至sm
n
彼此不同；
‑ꢀ
权利要求1的步骤iv)包括将1至n种供体载体引入细胞内；
‑ꢀ
权利要求1的步骤v)包括通过检测细胞中不同的第一选择标记物sm1至sm
n
中的每一种，来选择具有在其相应的预定基因组位置处整合的1至n种供体载体中的每一种的细胞；其中n为≥ 2的整数。13.权利要求8的方法，其中权利要求1的步骤ii)的供体载体进一步包括：f．包含第一dna酶的识别位点的核酸序列i3；和；g. 启动子核酸序列p2，和其中切除的序列包含含有编码目的蛋白质的基因的表达盒。14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一dna酶是重组酶。15. 权利要求14的方法，其中：(a) i1包含两种重组酶识别位点变体i1a和i1b；和(b) i2包含两种重组酶识别位点变体i2a和i2b；和(c)在所述第一dna酶的存在下，i1a能够与i2a重组并且i1b能够与i2b重组。16.权利要求15的方法，其中i1a与i2a等同并且i1b与i2b等同。17.权利要求16的方法，其中i1a、i1b、i2a和i2b分别选自loxp、rox或frt或其变体，并且其中所述第一dna酶分别选自cre重组酶、dre重组酶和flp重组酶。18. 权利要求14的方法，其中：(a) i1包含单个重组酶识别位点；和(b) i2包含单个重组酶识别位点；和(c) i1和i2能够在所述第一dna酶的存在下重组。19.权利要求18的方法，其中由i1包含的重组酶识别位点在序列上不同于由i2包含的重组酶识别位点。20.权利要求19的方法，其中所述重组酶识别位点选自attb、attp或其变体。21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述重组酶是phic31或bxb1重组酶或其突变体。22.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述第一dna酶是基因编辑核酸酶。23. 权利要求22的方法，其中：
(a) i1包含所述基因编辑核酸酶的切割位点以及两个序列区域lha1和rha1；和(b) i2包含与lha1和lha2同源的两个序列区域lha2和rha2；以及(c) i1和i2能够在所述第一dna酶的存在下重组。24. 权利要求22-23中任一项的方法，其中所述基因编辑酶选自(i)锌指核酸酶(zfn)；(ii)归巢核酸内切酶，例如大范围核酸酶；(iii) talens和(iv) dna或rna引导的核酸酶，例如crispr/cas 9。25.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列e1和e2分别是等同的重组酶识别位点，例如loxp、rox或frt或其变体，条件是e1和e2不同于i1和i2。26.权利要求24-25的方法，其中所述第二dna酶选自cre重组酶、dre重组酶和flp重组酶，条件是所述第一dna酶不是cre重组酶、dre重组酶或flp重组酶。27.前述权利要求中任一项的方法，其中当在所述预定基因组位置处整合时，所述启动子核酸序列p1和/或p2与断裂内含子的5'部分在功能上融合。28.前述权利要求中任一项的方法，其中所述切除的核酸序列包含：(a)编码第一选择标记物的所述核酸序列；(b)所述启动子核酸序列p1或p2；和/或(c)编码第二选择标记物的所述表达盒。29.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一选择标记物选自(i)荧光蛋白和(ii)异源细胞表面标记物。30.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一dna酶以质粒、mrna或纯化蛋白质的形式提供，任选地其中所述第一dna酶由所述供体载体编码并由其表达。31.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二dna酶以质粒、mrna或纯化蛋白质的形式提供。32.权利要求1-5或8-30中任一项的方法，其中步骤ii)的所述供体载体进一步包含编码第二dna酶的表达盒，当所述供体载体已整合到步骤i)的细胞的预定基因组位置内时，所述第二dna酶的表达得到激活。33.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一dna酶由编码所述第一dna酶的表达盒表达，所述表达盒存在于步骤i)的细胞的预定基因组位置中。34.前述权利要求中任一项的方法，其中所述真核细胞选自酵母细胞、丝状真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。35.一种分离的真核细胞，其可通过前述权利要求中任一项的方法获得。36.一种用于生产重组蛋白质的方法，所述方法包括：i)通过执行权利要求1至34中任一项的方法，获得包含在预定基因组位置处整合的一种或多种目的核酸序列的分离的真核细胞，其中至少一种目的核酸序列包含至少一个表达盒，所述表达盒包含编码目的蛋白质的基因；ii)在步骤i)的所述细胞中，产生由目的基因编码的蛋白质；和iii)分离步骤ii)的蛋白质。

技术总结
本公开内容涉及用于将供体载体靶向整合到分离的真核宿主细胞的特定预定基因组位置内的方法。载体和宿主细胞一起包含允许选择细胞的核酸组分，所述细胞已将供体载体整合到宿主细胞的预定基因组位置内。另外，它提供了供体载体任何随机整合到宿主细胞基因组的其它部分内的鉴定。一旦鉴定，此类细胞就呈现了用于后续重组蛋白质生产的极佳替代物。于后续重组蛋白质生产的极佳替代物。于后续重组蛋白质生产的极佳替代物。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：思拓凡瑞典有限公司
技术研发日：2021.04.06
技术公布日：2023/1/31