用于治疗冠状病毒感染的弗林蛋白酶抑制剂的制作方法

用于治疗冠状病毒感染的弗林蛋白酶抑制剂1.相关申请2.本技术根据35u.s.c.§119(e)要求对美国临时申请，2020年4月2日提交的u.s.s.n.63/004,365，2020年4月21日提交的u.s.s.n.63/013,382，以及2021年3月3日提交的u.s.s.n.63/156,058的优先权，这些都通过参考并入本文。
背景技术：
：：3.人类基因组编码超过550种蛋白酶。这些分子剪刀在基本上所有生理过程中都发挥着重要作用。溶蛋白性裂解无疑是最重要的翻译后修饰之一，它产生了大量在细胞增殖、免疫和炎症中起关键作用的生物活性蛋白和肽。毫不奇怪，蛋白酶突变和/或蛋白酶活性异常与许多病理过程相关，包括癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病(chakrabortis,dhallans.pathophysiologicalaspectsofproteases.berlin,germany:springer,2017)。有趣的是，许多病毒病原体也利用细胞蛋白酶对其自身蛋白质进行蛋白水解加工和成熟。类似地，细菌毒素的活化经常需要被感染或中毒宿主的蛋白酶切割。4.近年来，蛋白酶活性的调节因此已成为多种感染性和非感染性疾病的潜在治疗方法。一种特别有希望的治疗干预目标是细胞蛋白酶弗林蛋白酶。这种蛋白酶极有可能裂解并激活150多种哺乳动物、病毒和细菌底物(tians,huangq,fangyetal.furindb:adatabaseof20-residuefurincleavagesitemotifs,substratesandtheirassociateddrugs.intjmolsci2011；12:5.1060–1065.)。其中包括病毒包膜糖蛋白和细菌毒素，以及如果过度活化会促进肿瘤发展和生长的细胞因子。6.弗林蛋白酶(furin)是进化上古老的前蛋白转化酶家族的成员。它们与细菌枯草杆菌蛋白酶和酵母kexin蛋白酶的相似性导致了缩写pcsk(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型)。人类编码该蛋白酶家族的九个成员(pcsk1-9)，pcsk3代表弗林蛋白酶。pcsk以其激活其他细胞蛋白的能力而闻名。在20世纪60年代已经描述了无活性前体蛋白向生物活性分子的蛋白水解转化(steinerdf,cunninghamd,spigelmanletal.insulinbiosynthesis:evidenceforaprecursor.science1967；157:697–700)。然而，弗林蛋白酶被鉴定为第一个哺乳动物前蛋白转化酶花了20多年的时间(vandevenwj,voorbergj,fontijnretalfurinisasubtilisin-likeproproteinprocessingenzymeinhighereukaryotes.molbiolrep1990；14:265–275)。迄今为止，已经描述了200多种pcsk细胞底物，包括激素、受体、生长因子和粘附分子。7.通过掺入反应性氯甲基酮(cmk)部分鉴定了一种有效的肽弗林蛋白酶抑制剂(wo2009/023306a2；gartenw,hallenbergers,ortmannd,schaferw,veym,anglikerh,etal.biochimie1994,76(3-4),217-225)。这种非选择性cmk肽(癸酰基-arg-val-lys-arg-cmk)在催化ser368残基处与弗林蛋白酶的活性位点结合，产生四面体半缩酮，使his194残基不可逆地烷基化。卤代甲基酮的这种众所周知的不可逆蛋白酶抑制机制提供了非常高和持久的效力，但也可以解释非选择性蛋白酶抑制，特别是针对其他pcsk家族成员。弗林蛋白酶在具有高度未满足医疗需求的健康和疾病中发挥着多种生物学作用。因此，具有药物样特性的强效和选择性小分子弗林蛋白酶抑制剂是一种有吸引力的方法，可以为许多疾病(如传染病)提供治疗益处。技术实现要素：8.传染病可以从一个人传播到另一个人，并且是由诸如细菌、病毒、寄生虫或真菌的病原微生物引起的。致病性是微生物引起疾病的能力，而毒力是生物体致病的程度。为了让病毒进入宿主细胞并复制，包膜糖蛋白必须被蛋白水解激活(nakayamak.biochem.j.1997,327(3),625-635)。在某些情况下，包膜糖蛋白的加工可能会影响病毒的致病性(nakayamak.biochem.j.1997,327(3),625-635)。许多毒性病毒的糖蛋白前体，例如人类免疫缺陷病毒(hiv)、禽流感病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、埃博拉病毒、炭疽病毒和寨卡病毒(zikv)，在由与弗林蛋白酶识别一致的共有序列标记的位点处被切割(thomasg.nat.rev.mol.cell.biol.2002,3(10),753-766；2,36-38)。当弗林蛋白酶抑制剂α1-pdx在细胞中表达时，hiv糖蛋白160的切割和感染性病毒的产生被阻断(nakayamak.biochem.j.1997,327(3),625-635)。因此可以想象弗林蛋白酶抑制剂在大流行情况或生物战中的治疗用途。9.本文提供的是用于治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的方法、药物组合物和试剂盒，包括向所述受试者给药治疗有效量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)的化合物的药物组合物。10.本文进一步提供预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的方法、药物组合物和试剂盒，包括向所述受试者给药预防性有效量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)的化合物的药物组合物。11.在一些方面，本文公开的方法还包括向有此需要的受试者给药另外的药剂(例如抗病毒，抗菌，抗炎)。12.本公开提供用于在受试者中降低冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)的病毒感染性的方法、药物组合物和试剂盒，包括向所述受试者给药有效量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述式(i)的药物组合物。13.在另一个方面，用于本公开的药物组合物和试剂盒包含本文所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及任选地药学上可接受的赋形剂。14.在另一个方面，用于本公开的药物组合物和试剂盒包含本文所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及任选地另外的药剂(例如，抗病毒、抗菌、抗炎、抗纤维化剂)。15.在另一个方面，本发明提供了式(i)的化合物及其药物组合物，其用于在有此需要的受试者中治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染。16.在另一个方面，本发明提供了式(i)的化合物及其药物组合物，其用于在有此需要的受试者中预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染。17.在另一个方面，本公开提供了式(i)化合物及其药物组合物在制备用于在有此需要的受试者中治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的药物中的用途。18.在另一个方面，本公开提供了式(i)化合物及其药物组合物在制备用于在有此需要的受试者中预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的药物中的用途。19.在某些实施方案中，用于本公开的式(i)的化合物具有下式:[0020][0021]或其药学上可接受的盐。[0022]在某些实施方案中，式(i)的化合物具有式(ii):[0023][0024]或其药学上可接受的盐，其中:[0025]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式(表1,#192):[0026][0027]或其药学上可接受的盐。[0028]在某些实施方案中，式(i)的化合物具有式(iii):[0029][0030]或其药学上可接受的盐。[0031]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)的化合物具有下式(表2,#219):[0032][0033]或其药学上可接受的盐。[0034]本公开的另一方面涉及试剂盒，其包含装有如本文所述的式(i)化合物或包含式(i)化合物的药物组合物的容器。本文所述的试剂盒可包括单剂量或多剂量的化合物或药物组合物。试剂盒可用于本公开的方法。在某些实施方案中，试剂盒进一步包含另外的药剂。在某些实施方案中，该试剂盒还包括使用该化合物或药物组合物的说明书。本文所述的试剂盒还可以包括监管机构如美国食品和药物管理局(fda)要求的信息(例如处方信息)。[0035]本公开的某些实施方案的细节在某些实施方案的详细描述中阐述，如下所述。本公开的其他特征、目的和优点将从定义、实施例、附图和权利要求中显而易见。[0036]定义[0037]术语在其通常和公认的含义内使用。以下定义旨在阐明但不限制本文定义的术语。[0038]以下更具体地描述具体官能团和化学术语的定义。化学元素是根据handbookofchemistryandphysics,第75版内页的cas版本元素周期表所定义，且总体来说具体官能团也根据其中所述而定义。此外，在thomassorrell,organicchemistry,universitysciencebooks,sausalito,1999；michaelb.smith,march’sadvancedorganicchemistry,第7版,johnwiley&sons,inc.,newyork,2013；richardc.larock,comprehensiveorganictransformations,johnwiley&sons,inc.,newyork,2018；和carruthers,somemodernmethodsoforganicsynthesis,第3版,cambridgeuniversitypress,cambridge,1987中描述了有机化学的一般原则以及具体官能团和反应性。[0039]本文所述的化合物可包含一个或多个非对称中心，并因此可以不同立体异构体形式存在，如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可为单一对映异构物、非对映异构体或几何异构体的形式，或可为立体异构体混合物的形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。可通过本领域技术人员已知的方法将异构体从混合物中分离，包括手性高效液相色谱(hplc)以及手性盐的形成和结晶；或者可通过不对称合成制备优选的异构体。例如参见：jacques等人，enantiomers,racematesandresolutions(wileyinterscience,newyork,1981)；wilen等人,tetrahedron33:2725(1977)；eliel,e.l.stereochemistryofcarboncompounds(mcgraw–hill,ny,1962)；和wilen,s.h.,tablesofresolvingagentsandopticalresolutionsp.268(e.l.eliel,ed.,univ.ofnotredamepress,notredame,in1972)。本公开还包括本文所述的作为单个异构体的化合物，其基本不含其它异构体，或者包括作为不同异构体混合物的化合物。[0040]在式中，键为单键，虚线为单键或不存在，且键或为单键或双键。[0041]除非另外提供，否则化学式包括不包括同位素富集原子的化合物以及包括同位素富集原子的化合物。包括同位素富集的原子的化合物可能是有用的，例如，作为分析工具和/或生物测定中的探针。[0042]当列出值的范围(“范围”)时，旨在涵盖该范围内的每个值和子范围。除非另有说明，范围包括范围两端的值。例如“c1-6烷基”预期包括c1、c2、c3、c4、c5、c6、c1–6、c1–5、c1–4、c1–3、c1–2、c2–6、c2–5、c2–4、c2–3、c3–6、c3–5、c3–4、c4–6、c4–5和c5–6烷基。[0043]术语“脂族”是指烷基、烯基、炔基和碳环基团。同样，术语“杂脂族”是指杂烷基、杂烯基、杂炔基和杂环基。术语“烷基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链饱和烃基基团(“c1–20烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至12个碳原子(“c1–12烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至10个碳原子(“c1–10烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至9个碳原子(“c1–9烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至8个碳原子(“c1–8烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至7个碳原子(“c1–7烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至6个碳原子(“c1–6烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至5个碳原子(“c1–5烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至4个碳原子(“c1–4烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至3个碳原子(“c1–3烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1至2个碳原子(“c1–2烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1个碳原子(“c1烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有2至6个碳原子(“c2-6烷基”)。c1–6烷基基团的实例包括甲基(c1)，乙基(c2)，丙基(c3)(例如，正丙基，异丙基)，丁基(c4)(例如，正丁基，叔丁基，仲丁基，异丁基)，戊基(c5)(例如，正戊基，3-戊基，戊基，新戊基，3-甲基-2-丁基，叔戊基)和己基(c6)(例如，正己基)。烷基基团的其它实例包括正庚基(c7)，正辛基(c8)，正十二烷基(c12)，等。除非另有所述，烷基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的烷基”)或取代(“取代的烷基”)有一个或多个取代基(例如，卤素，如f)。在某些实施方案中，所述烷基基团为未取代的c1–12烷基(如未取代的c1–6烷基，例如，-ch3(me)，未取代的乙基(et)，未取代的丙基(pr，例如，未取代的正丙基(n-pr)，未取代的异丙基(i-pr))，未取代的丁基(bu，例如，未取代的n-丁基(n-bu)，未取代的叔丁基(tert-bu或t-bu)，未取代的仲丁基(sec-bu或s-bu)，未取代的异丁基(i-bu))。在某些实施方案中，所述烷基基团为取代的c1–12烷基(如取代的c1–6烷基，例如，–ch2f、–chf2、–cf3、–ch2ch2f、–ch2chf2、–ch2cf3，或苄基(bn))。[0044]“烷氧基”是指包含通过氧连接原子连接的烷基的基团。术语“(c1-c4)烷氧基”是指直链或支链烃基，其具有通过氧连接原子连接的至少1个至多4个碳原子。示例性“(c1-c4)烷氧基”基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基和叔丁氧基。[0045]当术语“烷基”与其他取代基组合使用时，如“卤代(c1-c6)烷基”、“(c3-c6)环烷基(c1-c4)烷基‑”或“(c1-c4)烷氧基(c2-c4)烷基‑”，术语“烷基”旨在包括二价直链或支链烃基，其中连接点经由烷基部分。术语“卤代(c1-c6)烷基”旨在表示在含有1至6个碳原子的烷基部分(其是直链或支链碳基团)的一个或多个碳原子上具有一个或多个卤素原子(其可以相同或不同)的基团。“卤代(c1-c6)烷基”基团的实例包括，但不限于，–ch2f(氟甲基)、-chf2(二氟甲基)、–cf3(三氟甲基)、–ccl3(三氯甲基)、1,1-二氟乙基、2-氟-2-甲基丙基、2,2-二氟丙基、2,2,2-三氟乙基和六氟异丙基。“(c3-c6)环烷基(c1-c4)烷基‑”基团的实例包括，但不限于，环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、环丁基乙基、环戊基乙基和环己基乙基。“(c1-c4)烷氧基(c2-c4)烷基‑”基团的实例包括，但不限于，甲氧基乙基、甲氧基异丙基、乙氧基乙基、乙氧基异丙基、异丙氧基乙基、异丙氧基异丙基、叔丁氧基乙基和叔丁氧基异丙基。[0046]术语“卤代烷基”是取代的烷基，其中一个或多个-h原子独立地被卤素例如氟、溴、氯或碘替代。“全卤代烷基”是卤代烷基的子集，是指其中所有-h原子独立地被卤素例如氟、溴、氯或碘替代的烷基。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至20个碳原子(“c1–20卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至10个碳原子(“c1–10卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至9个碳原子(“c1–9卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至8个碳原子(“c1–8卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至7个碳原子(“c1–7卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至6个碳原子(“c1–6卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至5个碳原子(“c1–5卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至4个碳原子(“c1–4卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至3个碳原子(“c1–3卤代烷基”)。在一些实施方案中，所述卤代烷基部分具有1至2个碳原子(“c1–2卤代烷基”)。[0047]在一些实施方案中，所有卤代烷基–h原子独立地替代为氟以提供“全氟烷基”基团。在一些实施方案中，所有卤代烷基–h原子独立地替代为氯以提供“全氯烷基”基团。卤代烷基基团的实例包括-chf2、-ch2f、-cf3、-ch2cf3、-cf2cf3、-cf2cf2cf3、-ccl3、-cfcl2、-cf2cl，等。[0048]术语“杂烷基”是指烷基基团，其进一步在母链的一个或多个末端位置包含(例如，插入在相邻碳原子之间)和/或放置至少一个杂原子(例如，1、2、3或4个杂原子)，如氧、氮或硫。在某些实施方案中，杂烷基基团是指在母链中具有1至20个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–20烷基”)。在某些实施方案中，杂烷基基团是指在母链中具有1至12个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–12烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至11个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–11烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至10个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–10烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至9个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–9烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至8个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–8烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至7个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–7烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至6个碳原子和1或多个杂原子的饱和基团(“杂c1–6烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至5个碳原子和1或2杂原子的饱和基团(“杂c1–5烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至4个碳原子和1或2个杂原子的饱和基团(“杂c1–4烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至3个碳原子和1个杂原子的饱和基团(“杂c1–3烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有1至2个碳原子和1个杂原子的饱和基团(“杂c1–2烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为具有1个碳原子和1个杂原子的饱和基团(“杂c1烷基”)。在一些实施方案中，杂烷基基团为在母链中具有2至6个碳原子和1或2杂原子的饱和基团(“杂c2-6烷基”)。除非另有所述，杂烷基基团的各个实例独立地为未取代的(“未取代的杂烷基”)或取代(“取代的杂烷基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述杂烷基基团为未取代的杂c1–12烷基。在某些实施方案中，所述杂烷基基团为取代的杂c1–12烷基。[0049]术语“烯基”是指具有1至20个碳原子和一个或多个碳-碳双键(例如，1、2、3或4个双键)的直链或支链烃基基团。在一些实施方案中，烯基基团具有1至20个碳原子(“c1-20烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至12个碳原子(“c1–12烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至11个碳原子(“c1–11烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至10个碳原子(“c1–10烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至9个碳原子(“c1–9烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至8个碳原子(“c1–8烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至7个碳原子(“c1–7烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至6个碳原子(“c1–6烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至5个碳原子(“c1–5烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至4个碳原子(“c1–4烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至3个碳原子(“c1–3烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1至2个碳原子(“c1–2烯基”)。在一些实施方案中，烯基基团具有1个碳原子(“c1烯基”)。所述一个或多个碳-碳双键可在内部(如在2-丁烯基中)或末端(如在1-丁烯基中)。[0050]c1–4烯基基团的实例包括甲烯基(c1)、乙烯基(c2)、1-丙烯基(c3)、2-丙烯基(c3)、1-丁烯基(c4)、2-丁烯基(c4)、丁间二烯基(c4)，等。c1–6烯基基团的实例包括上述c2-4烯基基团以及戊烯基(c5)、戊二烯基(c5)、己烯基(c6)，等。烯基的其它实例包括庚烯基(c7)、辛烯基(c8)、辛三烯基(c8)，等。除非另有所述，烯基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的烯基”)或取代(“取代的烯基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述烯基基团为未取代的c1-20烯基。在某些实施方案中，所述烯基基团为取代的c1-20烯基。在烯基基团中，立体化学未指定的c＝c双键(例如，-ch＝chch3或)可为(e)-或(z)-构型。[0051]术语“杂烯基”是指烯基基团，其进一步在母链的一个或多个末端位置包含(例如，插入在相邻碳原子之间)和/或放置至少一个杂原子(例如，1、2、3或4个杂原子)，如氧、氮或硫。在某些实施方案中，杂烯基基团是指在母链中具有1至20个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子的基团(“杂c1–20烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基基团是指在母链中具有1至12个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子的基团(“杂c1–12烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基基团是指在母链中具有1至11个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子的基团(“杂c1–11烯基”)。在某些实施方案中，杂烯基基团是指在母链中具有1至10个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子的基团(“杂c1–10烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至9个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子(“杂c1–9烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至8个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子(“杂c1–8烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至7个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子(“杂c1–7烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至6个碳原子、至少一个双键和1或多个杂原子(“杂c1–6烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至5个碳原子、至少一个双键和1或2杂原子(“杂c1–5烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至4个碳原子、至少一个双键和1或2杂原子(“杂c1–4烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至3个碳原子、至少一个双键和1个杂原子(“杂c1–3烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至2个碳原子、至少一个双键和1个杂原子(“杂c1–2烯基”)。在一些实施方案中，杂烯基基团在母链中具有1至6个碳原子、至少一个双键和1或2杂原子(“杂c1–6烯基”)。除非另有所述，杂烯基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的杂烯基”)或取代(“取代的杂烯基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述杂烯基基团为未取代的杂c1–20烯基。在某些实施方案中，所述杂烯基基团为取代的杂c1–20烯基。[0052]术语“炔基”是指具有1至20个碳原子和一个或多个碳-碳三键(例如，1、2、3或4个三键)的直链或支链烃基基团(“c1-20炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至10个碳原子(“c1-10炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至9个碳原子(“c1-9炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至8个碳原子(“c1-8炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至7个碳原子(“c1-7炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至6个碳原子(“c1-6炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至5个碳原子(“c1-5炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至4个碳原子(“c1-4炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至3个碳原子(“c1-3炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1至2个碳原子(“c1-2炔基”)。在一些实施方案中，炔基基团具有1个碳原子(“c1炔基”)。所述一个或多个碳-碳三键可在内部(如在1-丁炔基中)或末端(如在1-丁炔基中)。c1-4炔基基团的实例包括，但不限于，甲炔基(c1)、乙炔基(c2)、1-丙炔基(c3)、2-丙炔基(c3)、1-丁炔基(c4)、2-丁炔基(c4)，等。c1-6烯基基团的实例包括上述c2-4炔基基团以及戊炔基(c5)、己炔基(c6)，等。炔基的其它实例包括庚炔基(c7)、辛炔基(c8)，等。除非另有所述，炔基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的炔基”)或取代(“取代的炔基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述炔基基团为未取代的c1-20炔基。在某些实施方案中，所述炔基基团为取代的c1-20炔基。[0053]术语“碳环基”或“碳环的”是指在非芳环体系中具有3至14个环碳原子和0个杂原子的非芳族环状烃基基团(“c3-14碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至14个环碳原子(“c3-14碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至13个环碳原子(“c3-13碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至12个环碳原子(“c3-12碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至11个环碳原子(“c3-11碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至10个环碳原子(“c3-10碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至8个环碳原子(“c3-8碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至7个环碳原子(“c3-7碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有3至6个环碳原子(“c3-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有4至6个环碳原子(“c4-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有5至6个环碳原子(“c5-6碳环基”)。在一些实施方案中，碳环基基团具有5至10个环碳原子(“c5-10碳环基”)。示例性c3-6碳环基基团包括环丙基(c3)、环丙烯基(c3)、环丁基(c4)、环丁烯基(c4)、环戊基(c5)、环戊烯基(c5)、环己基(c6)、环己烯基(c6)、环己二烯基(c6)，等。示例性c3-8碳环基基团包括上述c3-6碳环基基团以及环庚基(c7)、环庚烯基(c7)、环庚二烯基(c7)、环庚三烯基(c7)、环辛基(c8)、环辛烯基(c8)、双环[2.2.1]庚基(c7)、双环[2.2.2]辛基(c8)，等。示例性c3-10碳环基基团包括上述c3-8碳环基基团以及环壬基(c9)、环壬烯基(c9)、环癸基(c10)、环癸烯基(c10)、八氢-1h-茚基(c9)、十氢萘基(c10)、螺[4.5]癸基(c10)，等。示例性c3-8碳环基基团包括上述c3-10碳环基基团以及环十一烷基(c11)、螺[5.5]十一烷基(c11)、环十二烷基(c12)、环十二烯基(c12)、环十三烷(c13)、环十四烷(c14)，等。如前述实施例所示，在某些实施方案中，碳环基团是单环(“单环碳环基”)或多环(例如，包含稠合、桥接或螺环系统，例如双环系统(“双环碳环基”)或三环系统(“三环碳环基”))并且可以是饱和的或可以包含一个或多个碳-碳双键或三键。“碳环基”还包括环系统，其中如上定义的碳环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中连接点在碳环基环上，并且在这种情况下，碳数继续表示碳环系统中的碳原子数。除非另有所述，碳环基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的碳环基”)或取代(“取代的碳环基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述碳环基基团为未取代的c3-14碳环基。在某些实施方案中，所述碳环基基团为取代的c3-14碳环基。[0054]在一些实施方案中，“碳环基”为具有3至14个环碳原子的非芳族、单环、饱和碳环基基团(“c3-14环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基基团具有3至10个环碳原子(“c3-10环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基基团具有3至8个环碳原子(“c3-8环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基基团具有3至6个环碳原子(“c3-6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基基团具有4至6个环碳原子(“c4-6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基基团具有5至6个环碳原子(“c5-6环烷基”)。在一些实施方案中，环烷基基团具有5至10个环碳原子(“c5-10环烷基”)。c5-6环烷基基团的实例包括环戊基(c5)和环己基(c5)。c3-6环烷基基团的实例包括上述c5-6环烷基基团以及环丙基(c3)和环丁基(c4)。c3-8环烷基基团的实例包括上述c3-6环烷基基团以及环庚基(c7)和环辛基(c8)。除非另有所述，环烷基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的环烷基”)或取代(“取代的环烷基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述环烷基基团为未取代的c3-14环烷基。在某些实施方案中，所述环烷基基团为取代的c3-14环烷基。在某些实施方案中，所述碳环基在碳环环体系中包括0、1、或2个c＝c双键，只要化合价允许。示例性“(c3-c6)环烷基”基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。[0055]术语“杂环基”或“杂环”是指具有环碳原子和1至4个环杂原子的3至14元非芳香环系统的基团，其中每个杂原子独立地为氮、氧或硫(“3-14元杂环基”)。在含有一个或多个氮原子的杂环基中，如果化合价允许，连接点可以是碳原子或氮原子。杂环基可以是单环(“单环杂环基”)或多环(例如，稠合、桥接或螺环系统，例如双环系统(“双环杂环基”)或三环系统(“三环杂环基”))，并且可以是饱和的或可以含有一个或多个碳-碳双键或三键。杂环基多环系统可以在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。[0056]“杂环基”还包括以下环系统，其中如上定义的杂环与一个或多个碳环基团稠合，其中连接点在碳环或杂环基环上，或以下环系统，其中如上定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中连接点在杂环基环上，并且在这种情况下，环成员的数目继续表示杂环基环系统中的环成员的数目。除非另有所述，杂环基的每个实例独立地为未取代的(“未取代的杂环基”)或取代(“取代的杂环基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述杂环基基团为未取代的4–11元杂环基。在某些实施方案中，所述杂环基基团为取代的4–11元杂环基。在某些实施方案中，所述杂环基为取代或未取代的，3-至7-元，单环杂环基，其中杂环体系中1、2或3原子独立地为氧、氮或硫，只要化合价允许。[0057]在一些实施方案中，杂环基基团为具有环碳原子和1–4个环杂原子的5–10元非芳环体系，其中各个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5–10元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基基团为具有环碳原子和1–4个环杂原子的5–8元非芳环体系，其中各个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5–8元杂环基”)。在一些实施方案中，杂环基基团为具有环碳原子和1–4个环杂原子的5–6元非芳环体系，其中各个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5–6元杂环基”)。在一些实施方案中，所述5–6元杂环基基团具有1–3个环杂原子，如氮、氧或硫。在一些实施方案中，所述5–6元杂环基基团具有1–2个环杂原子如氮、氧或硫。在一些实施方案中，所述5–6元杂环基基团具有1个环杂原子如氮、氧或硫。[0058]示例性包含1个杂原子的3-元杂环基基团包括氮杂环丙烷基，氧杂环丙烷基和硫杂环丙烷基。示例性包含1个杂原子的4-元杂环基基团包括氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。示例性包含1个杂原子的5-元杂环基基团包括四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。示例性包含2杂原子的5-元杂环基基团包括二氧杂环戊烷基、氧杂硫杂环戊烷基和二硫杂环戊烷基。示例性包含3杂原子的5-元杂环基基团包括三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。示例性包含1个杂原子的6-元杂环基基团包括哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基。示例性包含2杂原子的6-元杂环基基团包括哌嗪基、吗啉基、二噻烷基和二噁烷基。示例性包含3杂原子的6-元杂环基基团包括三嗪基。示例性包含1个杂原子的7-元杂环基基团包括氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。示例性包含1个杂原子的8-元杂环基基团包括氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。示例性双环杂环基基团包括吲哚啉基、异吲哚啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、四氢苯并噻吩基、四氢苯并呋喃基、四氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、八氢色烯基、八氢异色烯基、十氢萘啶基、十氢-1,8-萘啶基、八氢吡咯并[3,2-b]吡咯、吲哚啉基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基、色满基、色烯基、1h-苯并[e][1,4]二氮杂环庚三烯基、1,4,5,7-四氢吡喃并[3,4-b]吡咯基、5,6-二氢-4h-呋喃并[3,2-b]吡咯基、6,7-二氢-5h-呋喃并[3,2-b]吡喃基、5,7-二氢-4h-噻吩并[2,3-c]吡喃基、2,3-二氢-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶基、2,3-二氢呋喃并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-b]吡啶基、1,2,3,4-四氢-1,6-萘啶基，等。[0059]“芳基”是指单环或多环(如二环或三环)的4n 2芳香环系统(如具有6、10或14个在环形排列中共享的π电子)并在该芳香环系统中具有6-14个环碳原子和0个杂原子的基团(“c6-14芳基”)。在一些实施方案中，芳基基团具有六个环碳原子(“c6芳基”；如苯基)。在一些实施方案中，芳基基团具有十个环碳原子(“c10芳基”；如萘基如1–萘基和2–萘基)。在一些实施方案中，芳基基团具有十四个环碳原子(“c14芳基”；如蒽基)。“芳基”还包括环系统，其中芳基环，如上所定义，与一个或多个碳环基或杂环基基团稠合，其中连接基团或连接点位于芳基环上，且在该情况下，碳原子的数目继续被指定为芳基环系统中的碳原子数目。具体的芳基基团包括苯基、萘基、茚基和四氢萘基。除非另有所述，芳基基团的每个实例独立地为未取代(“未取代的芳基”)或取代的(“取代的芳基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述芳基基团为未取代的c6-14芳基。在某些实施方案中，所述芳基基团为取代的c6-14芳基。[0060]“芳烷基”为“烷基”的子集且是指被芳基基团取代的烷基基团，其中所述连接点在烷基部分上。[0061]术语“杂芳基”是指在芳香环系统中具有环碳原子和1至4个环杂原子的5至14元单环或多环(例如，双环，三环)4n 2芳香环系统(如具有6，10，或14个在环形排列中共享的π电子)的原子团，其中每个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5-14元杂芳基”)。含有一个或多个氮原子的杂芳基基团中，只要原子价允许，连接点可为碳或氮原子。杂芳基多环系统可在一个或两个环内包含一个或多个杂原子。“杂芳基”包括这样的环系统，其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基基团稠合，其中连接点位于杂芳基环上，且在该情况下，环成员的数目继续被指定为杂芳基环系统中环成员的数目。“杂芳基”还包括这样的环系统，其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个芳基基团稠合，其中连接点位于芳基或杂芳基环上，且在该情况下，环成员的数目继续被指定为稠合多环(芳基/杂芳基)环系统中环成员的数目。多环杂芳基基团中的一个环不含有杂原子(如吲哚基，喹啉基，咔唑基等)，连接点可位于两环之一上，即位于具有杂原子的环(如2–吲哚基)上或位于不含有杂原子的环(如5–吲哚基)上。在某些实施方案中，所述杂芳基为取代或未取代的，5-或6-元，单环杂芳基，其中杂芳基环体系中1、2、3或4个原子独立地为氧、氮或硫。在某些实施方案中，所述杂芳基为取代或未取代的9-或10-元双环杂芳基，其中杂芳基环体系中1、2、3或4个原子独立地为氧、氮或硫。[0062]在一些实施方案中，杂芳基基团为在芳环体系中具有环碳原子和1–4个环杂原子的5-10元芳环体系，其中各个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5-10元杂芳基”)。在一些实施方案中，杂芳基基团为在芳环体系中具有环碳原子和1–4个环杂原子的5-8元芳环体系，其中各个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5-8元杂芳基”)。在一些实施方案中，杂芳基基团为在芳环体系中具有环碳原子和1–4个环杂原子的5-6元芳环体系，其中各个杂原子独立地为氮、氧或硫(“5-6元杂芳基”)。在一些实施方案中，所述5-6元杂芳基具有1–3个环杂原子氮、氧或硫。在一些实施方案中，所述5-6元杂芳基具有1–2个环杂原子氮、氧或硫。在一些实施方案中，所述5-6元杂芳基具有1环杂原子氮、氧或硫。除非另有所述，杂芳基基团的每个实例独立地为未取代的(“未取代的杂芳基”)或取代(“取代的杂芳基”)有一个或多个取代基。在某些实施方案中，所述杂芳基基团为未取代的5-14元杂芳基。在某些实施方案中，所述杂芳基基团为取代的5-14元杂芳基。[0063]示例性包含1个杂原子的5-元杂芳基基团包括吡咯基、呋喃基和噻吩基。示例性包含2杂原子的5-元杂芳基基团包括咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。示例性包含3杂原子的5-元杂芳基基团包括三唑基、噁二唑基和噻二唑基。示例性包含4个杂原子的5-元杂芳基基团包括四唑基。示例性包含1个杂原子的6-元杂芳基基团包括吡啶基。示例性包含2杂原子的6-元杂芳基基团包括哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。示例性包含3或4个杂原子的6-元杂芳基基团分别包括三嗪基和四嗪基。示例性包含1个杂原子的7-元杂芳基基团包括氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性5,6-双环杂芳基基团包括吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、中氮茚基和嘌呤基。示例性6,6-双环杂芳基基团包括萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。示例性三环杂芳基基团包括菲啶基、二苯并呋喃基、咔唑基、吖啶基、吩噻嗪基、吩噁嗪基和吩嗪基。[0064]“杂芳烷基”为“烷基”的子集且是指被杂芳基基团取代的烷基基团，其中所述连接点在烷基部分上。[0065]术语“不饱和键”是指双键或三键。[0066]术语“不饱和”或“部分不饱和”是指包含至少一个双键或三键的部分。[0067]术语“饱和的”或“完全饱和的”是指不包含双键或三键的部分，例如，该部分仅包含单键。[0068]将前缀“亚”附加到基团表示该基团是二价部分，例如，亚烷基是烷基的二价部分，亚烯基是烯基的二价部分，亚炔基是炔基的二价部分，杂亚烷基是杂烷基的二价部分，杂亚烯基是杂烯基的二价部分，杂亚炔基是杂炔基的二价部分，亚碳环基是碳环基的二价部分，亚杂环基是杂环基的二价部分，亚芳基是芳基的二价部分，杂亚芳基是杂芳基的二价部分。[0069]除非另有明确规定，基团任选地被取代。术语“任选取代”是指被取代或未被取代。在某些实施方案中，烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基基团任选地被取代。“任选取代的”是指可取代或未取代的基团(例如，“取代的”或“未取代的”烷基、“取代的”或“未取代的”烯基、“取代的”或“未取代的”炔基、“取代的”或“未取代的”杂烷基、“取代的”或“未取代的”杂烯基、“取代的”或“未取代的”杂炔基、“取代的”或“未取代的”碳环基、“取代的”或“未取代的”杂环基、“取代的”或“未取代的”芳基或“取代的”或“未取代的”杂芳基基团)。一般而言，术语“取代的”是指基团上存在的至少一个-h被允许的取代基替代，例如，取代后产生稳定化合物的取代基，例如不会自发发生转变的化合物，例如通过重排、环化、消除或其他反应。除非另有说明，否则“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代位置具有取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置被取代时，该取代基在每个位置相同或不同。预期术语“取代的”包括用有机化合物的所有允许的取代基进行的取代，并且包括本文所述的导致形成稳定化合物的任何取代基。诸如氮的杂原子可以具有-h取代基和/或如本文所述的满足杂原子的化合价并导致形成稳定部分的任何合适的取代基。本公开内容无意以任何方式受限于本文所述的示例性取代基。[0070]示例性碳原子取代基包括卤素、-cn、-no2、-n3、-so2h、-so3h、-oh、-oraa、-on(rbb)2、-n(rbb)2、-n(rbb)3 x-、-n(orcc)rbb、-sh、-sraa、-ssrcc、-c(＝o)raa、-co2h、-cho、-c(orcc)2、-co2raa、-oc(＝o)raa、-oco2raa、-c(＝o)n(rbb)2、-oc(＝o)n(rbb)2、-nrbbc(＝o)raa、-nrbbco2raa、-nrbbc(＝o)n(rbb)2、-c(＝nrbb)raa、-c(＝nrbb)oraa、-oc(＝nrbb)raa、-oc(＝nrbb)oraa、-c(＝nrbb)n(rbb)2、-oc(＝nrbb)n(rbb)2、-nrbbc(＝nrbb)n(rbb)2、-c(＝o)nrbbso2raa、-nrbbso2raa、-so2n(rbb)2、-so2raa、-so2oraa、-oso2raa、-s(＝o)raa、-os(＝o)raa、-si(raa)3、-osi(raa)3-c(＝s)n(rbb)2、-c(＝o)sraa、-c(＝s)sraa、-sc(＝s)sraa、-sc(＝o)sraa、-oc(＝o)sraa、-sc(＝o)oraa、-sc(＝o)raa、-p(＝o)(raa)2、-p(＝o)(orcc)2、-op(＝o)(raa)2、-op(＝o)(orcc)2、-p(＝o)(n(rbb)2)2、-op(＝o)(n(rbb)2)2、-nrbbp(＝o)(raa)2、-nrbbp(＝o)(orcc)2、-nrbbp(＝o)(n(rbb)2)2、-p(rcc)2、-p(orcc)2、-p(rcc)3 x-、-p(orcc)3 x-、-p(rcc)4、-p(orcc)4、-op(rcc)2、-op(rcc)3 x-、-op(orcc)2、-op(orcc)3 x-、-op(rcc)4、-op(orcc)4、-b(raa)2、-b(orcc)2、-braa(orcc)、c1–20烷基、c1–20全卤代烷基、c1–20烯基、c1–20炔基、杂c1–20烷基、杂c1–20烯基、杂c1–20炔基、c3-10碳环基、3-14元杂环基、c6-14芳基和5-14元杂芳基，其中各个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个rdd基团；其中x-为抗衡离子；或碳原子上的两个孪位氢替代为基团＝o、＝s、＝nn(rbb)2、＝nnrbbc(＝o)raa、＝nnrbbc(＝o)oraa、＝nnrbbs(＝o)2raa、＝nrbb、或＝norcc；raa的每种情况独立地为，c1–20烷基、c1–20全卤代烷基、c1–20烯基、c1–20炔基、杂c1–20烷基、杂c1–20烯基、杂c1–20炔基、c3-10碳环基、3-14元杂环基、c6-14芳基、或5-14元杂芳基；或任选地，两个raa基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中所述烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基各自独立地取代有0、1、2、3、4或5个rdd基团；rbb的每种情况独立地为–h、-oh、-oraa、-n(rcc)2、-cn、-c(＝o)raa、-c(＝o)n(rcc)2、-co2raa、-so2raa、-c(＝nrcc)oraa、-c(＝nrcc)n(rcc)2、-so2n(rcc)2、-so2rcc、-so2orcc、-soraa、-c(＝s)n(rcc)2、-c(＝o)srcc、-c(＝s)srcc、-p(＝o)(raa)2、-p(＝o)(orcc)2、-p(＝o)(n(rcc)2)2、c1–20烷基、c1–20全卤代烷基、c1–20烯基、c1–20炔基、杂c1–20烷基、杂c1–20烯基、杂c1–20炔基、c3-10碳环基、3-14元杂环基、c6-14芳基、或5-14元杂芳基；或任选两个rbb基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个rdd基团；[0071]rcc的每种情况独立地为–h、c1–20烷基、c1–20全卤代烷基、c1–20烯基、c1–20炔基、杂c1–20烷基、杂c1–20烯基、杂c1–20炔基、c3-10碳环基、3-14元杂环基、c6-14芳基、或5-14元杂芳基；或任选两个rcc基团连接以形成3-14元杂环基或5-14元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个rdd基团；[0072]rdd的每种情况独立地为卤素、-cn、-no2、-n3、-so2h、-so3h、-oh、-oree、-on(rff)2、-n(rff)2、-n(rff)3 x-、-n(oree)rff、-sh、-sree、-ssree、-c(＝o)ree、-co2h、-co2ree、-oc(＝o)ree、-oco2ree、-c(＝o)n(rff)2、-oc(＝o)n(rff)2、-nrffc(＝o)ree、-nrffco2ree、-nrffc(＝o)n(rff)2、-c(＝nrff)oree、-oc(＝nrff)ree、-oc(＝nrff)oree、-c(＝nrff)n(rff)2、-oc(＝nrff)n(rff)2、-nrffc(＝nrff)n(rff)2、-nrffso2ree、-so2n(rff)2、-so2ree、-so2oree、-oso2ree、-s(＝o)ree、-si(ree)3、-osi(ree)3、-c(＝s)n(rff)2、-c(＝o)sree、-c(＝s)sree、-sc(＝s)sree、-p(＝o)(oree)2、-p(＝o)(ree)2、-op(＝o)(ree)2、-op(＝o)(oree)2、c1–10烷基、c1–10全卤代烷基、c1–10烯基、c1–10炔基、杂c1–10烷基、杂c1–10烯基、杂c1–10炔基、c3-10碳环基、3-10元杂环基、c6-10芳基、或5-10元杂芳基，其中各个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基，或杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个rgg基团，或两个孪位rdd取代基可连接以形成＝o或＝s；其中x-为抗衡离子；ree的每种情况独立地为，c1–10烷基、c1–10全卤代烷基、c1–10烯基、c1–10炔基、杂c1–10烷基、杂c1–10烯基、杂c1–10炔基、c3-10碳环基、c6-10芳基、3-10元杂环基、或3-10元杂芳基，其中各个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基，或杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个rgg基团；rff的每种情况独立地为–h、c1–10烷基、c1–10全卤代烷基、c1–10烯基、c1–10炔基、杂c1–10烷基、杂c1–10烯基、杂c1–10炔基、c3-10碳环基、3-10元杂环基、c6-10芳基或5-10元杂芳基；或任选两个rff基团连接以形成3-10元杂环基或5-10元杂芳基环，其中各个烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基独立地取代有0、1、2、3、4或5个rgg基团；rgg的每种情况独立地为卤素、-cn、-no2、-n3、-so2h、-so3h、-oh、-oc1–6烷基、-on(c1–6烷基)2、-n(c1–6烷基)2、-n(c1–6烷基)3 x-、-nh(c1–6烷基)2 x-、-nh2(c1–6烷基) x-、-nh3 x-、-n(oc1–6烷基)(c1–6烷基)、-n(oh)(c1–6烷基)、-nh(oh)、-sh、-sc1–6烷基、-ss(c1–6烷基)、-c(＝o)(c1–6烷基)、-co2h、-co2(c1–6烷基)、-oc(＝o)(c1–6烷基)、-oco2(c1–6烷基)、-c(＝o)nh2、-c(＝o)n(c1–6烷基)2、-oc(＝o)nh(c1–6烷基)、-nhc(＝o)(c1–6烷基)、-n(c1–6烷基)c(＝o)(c1–6烷基)、-nhco2(c1–6烷基)、-nhc(＝o)n(c1–6烷基)2、-nhc(＝o)nh(c1–6烷基)、-nhc(＝o)nh2、-c(＝nh)o(c1–6烷基)、-oc(＝nh)(c1–6烷基)、-oc(＝nh)oc1–6烷基、-c(＝nh)n(c1–6烷基)2、-c(＝nh)nh(c1–6烷基)、-c(＝nh)nh2、-oc(＝nh)n(c1–6烷基)2、-oc(nh)nh(c1–6烷基)、-oc(nh)nh2、-nhc(nh)n(c1–6烷基)2、-nhc(＝nh)nh2、-nhso2(c1–6烷基)、-so2n(c1–6烷基)2、-so2nh(c1–6烷基)、-so2nh2、-so2c1–6烷基、-so2oc1–6烷基、-oso2c1–6烷基、-soc1–6烷基、-si(c1–6烷基)3、-osi(c1–6烷基)3-c(＝s)n(c1–6烷基)2，c(＝s)nh(c1–6烷基)，c(＝s)nh2、-c(＝o)s(c1–6烷基)、-c(＝s)sc1–6烷基、-sc(＝s)sc1–6烷基、-p(＝o)(oc1–6烷基)2、-p(＝o)(c1–6烷基)2、-op(＝o)(c1–6烷基)2、-op(＝o)(oc1–6烷基)2、c1–10烷基、c1–10全卤代烷基、c1–10烯基、c1–10炔基、杂c1–10烷基、杂c1–10烯基、杂c1–10炔基、c3-10碳环基、c6-10芳基、3-10元杂环基、或5-10元杂芳基；或两个孪位rgg取代基可连接以形成＝o或＝s；且各个x-为抗衡离子。[0073]在某些实施方案中，所述碳原子取代基独立地为卤素，取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1-6烷基、-oraa、-sraa、-n(rbb)2、–cn、–scn、–no2、-c(＝o)raa、-co2raa、-c(＝o)n(rbb)2、-oc(＝o)raa、-oco2raa、-oc(＝o)n(rbb)2、-nrbbc(＝o)raa、-nrbbco2raa或-nrbbc(＝o)n(rbb)2。在某些实施方案中，所述碳原子取代基独立地为卤素，取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1–10烷基、-oraa、-sraa、-n(rbb)2、–cn、–scn、–no2、-c(＝o)raa、-co2raa、-c(＝o)n(rbb)2、-oc(＝o)raa、-oco2raa、-oc(＝o)n(rbb)2、-nrbbc(＝o)raa、-nrbbco2raa，或-nrbbc(＝o)n(rbb)2，其中raa为–h、取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1–10烷基、连接至氧原子时的氧保护基(例如，甲硅烷基、tbdps、tbdms、tips、tes、tms、mom、thp、t-bu、bn、烯丙基、乙酰基、新戊酰基、或苯甲酰基)、或连接至硫原子时的硫保护基(例如，乙酰氨基甲基、t-bu、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基、2-吡啶-亚磺酰基、或三苯基甲基)；且各个rbb独立地为–h、取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1–10烷基、或氮保护基(例如，bn、boc、cbz、fmoc、三氟乙酰基、三苯基甲基、乙酰基、或ts)。在某些实施方案中，所述碳原子取代基独立地为卤素、取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1-6烷基、-oraa、-sraa、-n(rbb)2、–cn、–scn或–no2。在某些实施方案中，所述碳原子取代基独立地为卤素、取代的(例如，取代有一个或多个卤素部分)或未取代的c1–10烷基、-oraa、-sraa、-n(rbb)2、–cn、–scn或–no2，其中raa为–h、取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1–10烷基、连接至氧原子时的氧保护基(例如，甲硅烷基、tbdps、tbdms、tips、tes、tms、mom、thp、t-bu、bn、烯丙基、乙酰基、新戊酰基、或苯甲酰基)、或连接至硫原子时的硫保护基(例如，乙酰氨基甲基、t-bu、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基、2-吡啶-亚磺酰基、或三苯基甲基)；且各个rbb独立地为–h、取代的(例如，取代有一个或多个卤素)或未取代的c1–10烷基、或氮保护基(例如，bn、boc、cbz、fmoc、三氟乙酰基、三苯基甲基、乙酰基、或ts)。[0074]在某些实施方案中，碳原子取代基的分子量低于250、低于200、低于150、低于100或低于50g/mol。在某些实施方案中，碳原子取代基由碳、-h、氟、氯、溴、碘、氧、硫、氮和/或硅原子组成。在某些实施方案中，碳原子取代基由碳、-h、氟、氯、溴、碘、氧、硫和/或氮原子组成。在某些实施方案中，碳原子取代基由碳、-h、氟、氯、溴和/或碘原子组成。在某些实施方案中，碳原子取代基由碳、-h、氟和/或氯原子组成。[0075]术语“卤”或“卤素”是指氟(氟、-f)、氯(氯、-cl)、溴(溴、-br)、或碘(碘、-i)。[0076]术语“羟基”或“羟基”是指基团-oh。通过扩展，术语“取代的羟基”或“取代的羟基”是指羟基基团，其中直接连接到母体分子的氧原子被-h以外的基团取代，且包括基团-oraa、-on(rbb)2、-oc(＝o)sraa、-oc(＝o)raa、-oco2raa、-oc(＝o)n(rbb)2、-oc(＝nrbb)raa、-oc(＝nrbb)oraa、-oc(＝nrbb)n(rbb)2、-os(＝o)raa、-oso2raa、-osi(raa)3、-op(rcc)2、-op(rcc)3 x-、-op(orcc)2、-op(orcc)3 x-、-op(＝o)(raa)2、-op(＝o)(orcc)2或-op(＝o)(n(rbb))2，其中x-、raa、rbb和rcc如本文所定义。[0077]“氧代”代表双键氧部分；例如，如果直接连接到碳原子上，则形成羰基部分(c＝o)。[0078]术语“氨基”是指基团-nh2。通过扩展，术语“取代的氨基”是指单取代的氨基、二取代的氨基或三取代的氨基。在某些实施方案中，所述“取代的氨基”为单取代的氨基或二取代的氨基基团。[0079]术语“单取代氨基”是指其中直接连接到母体分子的氮原子被一个-h和一个非-h基团取代的氨基，且包括-nh(rbb)、-nhc(＝o)raa、-nhco2raa、-nhc(＝o)n(rbb)2、-nhc(＝nrbb)n(rbb)2、-nhso2raa、-nhp(＝o)(orcc)2或-nhp(＝o)(n(rbb)2)2，其中raa、rbb和rcc如本文所定义，且其中基团-nh(rbb)的rbb不为–h。[0080]术语“二取代氨基”是指其中直接连接到母体分子的氮原子被两个除-h之外的基团取代的氨基，并且包括基团-n(rbb)2、-nrbbc(＝o)raa、-nrbbco2raa、-nrbbc(＝o)n(rbb)2、-nrbbc(＝nrbb)n(rbb)2、-nrbbso2raa、-nrbbp(＝o)(orcc)2或-nrbbp(＝o)(n(rbb)2)2，其中raa、rbb和rcc如本文所定义，条件是直接连接到母体分子上的氮原子不被-h取代。[0081]术语“三取代的氨基”是指直接连接到母体分子的氮原子被三个基团取代的氨基，并且包括-n(rbb)3或-n(rbb)3 x-，其中rbb和x-如本文所定义。[0082]术语“磺酰基”是指–so2n(rbb)2、–so2raa或–so2oraa，其中raa和rbb如本文所定义。[0083]术语“亚磺酰基”是指基团–s(＝o)raa，其中raa如本文定义。[0084]术语“酰基”是指具有通式-c(＝o)rx1、-c(＝o)orx1、-c(＝o)-o-c(＝o)rx1、-c(＝o)srx1、-c(＝o)n(rx1)2、-c(＝s)rx1、-c(＝s)n(rx1)2、-c(＝s)s(rx1)、-c(＝nrx1)rx1、-c(＝nrx1)orx1、-c(＝nrx1)srx1或-c(＝nrx1)n(rx1)2的基团，其中rx1为–h；卤素；取代或未取代的羟基；取代或未取代的巯基；取代或未取代的氨基；取代或未取代的酰基，环状或非环状、取代或未取代的、支链的或无支链的脂族基；环状或非环状、取代或未取代的、支链的或无支链的杂脂族基；环状或非环状、取代或未取代的、支链的或无支链的烷基；环状或非环状、取代或未取代的、支链的或无支链的烯基；取代或未取代的炔基；取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷基氧基、杂烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、脂族硫基(thioxy)、杂脂族硫基、烷基硫基、杂烷基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、单-或二-脂族氨基、单-或二-杂脂族氨基、单-或二-烷基氨基、单-或二-杂烷基氨基、单-或二-芳基氨基、或单-或二-杂芳基氨基；或两个rx1基团一起形成5-至6-元杂环。示例性酰基基团包括醛(-cho)、羧酸(-co2h)、酮、酰卤、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。酰基取代基包括但不限于本文所述的任何取代基，其导致形成稳定的部分(例如，脂族、烷基、烯基、炔基、杂脂族、杂环、芳基、杂芳基、酰基、氧代、亚氨基、硫代、氰基、异氰基、氨基、叠氮基、硝基、羟基、巯基、卤素、脂族氨基、杂脂族氨基、烷基氨基、杂烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、杂脂族氧基、烷基氧基、杂烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、脂族硫基、杂脂族硫基、烷基硫基、杂烷基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、酰基氧基，等，每一个都可能会或可能不会被进一步取代)。[0085]术语“羰基”是指其中直接连接到母体分子的碳被sp2杂化并且被氧、氮或硫原子取代的基团，例如，酮(–c(＝o)raa)、羧酸(–co2h)、醛(–cho)、酯(–co2raa、–c(＝o)sraa、–c(＝s)sraa)、酰胺(–c(＝o)n(rbb)2、–c(＝o)nrbbso2raa、-c(＝s)n(rbb)2)、或亚胺(–c(＝nrbb)raa、–c(＝nrbb)oraa)、–c(＝nrbb)n(rbb)2)，其中raa和rbb如本文所定义。[0086]如本文所用，术语“任选地”表示随后描述的事件可能发生或可能不发生，并且包括发生的事件和未发生的事件。[0087]术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指逆转、减轻、延迟如本文所述的“病理状况”(例如，传染病或一种或多种体征或其症状)的发作或抑制其进展。在一些实施方案中，可以在一种或多种体征或症状已经发展或已经观察到之后进行治疗。在其他实施方案中，可以在没有疾病或病症的体征或症状的情况下进行治疗。在某些实施方案中，可以在疑似暴露发生后进行治疗。例如，可以在症状发作之前对易感个体进行治疗(例如，根据症状史和/或根据遗传或其他易感性因素)。在症状消退后也可以继续治疗，例如延迟或防止复发。[0088]术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指对未患有和/或未患有疾病但有发生疾病的风险或曾患有疾病，目前不患疾病，但有疾病复发的风险的受试者进行预防性治疗。在某些实施方案中，与人群中的平均健康成员相比，受试者患疾病的风险更高或疾病复发的风险更高。在某些实施方案中，可在疑似暴露发生后进行预防性治疗，以防止病毒感染。在某些实施方案中，可在疑似暴露发生后进行预防性治疗，以减轻病毒感染症状的严重程度。[0089]如本文所用，术语“有效量”是指例如，研究员或临床医生寻求的将引起组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的药物或药剂的量。[0090]术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应受试者相比导致疾病、病症或副作用的改善的治疗、愈合或改善，或疾病或紊乱的进展比率降低的任何量。该术语还包括在其范围内有效增强正常生理功能的量。为了用于治疗，治疗有效量的式(i)化合物及其盐可以作为化学原料给药。为了用于治疗，治疗有效量的式(i-a)化合物及其盐可以作为原始化学品给药。此外，活性成分可以作为药物组合物存在。[0091]术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibiting)”、“抑制(inhibit)”或“抑制剂”是指相对于媒介物而言，化合物降低、减缓、停止或阻止特定生物过程的活性(例如，弗林蛋白酶活性，病毒传染性，病毒进入细胞，病毒复制，毒素活化和/或活性)的能力。[0092]预期给药的“受试者”包括但不限于人类(即，任何年龄组的男性或女性，例如儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))。在某些实施方案中，动物是哺乳动物。该动物可以是雄性或雌性并且处于任何发育阶段。在某些实施方案中，受试者以前可能对冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)的感染检测呈阳性。在某些实施方案中，受试者之前可能对冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)的感染检测呈阴性。在某些实施方案中，受试者可能表现出感染冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)的症状，如发烧、咳嗽、气短、胸闷、失嗅、失味、腹泻和/或身体疼痛。在某些实施方案中，受试者可能没有表现出感染冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)的任何症状。[0093]术语“施用”或“给药”是指将化合物或其药物组合物植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其他方式引入受试者。附图说明[0094]图1显示了s-蛋白的加工及其被弗林蛋白酶和tmprss2抑制剂阻断的模型。在s1/s2和s2’处存在弗林蛋白酶样位点有利于病毒感染。靶细胞中的tmprss2通过将ace2脱落到可溶性sace2(粗体)中来增强感染，并且还通过将s1切割成s1’，s1’与sace2形成分泌复合物来增强感染。弗林蛋白酶和tmprss2抑制剂的组合可实现对病毒感染的最佳阻断。在s1/s2(μs1/s2)处没有弗林蛋白酶样位点的情况下，高水平的tmprss2可以通过将s1切割成s1’并将ace2脱落成与s1’复合的可溶性sace2来增强感染(图1-2)。[0095]图2显示了当化合物192或化合物219以0.3μm、1μm或10μm存在时，或当癸酰基-rvkr-cmk(rvkr)以50μm存在时在veroe6(非洲绿猴肾)、bhk21(中国仓鼠肾)或a549(人肺上皮)细胞系中抑制通过内源性弗林蛋白酶样酶的前-(s)蛋白(pro-(s))(其用v5标签表达)加工成活性(s)-蛋白。[0096]图3显示pros的一级结构及其结构域和产生s1-和s2-亚基的弗林蛋白酶样s1/s2位点以及融合肽(图3a)之前的s2’位点的示意图。指示了信号肽(sp)、n末端结构域(ntd)、ace2受体结合结构域(rbd)、两个七肽重复序列hr1和hr2、跨膜结构域(tm)、胞质尾(ct)和c末端v5标记。表1中描述了针对合成肽的体外弗林蛋白酶和tmprss2切割活性。各底物在最终蛋白酶浓度分别为2和100nm(弗林蛋白酶，放大框)和50nm(tmprss2)在ph6和7.5测试。测量了体外弗林蛋白酶针对具有来自sars-cov-1、sars-cov-2和mers-cov的刺突蛋白的s1/s2和s2’切割位点序列的v5标记的pros的活性(图3b)。测量了体外弗林蛋白酶针对wt和在弗林蛋白酶样切割位点中携带s1/s2sars-cov-2取代的突变pros蛋白的活性，结果如图3c所示。还测量了s1/s2和s2’处的tmprss2切割(图3d)。s1/s2位点仅在sars-1中被tmprss2切割，而在sars2中，tmpess2于ph6在s2’处切割。在hela细胞中共同转染了它们的cdna后，通过前蛋白转化酶(proproteinconvertase)弗林蛋白酶、pc5a、pace4和pc7对wtpros加工成v5标记的s2和s2'进行了蛋白质印迹分析(图3e)。标记了未成熟prosim、s2和s2’的迁移位置以及肌动蛋白负载对照。v＝空pires-egfp-v5载体。在不存在或存在编码比例为1:1的弗林蛋白酶或tmprss2的cdna的情况下，在与编码wts-蛋白或其双ala-突变体[r685a r682a](μs1/s2)的cdna共转染后，还对hela细胞进行了蛋白质印迹分析(图3f)。*根据切割形式的v5免疫反应性与所有形式总和的比率，显示了估计的s1/s2和s2’切割百分比(图3e，3f)。数据是至少三个独立实验的代表。[0097]图4显示了pros及其s1/s2突变体通过hela细胞中的内源性蛋白酶以及弗林蛋白酶或tmprss2共表达时的比较加工。hela细胞与编码空载体(v)的cdna瞬时共转染，包括编码弗林蛋白酶、tmprss2和v5标记的wt刺突糖蛋白或其在位置p4(r682a)、p1(r685a)和p1’(s686a)的前蛋白转化酶(pc)切割位点突变体的载体。在转染后24小时，使用v5-mab对细胞裂解物进行蛋白质印迹(图4a)。显示ace2对通过弗林蛋白酶和tmprss2的刺突糖蛋白的加工的影响的蛋白质印迹如图4b所示。所用cdna的比例为s:ace2:tmprss2＝1:1:2。每个泳道下显示的加工百分比由每种蛋白质的v5免疫反应性相对于总v5免疫反应性的比率计算。数据是至少三个独立实验的代表。[0098]图5显示了本公开的代表性化合物对前蛋白转化酶(pc)的抑制。图5a显示了抑制剂的化学基序。化合物93的结构如图5b所示。图5c显示了通过前蛋白转化酶弗林蛋白酶、pc5a(pcsk5)、pace4(pcsk6)和pc7(pcsk7)的每一种的荧光二碱基底物fam-qrvrravgidk-tamra的裂解的体外抑制。所有实验均在10个不同的孔中进行，计算平均pic50(单位为nm)。为了比较，展示了进行》100次的弗林蛋白酶样抑制剂rvkr-cmk的抑制pic50。高尔基体测定：最后一栏表示本公开的化合物对表达弗林蛋白酶、pc5a、pace4和pc7中的每一种的u2os细胞的作用，所述u2os细胞同时用bacmam递送的构建体转染，所述构建体包含高尔基体靶向序列，随后是来自骨形态发生蛋白10(bmp10)的12-氨基酸弗林蛋白酶/pcsk切割位点，然后是c末端的gfp(galnac-t2-ggggs-dstarirr↓nakg-ggggs-gfp)。二碱基切割释放nakg-ggggs-gfp，从而减少通过成像估计的高尔基相关荧光。通过化合物93、192和219的弗林蛋白酶的体外抑制(图5d)。弗林蛋白酶(2nm)与具有浓度增加的化合物一起孵育，在ph7.5(n＝3)测定其对合成肽的酶活性。弗林蛋白酶抑制剂消除了刺突糖蛋白的内源性加工(图5e)。用编码空载体或表达刺突(s)糖蛋白的cdna瞬时转染hela细胞。转染后5小时不使用抑制剂(nt，重复一次)或使用指定浓度的弗林蛋白酶抑制剂或50μm的rvkr-cmk处理细胞。然后将培养基更换为不含或含有抑制剂的新鲜培养基，再放置24小时，最后使用mab-v5通过蛋白质印迹分析细胞提取物。每个泳道下显示的加工百分比是根据每种蛋白质的v5免疫反应性相对于总v5免疫反应性的比率计算的。所有数据是至少三个独立实验的代表。[0099]图6显示刺突诱导的细胞间融合依赖于s1/s2处的弗林蛋白酶切割，其使用在hiv-1长末端重复序列(ltr)(可被hivtat蛋白激活)控制下表达荧光素酶的基于hiv-1的载体稳定转染的基于发光的测定helatzm-bl报告细胞。表达促进融合的(fusogenic)sars-cov-2刺突蛋白以及hiv反式激活因子tat的供体细胞(hela)和表达ace2的受体细胞(tzm-bl)之间的细胞间融合(图6a)。融合后，tat从供体转移到受体细胞，从而诱导荧光素酶表达。在不存在(nt)或存在载体(dmso)和弗林蛋白酶抑制剂rvkr(10μm)、化合物93、化合物192和化合物219(300nm)(图6b)的情况下用表达无蛋白(ev)、μs1/s2或wt刺突(s)的载体转染供体细胞。受体细胞用表达ace2的载体转染。48小时后，细胞共培养18小时。发光被归一化为任意设置为1的ev值。数据表示为平均值±sd(n＝3)，单向方差分析，dunn-sidàk多重比较测试。用表达wt刺突、μs1/s2具有ev或tmprss2的载体(1:1比例)共转染供体hela细胞(图6c)。受体tzm-bl细胞用ace2转染。48小时后，将hela和tzm-bl共培养18小时并测量荧光素酶活性。融合表示为在每种条件下测量的相对发光单位(rlu)与在用ev和ace2受体细胞转染的供体细胞之间的共培养中测量的rlu之间的比率。数据表示为平均值±sd(n＝3)，单向方差分析，bonferroni多重比较测试。供体hela细胞表达wts或μs1/s2。受体tzm-bl细胞仅表达ev、ev ace2、ev tmprss2或ace2 tmprss2比率1:1(图6d)。融合程度表示为在每种条件下测量的rlu与在表达ev的hela细胞与相应的tzm-bl细胞之间的融合中测量的rlu之间的比率。条形图表示一式三份进行的3次实验的平均值。数据表示为平均值±sem(n＝3)，双向方差分析。[0100]图7显示通过弗林蛋白酶样转化酶的sars-cov-2s的加工对于病毒进入人肺上皮细胞至关重要，但在稳定表达ace2的模型hek293细胞中则不然(图7a)。sars-cov-2假病毒进入calu-3需要在s1/s2位点对pros进行弗林蛋白酶切割，而293t-ace2不需要。用表达荧光素酶的hiv颗粒接种细胞，这些颗粒用sars-cov-2野生型刺突(wts)或突变s(μs1/s2)假型化。每个点代表一个不同的实验，其中荧光素酶活性中值是从三个生物重复中计算出来的。对每种细胞类型进行了三或四次实验。误差条表示标准偏差(sd)。在假病毒颗粒(pseudovirion)包装过程中，通过新型弗林蛋白酶样抑制剂(化合物93)抑制s1/s2处的pros加工可防止病毒进入calu-3而在293t-ace2中不是(图7b)。每个点颜色描绘不同的实验，并显示为两到三个实验的平均值±sd(每个实验三个生物学重复)。蛋白质印迹分析显示化合物93抑制pros在s1/s2位点的加工(图7c)。在sds-page凝胶上分离经化合物93抑制剂处理或未经处理的产生293t17细胞的纯化假病毒颗粒和细胞提取物，并分析hiv-1p24和v5-标记的s-蛋白(prosm或切割的，s2)，如图所示。[0101]图8显示了弗林蛋白酶样抑制剂和卡莫司他治疗减少了calu-3细胞中的sars-cov-2感染。在感染后12、24和48小时通过噬斑测定研究复制动力学，以确定用1μm化合物93、192和219处理或未处理的感染的calu-3细胞上清液中sars-cov-2病毒的噬斑形成单位(pfu)(图8a)。折线图表示一式三份噬斑测定结果的结果(平均值±sd)。用指定浓度的化合物93处理的感染的calu-3细胞的上清液(感染后24小时)释放的病毒滴度(表示为每毫升的噬斑形成单位(pfu/ml))通过噬斑测定(一式三份的平均值±sd，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001)(左图)(图8b)。如右图所示，化合物93在calu-3细胞中的选择性指数(si)由ic50和cc50之间的选择性指数关系(cc50/ic50)确定。左侧y轴表示相对于未处理对照组(红色)的病毒滴度抑制(百分比)。右侧y轴表示相对于未处理对照组(绿色)的细胞活力(百分比)。每种抑制剂的cc50(50％细胞毒性浓度)、ic50(半数最大抑制浓度)和si(选择性指数)值如图所示。用指定剂量的化合物处理的感染的calu-3细胞的代表性噬斑图像显示在右下图中。用化合物处理和未处理的受感染的calu-3细胞(右图)和在上清液中分泌的病毒颗粒(左图)免疫印迹表明病毒蛋白水平降低(图8c)。如图所示，用免疫印迹检测病毒s蛋白和核衣壳(n)蛋白的全长(prosm)和切割(s2)片段；包括β-肌动蛋白作为细胞的负载对照。用化合物192和/或卡莫司他(camo)处理的感染的calu-3细胞的上清液(感染后24小时)中释放的病毒滴度(pfu/毫升)通过噬斑测定(一式两份的平均值±sd，*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001)(上图)(图8d)。受感染的calu-3细胞的代表性噬斑图像显示在下方的图中。[0102]图9显示了v5标记的pros及其在hela细胞中通过弗林蛋白酶和tmprss2切割的产物的endo-f和endo-h敏感性。瞬时表达：单独使用v5标记的刺突蛋白、野生型(wt)或s1/s2位点突变体(μs1/s2)的hela细胞的蛋白质提取物用endo-f和endo-h处理或模拟处理(nt)并通过使用v5-mab进行蛋白质印迹分析(图9a)。也显示了在不存在(nt)或存在以相同方式处理的pc抑制剂rvkr(50μm)或d6r(20μm)的情况下，单独或与弗林蛋白酶或tmprss2组合的刺突蛋白wt(图9b)。与tmprss2组合的刺突蛋白(wt或r905a突变体)用endo-f和endo-h处理或模拟处理(nt)，并使用v5-mab通过蛋白质印迹分析(图9c)。一致地，内源性和弗林蛋白酶过表达产生的s2片段，当细胞表达pc抑制剂时更为明显。tmprss2表达细胞不产生s2片段，s的tmprss2裂解也不受这些抑制剂的影响。[0103]图10显示了s2和s2’的蛋白质组学分析。使用v5-琼脂糖从hela细胞裂解物中免疫沉淀v5标记的s-蛋白并进行sds-page电泳。切除对应于s2和s2’的条带并通过质谱分析。[0104]图11显示化合物不影响通过tmprss2生成s2a和s2b。在人tmprss2存在或不存在的情况下，用编码空载体、s蛋白的cdna瞬时转染的hela细胞，未经处理(nt)或用指定浓度的化合物处理。转染后48小时，收集细胞，并使用mab-v5通过蛋白质印迹分析其蛋白质提取物。[0105]图12显示tmprss2将pros切割成er保留的片段，将ace2脱落成可溶形式(sace2)，并将刺突蛋白s1亚基切割成较短的片段(s1’)，其与sace2形成复合物。卡莫司他抑制tmprss2对pros、s1和ace2的活性。如图所示，用空载体(v)或增加v5标记的wt刺突蛋白与tmprss2(刺突-v5:tmprss2)的cdna比值瞬时转染hela-ace2细胞，24小时后在含有120μm卡莫司他( )或对照dmso(-)的无血清培养基中再培养24小时(图12a)。首先使用针对s1亚基(gtx135356)的抗体探针对于s1和s1’的24小时条件培养基(浓缩10倍)的免疫印迹，剥离并接下来探针sace2(ab108252)和成熟tmprss2m(14437-1-ap)(上图)。针对刺突蛋白(v5-mab)、ace2(ab108252)和β-肌动蛋白(下图)对细胞裂解物进行免疫印迹。单独使用空载体(v)、tmprss2和v5标记的刺突蛋白(s)或与tmprss2(s tmprss2)以1:0.7的比例结合瞬时转染hela-ace2细胞48小时(图12b)。对于每种条件，1ml的24小时无血清条件培养基用2μg山羊多克隆ace2抗体(af933，r&d)和60μltrueblot抗山羊igip珠(00-8844-25；rockland)进行免疫沉淀，并首先通过蛋白质印迹分析s1和s1’(gtx135356)，然后分析sace2(兔mab；ab108252)(右上图)。作为参考，对免疫沉淀前50％的培养基(浓缩10倍)(输入)进行了类似分析(左上图)。还显示了细胞裂解物(刺突蛋白：v5-mab)的免疫印迹(下图)。[0106]图13显示tmprss2生成可溶性ace2(sace2)并增强细胞中s2’和培养基中s1’的产生。用编码空载体(v)或v5标记的刺突蛋白、野生型(wt)或其μs1/s2突变体的cdna转染48小时的hela细胞，与用编码空载体(v)、tmprss2或全长ace2的cdna与tmprss2以1:1的比例转染的hek293细胞的条件无血清培养基一起孵育最后24小时(图13a)。如图所示，通过免疫印迹分析hela细胞培养基(浓缩5倍)(上图)和细胞裂解物(下图)。适合表达wt刺突蛋白的hela细胞与包含sace2和活性成熟tmprss2m的kek293培养基一起孵育的条件被框住。二聚体＝有时观察到的pros二聚体；*ns＝非特定条带。如图所示，培养基(浓缩8倍)和用编码v5标记的刺突蛋白(wt或μs1/s2) tmprss2±ace2的cdna共转染48小时的hela细胞的细胞裂解物通过蛋白质印迹分析(图13b)。所用cdna的比例为s:tmprss2:ace2＝1:0.3:0.7。使用了以下抗体：s1和s1’，gtx135356；tmprss2m，14437-1-ap；ace2，ab108252；s2、s2’和s2a、v5-mab。[0107]图14显示了ace2和s-蛋白或μs1/s2在hela细胞中的共定位的免疫细胞化学。在非透化(np)条件下使用刺突s1抗体gtx632604或在透化(p)条件下使用抗v5显示s-蛋白(s)和μs1/s2(绿色)的免疫荧光(图14)。ace2标记为红色，细胞核用dapi(蓝色)染色。[0108]图15显示了hela细胞中s-蛋白(s)和μs1/s2(绿色)的免疫荧光，所述hela细胞转染前预孵育5小时，然后与1mm化合物192预孵育24小时。共焦定位如图15a所示。比例尺＝10μm。表达s蛋白和ace2的细胞形成了许多与s蛋白细胞表面表达减少和ace2减少甚至更多相关的合胞体(b)。表达μs1/s2和ace2的细胞在细胞内和细胞表面(c)显示s和ace2的积累，但合胞体的形成减少非常多。当细胞与化合物192预孵育时，表达s的hela细胞表型模拟表达μs1/s2的细胞。[0109]图16显示细胞间融合测定：合胞体形成与荧光素酶活性之间的相关性。tzm-bl中的ace2表达允许与表达s的细胞以剂量依赖性方式融合(b)ms1/s2在供体细胞中的表达不会增强与表达ace2的tzm-bl细胞的融合。使用共聚焦显微镜评估供体细胞(hela)和受体细胞(tzm-bl)之间的细胞间融合(图16a)。将转染空载体(ev)或表达hiv-env、sars-cov-2刺突或μs1/s2的hela细胞共培养放置18小时，并使用cellmasktm检查合胞体的数量以探针质膜和dapi染色细胞核。供体细胞用不表达蛋白质(ev)、表达tat、wt刺突(s)、tat和wt刺突(tat s)或tat和hiv-env(tat env)的载体转染(图16b)。受体细胞用不表达蛋白质(ev)的载体、用ace2或直接用tat作为同位对照进行转染。48小时后，将细胞共培养18小时。发光被归一化为任意设置为1的ev值。数据表示为平均值±sd(n＝3)，并显示了代表性实验。用增加量的表达wt刺突的质粒转染供体细胞，用表达ace2的载体转染受体细胞(图16c)。48小时后，将细胞共培养18小时，并准备用于发光或显微镜检查。通过显微镜计数的合胞体数量之间的相关性(每个条件n＝10)，并测定荧光素酶活性，并计算相关系数，如图所示。r2＝0.87。[0110]图17显示了靶细胞对tmprss2和可溶性ace2对细胞间融合的作用。用不表达蛋白质ev、表达wt刺突、μs1/s2或wt-spike以及可溶性ace2(hace2707x)的质粒载体转染供体hela细胞。受体helatzm-bl细胞用不表达蛋白质、表达具有所示增加量的tmprss2的ace2或可溶性ace2的质粒载体转染。融合表示为在每种条件下测量的相对发光单位(rlu)与在代表性供体和受体细胞之间的共培养中测量的rlu之间的比率。数据表示为平均值±sd(n＝3)。ace2与不同剂量tnprss2在受体细胞中的共表达逐渐促进ms1/s2表达细胞的融合达到与wts诱导的融合相似的水平。然而sace2对ms1/s2没有影响。因此，在ace2受体细胞中高水平的tmprss时，细胞之间的融合是可能的，无论是否在s1/s2位点切割。[0111]图18显示sars-cov-2病毒进入hek293细胞主要是通过ph依赖性途径介导的。ace2与不同剂量tmprss2在受体细胞中的共表达逐渐促进ms1/s2表达细胞的融合达到与wts诱导的融合相似的水平。然而sace2对ms1/s2没有影响。因此，在ace2受体细胞中高水平的tmprss时，细胞之间的融合是可能的，无论是否在s1/s2位点切割。293t-ace2用氯喹(clq；100μm)预处理2小时，然后接种表达荧光素酶的hiv颗粒，该颗粒用sars-cov-2野生型(wt)或突变(μs1/s2)刺突(s)假型化。在没有s(无s)的情况下制造的hiv颗粒用作阴性对照。病毒进入的效率由荧光素酶活性确定。每个点代表一个独立的实验(生物一式三份的中位荧光素酶)。误差条显示sd。[0112]图19显示新型弗林蛋白酶样抑制剂阻断病毒进入人上皮细胞，但不阻断稳定表达ace2的模型hek293细胞。在存在或不存在化合物219和化合物192的情况下在293t17中产生假病毒。293t-ace2细胞和calu-3细胞接种这些病毒，并根据荧光素酶活性确定病毒进入(图19a、19b)。每个点代表一个不同的实验(生物一式三份的中位荧光素酶)。误差条显示相对于平均值的sd。[0113]图20显示弗林蛋白酶样抑制剂可强烈减少calu-3细胞中的sars-cov-2感染。(图20a和20b)用指定浓度的(a)化合物219和(b)化合物192处理的受感染的calu-3细胞的上清液(感染后24小时)中释放的病毒滴度(pfu/毫升)通过噬斑测定法测定(一式三份的平均值±sd，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。如右上图所示，(a)化合物219和(b)化合物192在calu-3细胞中的选择性指数(si)由cc50/ic50测定。左侧y轴表示相对于未处理对照组(红色)的病毒滴度抑制(百分比)。右侧y轴表示相对于未处理对照组(绿色)的细胞活力(百分比)。用指定剂量的化合物处理的受感染calu-3细胞的代表性噬斑图像显示在右下图中。[0114]图21显示弗林蛋白酶样抑制剂以浓度依赖性方式适中减少sars-cov-2感染的veroe6细胞中的病毒产生。在感染后12、24和48小时通过噬斑测定研究复制动力学，以确定用1μm化合物93、219和192处理或未处理的感染veroe6细胞上清液中sars-cov-2病毒的噬斑形成单位(pfu)(图21a)。折线图表示一式三份噬斑测定的结果(平均值±sd)。用指定浓度的化合物93(图21b)、化合物219(图21c)和化合物192(图21d)处理的感染的veroe6细胞的上清液(感染后48小时)中释放的病毒通过噬斑测定法测定(一式三份的平均值±sd，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。具体实施方式[0115]本公开提供了治疗和/或预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的方法、药物组合物和试剂盒，包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物、其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。本文进一步提供了用于治疗和/或预防由sars-cov-2病毒变体(如b.1.351(即南非covid-19变体)，b.1.1.7(即英国covid-19变体)，p.1(即巴西covid-19变体))引起的病毒感染的方法、药物组合物和试剂盒。[0116]本文进一步提供了在有此需要的受试者中抑制冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)进入细胞的方法，包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0117]本文进一步提供了在有此需要的受试者中降低冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)的致病性的方法，包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0118]本文还提供了在有此需要的受试者中抑制冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)从细胞中离开的方法，包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0119]在某些实施方案中，本公开提供了治疗和/或预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的方法，包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由冠状病毒科病毒引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由α冠状病毒引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由hcov-nl63或hcov-229e引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由β冠状病毒引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-oc43或hcov-hku1引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由sars-cov引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由sars-cov-2引起的病毒感染。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗和/或预防由mers-cov引起的病毒感染。[0120]在另一个方面，本公开提供了在有此需要的受试者中治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量(例如，治疗有效量)的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。在某些实施方案中，本文提供了治疗由α冠状病毒引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由hcov-nl63或hcov-229e引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由β冠状病毒引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-oc43或hcov-hku1引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由sars-cov引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由sars-cov-2引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由mers-cov引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由hcov-oc43引起的病毒感染的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗由hcov-hku1引起的病毒感染的方法。[0121]在另一个方面，本公开提供了在有此需要的受试者中预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量(例如，预防有效量)的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。在某些实施方案中，本公开提供了在有此需要的受试者中预防由β冠状病毒(例如，sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-oc43、hcov-hku1)、δ冠状病毒、γ冠状病毒)引起的病毒感染的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量(例如，预防有效量)的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。在某些实施方案中，本公开提供了在有此需要的受试者中预防由sars-cov引起的病毒感染的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量(例如，预防有效量)的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0122]在另一个方面，本公开提供了在有此需要的受试者中抑制冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)进入细胞的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0123]在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒进入细胞至少1％、至少3％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，冠状病毒科病毒进入细胞在受试者中被抑制至少1％、至少3％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒进入细胞至少30％。在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒进入细胞至少50％。在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒进入细胞至少75％。[0124]在另一个方面，本公开提供了在有此需要的受试者中抑制冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)复制的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0125]在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒复制至少1％、至少3％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，冠状病毒科病毒复制在受试者中被抑制至少1％、至少3％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒复制至少30％。在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒复制至少50％。在某些实施方案中，本文提供的方法在受试者中抑制冠状病毒科病毒复制至少75％.[0126]在另一个方面，本公开提供了在受试者中降低冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)感染性的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的式(i)化合物或其药物可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0127]在另一个方面，本公开提供了在生物样品(例如，体外生物样品)中抑制病毒感染性的方法，该方法包括将生物样品与有效量的式(i)化合物或本文所述药物组合物接触。在另一个方面，本公开提供了在细胞(如体外细胞)中抑制病毒感染性的方法，该方法包括使细胞与有效量的式(i)化合物或本文所述药物组合物接触。[0128]在某些实施方案中，本文所述的方法、用途、药物组合物、试剂盒和化合物进一步包括施用一种或多种另外的药剂(例如，治疗和/或预防活性剂)。本公开的化合物或组合物可与另外的药剂联合施用，这些药剂可改善其活性(例如，在治疗有此需要的受试者的疾病、预防有此需要的受试者的疾病、降低有此需要的受试者的疾病的风险和/或抑制在受试者或细胞中的转录因子的活性方面的活性(例如，效力和/或疗效))、改善生物利用度、提高安全性、减少耐药性、减少和/或改变代谢、抑制排泄，和/或改变在受试者或细胞中的分布。还应当理解，应用的治疗可以对相同病症取得所需效果，和/或可以取得不同的效果。在一些实施方案中，包含本公开化合物和其他药物的本公开药物组合物显示出协同作用，这是包含所述化合物或另外的药剂之一而非二者的药物组合物所不具备的。例如，包含式(i)化合物和卡莫司他的方法、用途、药物组合物、试剂盒和化合物在治疗病毒感染方面可相对于包含化合物(i)或卡莫司特的组合物显示出协同作用。包含式(i)化合物和卡莫司他的方法、用途、药物组合物、试剂盒和化合物在治疗病毒感染方面也可相对于包含化合物(i)或卡莫司他的组合物显示出相加作用。[0129]可将化合物或组合物与一种或多种另外的药剂同时给药、在所述一种或多种另外的药剂之前或之后给药，其可用作，例如，组合疗法。药剂包括治疗活性剂。药剂还包括预防活性剂。药剂包括小的有机分子，例如药物化合物(例如，由美国食品与药物管理局批准，提供在美国联邦法规汇编(cfr)中的人或兽用化合物)、肽类、蛋白、碳水化合物、单糖、寡糖、多糖、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白、连接蛋白的小分子、糖蛋白、甾类、核酸、dna、rna、核苷酸、核苷、寡核苷酸、反义寡核苷酸、脂质、激素、维生素和细胞。在某些实施方案中，该另外的药剂是用于治疗和/或预防病毒感染(例如，由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的药剂。各另外的药剂可以该药剂规定的剂量和/或时间表进行给药。所述另外的药剂也可彼此一起和/或与本技术所述的化合物或组合物一起，以单一剂量进行给药或以不同剂量分别进行给药。在该方案中所采用的具体组合将考虑本技术所述的化合物与另外的药剂的相容性和/或将实现的所需的治疗和/或预防效果。通常，预期所述另外的药剂在组合使用时所采用的水平是以不超过它们单独使用时的水平。在一些实施方案中，组合使用的水平将低于它们单独使用时的水平。[0130]另外的药剂包括但不限于抗炎剂、免疫抑制剂、抗菌剂、抗病毒剂、心血管剂、抗过敏剂和镇痛剂。在某些实施方案中，另外的药剂是抗病毒剂(例如，阿巴卡韦、阿昔洛韦、金刚烷胺、阿扎那韦、氯喹、达芦那韦、埃替拉韦(elvitegravir)、福沙那韦、更昔洛韦、茚地那韦、雷迪帕韦、洛匹那韦、硝唑尼特、奥司他韦、喷昔洛韦、帕拉米韦、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、索非布韦、替拉那韦、维帕他韦、扎那米韦、法匹拉韦、瑞德西韦、oya1、加利西韦、阿比朵尔(umifenovir)、羟氯喹)。在某些实施方案中，抗病毒剂是氯喹。在某些实施方案中，抗病毒剂是羟氯喹。在某些实施方案中，另外的药剂是抗菌剂(例如，阿奇霉素)。在某些实施方案中，另外的药剂是抗炎剂(例如，瑾司鲁单抗、il-6抗体、雅美罗(actemra)、扑热息痛、非甾体抗炎药(nsaid))。在某些实施方案中，抗炎剂可以是肿瘤坏死因子(tnf)抑制剂(例如，阿达木单抗、依那西普、英夫利昔单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗)。[0131]在某些实施方案中，另外的药剂是抗纤维化剂(例如，吡非尼酮、尼达尼布)。在某些实施方案中，另外的药剂是吡非尼酮。在某些实施方案中，另外的药剂是尼达尼布。[0132]在某些实施方案中，另外的药剂是另外疗法的形式(例如，接受来自幸存者患者血液的抗体、dna疫苗、rna疫苗)。在某些实施方案中，另外疗法是用抗体治疗。在某些实施方案中，另外疗法是用人抗体治疗。在某些实施方案中，另外疗法是用来自幸存者患者血液的人抗体进行治疗。在某些实施方案中，另外疗法是用单克隆抗体治疗。在某些实施方案中，另外疗法是用结合s-刺突蛋白的抗体治疗。在某些实施方案中，另外疗法是用结合s-刺突蛋白的单克隆抗体治疗。[0133]在某些实施方案中，另外的药剂是n-甲基-d-天冬氨酸(ndma)受体谷氨酸受体拮抗剂(例如，艾芬地尔)。在某些实施方案中，另外的药剂是ace2阻断剂(例如，apno1)。在某些实施方案中，另外的药剂是ccr5拮抗剂。在某些实施方案中，另外的药剂是结合s-刺突蛋白的抗体(例如，regn3048-3051)。在某些实施方案中，另外的药剂是艾地苯醌。在某些实施方案中，另外的药剂是干扰素β。在某些实施方案中，另外的药剂是adam-17抑制剂。在某些实施方案中，另外的药剂是4-甲基伞形酮(4-甲基umbelliferone)。[0134]另外的药剂还可以包括丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，tmprss2抑制剂(例如，卡莫司他、萘莫司他))、ace2抑制剂(例如，苯那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利或群多普利)。在某些实施方案中，另外的药剂是tmprss2抑制剂(例如，卡莫司他、萘莫司他)。在某些实施方案中，另外的药剂是卡莫司他。在某些实施方案中，另外的药剂是萘莫司他。在某些实施方案中，另外的药剂是苯那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利或群多普利。在某些实施方案中，另外的药剂是苯那普利。在某些实施方案中，另外的药剂是卡托普利。在某些实施方案中，另外的药剂是依那普利。在某些实施方案中，另外的药剂是福辛普利。在某些实施方案中，另外的药剂是赖诺普利。在某些实施方案中，另外的药剂是莫昔普利。在某些实施方案中，另外的药剂是培哚普利。在某些实施方案中，另外的药剂是喹那普利。在某些实施方案中，另外的药剂是雷米普利。在某些实施方案中，另外的药剂是群多普利。[0135]在另一个方面，本公开提供了本文所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，以及药物组合物，其用于在有此需要的受试者中治疗和/或预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染，包括向受试者施用治疗有效量的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，或包含本文所述的式(i)化合物的药物组合物。[0136]在另一个方面，本公开提供了如本文所述的式(i)化合物或其药学上可接受的盐和药物组合物在制备用于在有此需要的受试者中治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的药物中的用途。[0137]在另一个方面，本公开提供了本文所述的式(i)化合物和药物组合物在制备用于在有此需要的受试者中预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的药物中的用途。[0138]在某些实施方案中，病毒是冠状病毒科病毒。在某些实施方案中，冠状病毒科病毒是α冠状病毒。在某些实施方案中，α冠状病毒是hcov-nl63。在某些实施方案中，α冠状病毒是hcov-229e。在某些实施方案中，冠状病毒科病毒是β冠状病毒。在某些实施方案中，β冠状病毒是sars-cov。在某些实施方案中，β冠状病毒是sars-cov-2。在某些实施方案中，β冠状病毒是mers-cov。在某些实施方案中，β冠状病毒是hcov-oc43。在某些实施方案中，β冠状病毒是hcov-hku1。在某些实施方案中，冠状病毒科病毒是δ冠状病毒。在某些实施方案中，冠状病毒科病毒是γ冠状病毒。[0139]在某些实施方案中，病毒是sars-cov-2病毒的变体(例如，b.1.351、b.1.1.7、p.1)。在某些实施方案中，sars-cov-2变体是b.1.351变体(即，南非covid-19变体)。在某些实施方案中，sars-cov-2变体是b.1.1.7变体(即英国covid-19变体)。在某些实施方案中，sars-cov-2变体是p.1变体(即巴西covid-19变体)。[0140]不希望受任何特定理论的束缚，在某些实施方案中，用于本公开的方法、组合物和用途的式(i)化合物预防或抑制弗林蛋白酶介导的加工刺突(s)-蛋白，其可在病毒离开过程中被切割。[0141]不希望受任何特定理论的束缚，在某些实施方案中，用于本公开的方法、组合物和用途的式(i)化合物预防或抑制弗林蛋白酶介导的加工刺突(s)-蛋白其可在病毒进入细胞的过程中被切割。[0142]不希望受任何特定理论的束缚，在某些实施方案中，用于本公开的式(i)化合物通过切割病毒的糖蛋白来抑制病毒融合。[0143]不希望受任何特定理论的束缚，在某些实施方案中，用于本公开的式(i)化合物通过抑制弗林蛋白酶介导的刺突(s)-蛋白的加工来抑制病毒融合(在病毒进入或离开细胞期间)。可能需要切割(s)-蛋白以暴露融合蛋白，这允许病毒进入和离开细胞。[0144]在某些实施方案中，用于本公开的式(i)的化合物具有下式:[0145][0146]或其药学上可接受的盐，其中:[0147]x为–o–或–n(r8)–；[0148]y为–n＝或–c(r6)＝；[0149]r1和r2各自独立地为h或任选取代的(c1-c4)烷基；[0150]任选地，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–so2r7；[0151]各个r3独立地为卤素、–cn、–o(c1-c4)烷基、或任选取代的(c1-c4)烷基；[0152]r4和r5各自独立地为h或任选取代的(c1-c4)烷基；[0153]任选地，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–so2(c1c4)烷基、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)so2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–p(o)r8r9；[0154]各个r6独立地为h、卤素、任选取代的(c1-c4)烷基、–oh、或任选取代的(c1-c4)烷氧基；[0155]各个r7独立地为(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、卤代(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基、或(c1-c4)烷基(c3-c6)环烷基，其各自任选取代有一个或两个三唑基、四唑基、–co2r8、–conr8r9、–con(r8)co2(c1-c4)烷基、羟基、氧代、–(c1-c4)烷氧基、–oconr8r9、–ocon(r8)c(o)r9、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷基oh、–nr8r9、–n(o)r8r9、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)ch2co2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)c(o)r9、–n(r8)con(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)so2r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–so(c1-c4)烷基、–so2(c1-c4)烷基、–so3r8、–so2nr8r9、–b(oh)2、–p(o)r8r9或–p(o)(or8)(or9)；[0156]r8和r9各自独立地为h、任选取代的(c1-c4)烷基、或任选取代的(c3-c6)环烷基；[0157]n为1、2、3或4。[0158]在某些实施方案中，x为–o–或–nr8，其中r8为(c1-c4)烷基。在另一个实施方案中，x为–nr8，其中r8为(c1-c4)烷基。在某些实施方案中，x为–o–。[0159]在某些实施方案中，y为–n＝或–c(r6)＝，其中r6独立地为h、卤素、任选取代的(c1-c4)烷基、–oh或任选取代的(c1-c4)烷氧基。在某些实施方案中，y为–n＝。在某些实施方案中，y为–c(r6)＝。[0160]在某些实施方案中，r3为任选取代的–o(c1-c4)烷基。在某些实施方案中，r3为任选取代的–ocf3。在某些实施方案中，r3为任选取代的(c1-c4)烷基。在某些实施方案中，r3为–me。在某些实施方案中，r3为–cf3。在某些实施方案中，r3为–chf2。在某些实施方案中，r3为–ch2f。在某些实施方案中，r3为卤素。在某些实施方案中，r3为–f。在某些实施方案中，r3为–cl。在某些实施方案中，r3为–br。在某些实施方案中，r3为–i。在某些实施方案中，r3为–me。在某些实施方案中，各个r3独立地为卤素、甲基或二氟甲基。在另一实施方案中，各个r3独立地为氟、氯、溴、甲基或二氟甲基。在一个实施方案中，各个r3独立地为卤素。在另一实施方案中，各个r3独立地为氟、氯或溴。在另一实施方案中，各个r3独立地为氟或氯。在某些实施方案中，各个r3为氯。在某些实施方案中，r3为–cn。[0161]在某些实施方案中，r1和r2各自独立地为h、(c1-c4)烷基、或(c1-c4)烷基nh2。在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–so2r7。在一个实施方案中，r1和r2各自独立地为h、(c1-c4)烷基或–(c1-c4)烷基nh2。在另一实施方案中，r1和r2各自独立地为h或–(c1-c4)烷基nh2。r1和r2与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–so2r7。在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成任选取代的吡咯烷、吡唑烷、咪唑烷、哌啶、哌嗪或吗啉环。[0162]在另一实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起表示6-或7-元单环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个独立选自以下的取代基：卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–so2r7。在另一实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起表示6-或7-元单环，其任选包含一个或两个另外的氮杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个独立选自以下的取代基：卤素、羟基、氧代、r7、–or7、–nhr8、–nr7r8和–c(o)r7。在另一实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起表示6-或7-元单环，其任选包含一个另外的氮杂原子，其中所述环任选取代有一个取代基r7。在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起表示任选取代的哌嗪环。[0163]在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成任选取代的哌嗪环。在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的哌啶环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的哌啶环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在某些实施方案中，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成下式的吡咯烷环:[0164]在某些实施方案中，r4和r5各自独立地为h，或任选取代的(c1-c4)烷基。在某实施方案中，r4和r5相同。在某些实施方案中，r4和r5不同。在某些实施方案中，r4为h。在某些实施方案中，r5ish。在一个实施方案中，r4和r5各自独立地为h、(c1-c4)烷基、或(c2-c4)烷基(c1-c4)烷氧基。在某些实施方案中，r4为–me。在某些实施方案中，r4为–c(o)r7。在某些实施方案中，r4为–c(o)me。在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–so2(c1c4)烷基、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)so2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–p(o)r8r9。在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的哌啶环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的哌啶环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的哌啶环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成具有下式的哌嗪环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的吡咯烷环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的吡咯烷环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的吡咯烷环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的环:在另一实施方案中，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成下式的环:[0165]在一个实施方案中，各个r6独立地为卤素或(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，各个r6独立地为卤素。在另一实施方案中，各个r6独立地选自氟、氯、溴和甲基。在另一实施方案中，各个r6独立地选自氟、氯和溴。在另一实施方案中，各个r6独立地为氟或氯。在某些实施方案中，各个r6为氟。在另一实施方案中，各个r6为氯。在另一实施方案中，各个r6独立地为(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，各个r6为甲基。[0166]在一个实施方案中，各个r7独立地为(c1-c6)烷基、卤代(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基或–(c1-c4)烷基(c3-c6)环烷基，其各自任选取代有一个或两个三唑基、四唑基、–co2r8、–conr8r9、–con(r8)co2(c1-c4)烷基、–oh、(c1-c4)烷氧基、–oconr8r9、–ocon(r8)c(o)r9、(c1-c4)烷基、–(c1-c4)烷基oh、–nr8r9、–n(o)r8r9、–n(r8)c(o)r9，-n(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)c(o)r9、–n(r8)con(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)so2r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–so(c1-c4)烷基、–so2(c1-c4)烷基、–so3r8、–so2nr8r9、–b(oh)2、–p(o)r8r9或–p(o)(or8)(or9)。在另一实施方案中，各个r7独立地为(c1-c4)烷基、(c2-c4)烯基、卤代(c1-c4)烷基、(c3-c6)环烷基或–(c1-c2)烷基(c3-c6)环烷基，其各自任选取代有–co2r8、–conr8r9、–oh、氧代、–(c1-c4)烷氧基、–oconr8r9、–(c1-c4)烷基oh、–nr8r9、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)ch2co2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)so2r9、–so(c1-c4)烷基、–so2(c1-c4)烷基、–so3r8、–so2nr8r9或–p(o)(or8)(or9)。在另一实施方案中，各个r7独立地为(c1-c4)烷基、(c2-c4)烯基、卤代(c1-c4)烷基、(c3-c6)环烷基或–(c1-c2)烷基(c3-c6)环烷基，其各自任选取代有1或2个取代基–co2r8、–conr8r9、–oh、(c1-c4)烷氧基、–oconr8r9、–(c1-c4)烷基oh、–nr8r9、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)conr8r9、–n(r8)so2r9、–so(c1-c4)烷基、–so2(c1-c4)烷基、–so3r8、–so2nr8r9或–p(o)(or8)(or9)。在另一实施方案中，各个r7为(c1-c6)烷基，其任选取代有一个以下取代基：–co2h、–oh、–n(r8)c(o)r9或–so(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，各个r7为(c1-c4)烷基，其任选取代有一个以下取代基：–co2h、–oh、–n(r8)c(o)r9或–so(c1-c4)烷基。[0167]在某些实施方案中，r8和r9各自独立地为h、任选取代的(c1-c4)烷基、或任选取代的(c3-c6)环烷基。在一个实施方案中，各个r8和r9独立地为h或(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，各个r8和r9独立地为(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，r8和r9各自为甲基。在另一实施方案中，各个r8和r9为h。在另一实施方案中，r8为h；且r9为(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，r8为h；且r9为–me。在另一实施方案中，r8为(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，r8为–me。在另一实施方案中，r8为–h。在另一实施方案中，r9为(c1-c4)烷基。在另一实施方案中，r9为–me。在另一实施方案中，r9为–h。[0168]在一个实施方案中，n为1、2或3。在另一实施方案中，n为2或3。在另一实施方案中，n为2。[0169]在某些实施方案中，用于本公开的式(i)的化合物具有式(ii):[0170][0171]或其药学上可接受的盐，其中:[0172]x为–o–或–n(r8)–；[0173]r1和r2各自独立地为h或任选取代的(c1-c4)烷基；[0174]任选地，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–so2r7；[0175]各个r3独立地为卤素、–cn、–o(c1-c4)烷基、或任选取代的(c1-c4)烷基；[0176]r4和r5各自独立地为h或任选取代的(c1-c4)烷基；[0177]任选地，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–so2(c1c4)烷基、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)so2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–p(o)r8r9；[0178]各个r6独立地为h、卤素、任选取代的(c1-c4)烷基、–oh、或任选取代的(c1-c4)烷氧基；[0179]各个r7独立地为(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、卤代(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基、或(c1-c4)烷基(c3-c6)环烷基，其各自任选取代有一个或两个三唑基、四唑基、–co2r8、–conr8r9、–con(r8)co2(c1-c4)烷基、羟基、氧代、–(c1-c4)烷氧基、–oconr8r9、–ocon(r8)c(o)r9、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷基oh、–nr8r9、–n(o)r8r9、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)ch2co2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)c(o)r9、–n(r8)con(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)so2r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–so(c1-c4)烷基、–so2(c1-c4)烷基、–so3r8、–so2nr8r9、–b(oh)2、–p(o)r8r9或–p(o)(or8)(or9)；[0180]r8和r9各自独立地为h、任选取代的(c1-c4)烷基、或任选取代的(c3-c6)环烷基；[0181]n为1、2、3或4。[0182]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式:[0183][0184]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式:[0185][0186]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式:[0187][0188]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式:[0189][0190]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式:[0191][0192]在某些实施方案中，用于本公开的式(ii)的化合物具有下式(表1,#192):[0193][0194]或其药学上可接受的盐。[0195]在某些实施方案中，式(i)或式(ii)的化合物可以是下表1中的任何一种化合物。在某些实施方案中，所公开的组合物、方法和用途包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的下表1中发现的任何一种化合物。[0196]表1.用于本公开的化合物[0197][0198][0199][0200][0201][0202][0203][0204][0205][0206][0207][0208][0209][0210][0211][0212][0213][0214][0215][0216][0217][0218][0219][0220][0221][0222][0223][0224][0225][0226]在某些实施方案中，用于本公开的式(i)的化合物具有式(iii):[0227][0228]或其药学上可接受的盐，其中:[0229]x为–o–或–n(r8)–；[0230]r1和r2各自独立地为h或任选取代的(c1-c4)烷基；[0231]任选地，r1和r2与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–so2r7；[0232]各个r3独立地为卤素、–cn、–o(c1-c4)烷基、或任选取代的(c1-c4)烷基；[0233]r4和r5各自独立地为h或任选取代的(c1-c4)烷基；[0234]任选地，r4和r5与它们连接的氮原子一起形成4-11元单环、稠合双环、桥接、或螺-双环饱和环，其任选包含一个或两个另外的独立选自氧、氮和硫的杂原子，其中所述环任选取代有1、2或3个卤素、羟基、氧代、–oconr8r9、–co2r8、–c(o)co2r8、–so2(c1c4)烷基、–r7、–or7、–nhr8、–nr7r8、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)so2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–c(o)r7、–conhr8、–conr7r8或–p(o)r8r9；[0235]各个r6独立地为h、卤素、任选取代的(c1-c4)烷基、–oh、或任选取代的(c1-c4)烷氧基；[0236]各个r7独立地为(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、卤代(c1-c6)烷基、(c3-c6)环烷基、或(c1-c4)烷基(c3-c6)环烷基，其各自任选取代有一个或两个三唑基、四唑基、–co2r8、–conr8r9、–con(r8)co2(c1-c4)烷基、羟基、氧代、–(c1-c4)烷氧基、–oconr8r9、–ocon(r8)c(o)r9、(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷基oh、–nr8r9、–n(o)r8r9、–n(r8)c(o)r9、–n(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)ch2co2r9、–n(r8)conr8r9、–n(r8)con(r8)c(o)r9、–n(r8)con(r8)co2(c1-c4)烷基、–n(r8)so2r9、–n(r8)con(r8)so2r9、–so(c1-c4)烷基、–so2(c1-c4)烷基、–so3r8、–so2nr8r9、–b(oh)2、–p(o)r8r9或–p(o)(or8)(or9)；[0237]r8和r9各自独立地为h、任选取代的(c1-c4)烷基、或任选取代的(c3-c6)环烷基；且[0238]n为1、2、3或4。[0239]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)的化合物，或其药学上可接受的盐具有下式:[0240][0241]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)的化合物，或其药学上可接受的盐具有下式:[0242][0243]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)的化合物，或其药学上可接受的盐具有下式:[0244][0245]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)的化合物，或其药学上可接受的盐具有下式:[0246][0247]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)的化合物，或其药学上可接受的盐具有下式:[0248][0249]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)化合物为下式：[0250][0251]在某些实施方案中，用于本公开的式(iii)化合物为下式(表2,#219):[0252][0253]或其药学上可接受的盐。[0254]在某些实施方案中，式(i)或式(iii)的化合物可以是下表2中的任何一种化合物。在某些实施方案中，所公开的组合物、方法和用途包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的下表2中发现的任何一种化合物。[0255]表2.用于本公开的化合物[0256][0257][0258][0259][0260][0261][0262][0263][0264][0265][0266][0267][0268][0269][0270][0271][0272][0273][0274]表1和表2中化合物的合成和表征可参见国际pct申请号：pct/ep2019/062098，2019年5月10日提交，2019年11月14日公布，公布号：wo2019/215341，该申请通过引用并入本文。[0275]通常，但不是绝对地，本公开的盐是药学上可接受的盐。包含碱性胺或其他碱性官能团的公开化合物的盐可以通过本领域已知的任何合适方法制备，包括用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸比如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸比如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖基酸(pyranosidylacid)(比如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α-羟酸(比如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(比如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(比如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(比如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸)等。药学上可接受盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐(苯基butrate)、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、扁桃酸盐和磺酸盐，比如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。[0276]所公开的含有羧酸或其他酸性官能团的化合物的盐可以通过与合适的碱反应来制备。该药学上可接受的盐可以用提供药学上可接受的阳离子的碱来制备，其包括碱金属盐(特别是钠和钾)、碱土金属盐(特别是钙和镁)、铝盐和铵盐、以及由生理学可接受的有机碱制成的盐，所述有机碱比如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己胺、n,n'-二苄基乙二胺、2-羟基乙胺、双-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、脱氢枞胺、n,n'-双脱氢枞胺、葡萄糖胺、n-甲基葡萄糖胺、可力丁(collidine)、奎宁、喹啉和碱性氨基酸(比如赖氨酸和精氨酸)。[0277]不是药学上可接受的其他盐可用于制备本公开化合物，并且这些应视为形成本公开的一个进一步的方面。这些盐，比如草酸盐或三氟乙酸盐，虽然其本身不是药学上可接受的，但可用于制备用作获得本公开化合物及其药学上可接受盐的中间体的盐。[0278]本公开进一步提供了可用于本公开的药物组合物(也称为药剂)，其包含式(i)化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种赋形剂(在制药领域中也称为载体和/或稀释剂)。赋形剂在与制剂的其他成分相容且对其接受者(即患者)无害的意义上是可接受的。[0279]合适的药学上可接受的赋形剂将根据所选的具体剂型而变化。此外，可针对可使它们在组合物中起作用的特殊功能选择合适的药物可接受的赋形剂。例如，可针对它们促进产生均匀剂型的能力选择某些药物可接受的赋形剂。可针对它们促进产生稳定剂型的能力选择某些药物可接受的赋形剂。可针对它们一旦给予患者可促进携带或运送本公开的化合物从身体的一个器官或部分至身体的另一器官或部分的能力选择某些药物可接受的赋形剂。可针对它们提高患者依从性的能力选择某些药物可接受的赋形剂。[0280]合适的药学上可接受赋形剂包括下述类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、造粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、增甜剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。本领域技术人员应当理解一些可药用赋形剂可以提供一种以上的功能，且其可提供其他的功能，这取决于该赋形剂存在于制剂中的多少以及还有什么其他成分存在于该制剂中。[0281]药物组合物可以适于通过任何合适的途径给药，例如，经口服(包括颊内或舌下)、直肠、鼻、局部(包括颊内、舌下或透皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径给药。这样的组合物可通过本领域已知的任何方法制备，例如，通过使活性成分与一种或多种赋形剂结合。实现有效量所需的化合物的确切量将因受试者而异，这取决于例如受试者的物种、年龄和一般状况、副作用或病症的严重程度、特定化合物的身份、给药方式等。有效量可以包括在单次剂量(例如，单次口服剂量)或多次剂量(例如，多次口服剂量)中。在某些实施方案中，多剂的第一剂和最后一剂之间的持续时间是三个月、六个月或一年。在某些实施方案中，多剂的第一剂和最后一剂之间之间的持续时间是受试者的寿命。在某些实施方案中，本文所述的剂量(例如，单剂量或多剂量的任何剂量)独立地包括0.1μg至1μg，0.001mg至0.01mg，0.01mg至0.1mg，0.1mg至1mg，1mg至3mg，3mg至10mg，10mg至30mg，30mg至100mg，100mg至300mg，300mg至1,000mg，或1g至10g(包括端点)，本文所述的化合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括1mg至3mg(包括端点)的本文所述化合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括3mg至10mg(包括端点)的本文所述化合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括10mg至30mg(包括端点)的本文所述化合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括30mg至100mg(包括端点)的本文所述化合物。[0282]如本文所述的剂量范围为向成人施用所提供的药物组合物提供指导。给予例如儿童或青少年的量可以由医学从业者或本领域技术人员确定，并且可以低于或与给予成人的量相同。[0283]本公开的化合物的治疗有效量将取决于许多因素，包括例如预期接受者的年龄和体重、需要治疗的确切病症及其严重程度、制剂的性质、和给药途径，最终将由开药的护理人员自行决定。然而，用于治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染的式(i)化合物的有效量通常在每天0.001至100mg/kg接受者的体重的范围内，合适的范围是0.01到10mg/kg体重每天。在某些实施方案中，用于治疗由sars-cov-2引起的病毒感染的式(i)化合物的有效量为每天0.001至100mg/kg接受者体重的范围内。例如，对于70kg的成年哺乳动物，每天的实际量合适的是7到700mg，这个量可以以每天单次剂量或每天多次(例如两次、三次、四次、五次或六次)亚剂量给予，以使每日总剂量相同。吸入的每日剂量范围为10μg-10mg/天，优选10μg-2mg/天，更优选50μg-500μg/天。盐或溶剂化物等的有效量可以确定为式(i)的化合物本身有效量的比例。设想类似的剂量将适用于治疗上述其他病症。[0284]本公开还包括试剂盒(例如，药物包)。在某些实施方案中，试剂盒包含本文所述的化合物或药物组合物，以及使用该化合物或药物组合物的说明。在某些实施方案中，试剂盒包含第一容器，其中第一容器包含化合物或药物组合物。在一些实施方案中，该试剂盒还包括第二容器。在某些实施方案中，第二容器包括赋形剂(例如，用于稀释或悬浮化合物或药物组合物的赋形剂)。在某些实施方案中，第一或第二容器中的每一个独立地是小瓶、安瓿、瓶子、注射器、分配器包装、管或吸入器。[0285]在某些实施方案中，本文所述的试剂盒包括第一容器，该第一容器包含式(i)的化合物或如本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，本文所述的试剂盒可用于治疗和/或预防由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染。[0286]在某些实施方案中，所述试剂盒包含式(i)化合物或其药物组合物；以及使用该化合物或药物组合物的说明。[0287]在某些实施方案中，本文所述的试剂盒还包括使用包含在试剂盒中的化合物或药物组合物的说明。本文所述的试剂盒还可包括监管机构如美国食品和药物管理局(fda)要求的信息。在某些实施方案中，试剂盒中包含的信息是处方信息。在某些实施方案中，试剂盒和说明书提供用于治疗由冠状病毒科病毒(例如，α冠状病毒(例如，hcov-nl63，hcov-229e)，β冠状病毒(例如sars-cov，sars-cov-2，mers-cov，hcov-oc43，hcov-hku1)，δ冠状病毒，γ冠状病毒)引起的病毒感染。[0288]在某些实施方案中，说明书用于将化合物或药物组合物施用于受试者(例如，需要治疗或预防本文所述疾病的受试者)。在某些实施方案中，说明书包括监管机构要求的信息，例如美国食品和药物管理局(fda)或欧洲医药产品评估机构(ema)要求的信息。在某些实施方案中，说明书包括处方信息。[0289]实施例[0290]为了更充分地理解本文所述的公开内容，提出以下实施例。本技术中描述的实施例用于说明本文提供的化合物、药物组合物、方法和用途，而并不意味着以任何方式进行限制。[0291]实施例1.不同细胞系中弗林蛋白酶样酶的体外抑制[0292]为了测试化合物对内源性弗林蛋白酶样酶将前-(s)蛋白加工成活性(s)蛋白的影响，三种细胞系(veroe6(非洲绿猴肾)、bhk21(中国仓鼠肾)和a549(人肺上皮细胞))被转染以瞬时表达prossars-cov-2蛋白。将每种细胞系与化合物192、化合物219或细胞/可渗透的泛-pcsk抑制剂癸酰基-rvkr-氯甲基酮(rvkr)一起孵育5小时。洗涤细胞并用1微克编码密码子优化(s)-蛋白(获自中国生物制药)的cdna转染(lipofectaminetm)，该(s)-蛋白插入pires表达载体中，并具有在s-蛋白的c端标记的v5。然后将所有三种细胞系与0.3μm、1μm或10μm的化合物192或化合物219或50μm的癸酰基-rvkr-cmk(rvkr)一起孵育24小时(图2)。接下来，获得细胞裂解物。使用v5mab进行通过sds-page(8％)的分离和蛋白质印迹分析。在bhk21细胞和veroe6细胞(稍微)中观察到抑制作用。然而，在a549细胞中的抑制作用较小。一种解释可能是a549细胞不通过内源性弗林蛋白酶样酶加工前-(s)蛋白。[0293]实施例2.通过弗林蛋白酶样转化酶和tmprss2加工pros。[0294]首先在体外评估了sars-cov-2的s-糖蛋白对弗林蛋白酶切割的敏感性。包含s1/s2和s2’位点的淬灭荧光肽的孵育(表3)表明在ph7.5和更低的ph6时，sars-cov-2的s1/s2切割有效地通过弗林蛋白酶水解，而sars-cov-1s1/s2和mers-cov的切割很差(图3b)。[0295]表3.模拟covid刺突切割位点的不同肽的序列已在酶测定中测试(箭头表示预期的切割位点)。[0296]s1/s2位点s2’位点sars-cov1yhtvsllr↓stsqmerscovtltprsvr↓svpggsrsar↓saiesars-cov2tnsprrar↓svasskpskr↓sfiesars-cov2突变体1tnsprraasvassars-cov2突变体2tnsparaasvassars-cov2突变体3tnspararsvas[0297]弗林蛋白酶在s2’处对sars-cov-2和mers-cov的切割效率较低，需要50倍以上的酶浓度才能检测到切割(图3b插图)。接下来通过证明s1/s2切割位点的碱性残基的取代显著损伤s1/s2切割，证实了sars-cov-2在弗林蛋白酶样基序切割的高特异性(图3c)。总而言之，这些数据表明弗林蛋白酶在s1/s2处切割效果最好，而在s2’处切割效率较低。基于卡莫司他抑制，还提出tmprss2参与sars-cov-2进入某些细胞。因此，然后确定了tmprss2是否可以在体外在s1/s2或s2’处切割。然而，在s1/s2切割模拟sars-cov-1的肽的tmprss2无法在s1/s2或s2’加工sars-cov-2(图3d)。[0298]为了进一步破译弗林蛋白酶样酶的细胞作用，hela细胞被含有编码v5标记的pros(图3a)的密码子优化的cdna的质粒共转染，且该cdna编码弗林蛋白酶、pc5a、pace4和pc7。在sds-page分离后通过蛋白质印迹(wb)分析细胞裂解物，并用v5-mab进行探针。发现在hela细胞中表达的内源性蛋白酶将pros(可能在s1/s2)加工成～100kdas2样产物(图3e)。此外，只有弗林蛋白酶和pc5a的过表达增强了不太丰富的～75kdas2’样片段的产生(图3e)。剩余的～200kdaprosim对应于尚未离开er的未成熟前体形式，其对内切糖苷酶-f和内切糖苷酶-h的敏感性(图9a)，以及对仅在反式高尔基网络(tgn)和/或细胞表面/内体中具有活性的弗林蛋白酶样转化酶不敏感证明了这一点。[0299]s1/s2位点的双ala突变体[r685a r682a](表示为μs1/s2)消除了对弗林蛋白酶样酶识别至关重要的p1和p4arg，并完全废除了通过内源性酶或过表达的弗林蛋白酶的s1/s2处pros和假定的s2’的加工(图3f)。这些数据支持弗林蛋白酶在s1/s2切割中的作用，并表明后者可能是后续s2’加工的先决条件。s1/s2处弗林蛋白酶样切割的丧失导致更高分子大小的prosm(～230kda)的积累，这可能代表了这种前体的成熟形式，其离开了er并成为内切糖苷酶-h抗性但仍保持内切糖苷酶-f敏感(图9a)。细胞可渗透的pc抑制剂癸酰基-rvkr-cmk(rvkr)有效地阻止了s2的内源性形成，但不能阻止细胞不可渗透的d6r抑制剂，这表明弗林蛋白酶将pros裂解为s1和s2发生在细胞内而不是在细胞表面(图9b)。[0300]为了更好地定义对s1/s2处加工至关重要的arg残基，在没有或存在弗林蛋白酶的情况下，hela细胞用携带以下单残基突变的pros表达：r682a、r685a和s686a(图4a)。后者基rvkr-cmk相当。相反，在hela细胞中，没有一种化合物影响通过tmprss2的s2a和s2b的生成(图11)，这与弗林蛋白酶和tmprss2的不同切割特异性一致。[0309]实施例4.tmprss2脱落ace2并切割s1。[0310]数据不支持tmprss2在s2或s2’的生成中的直接牵连，因为发现tmprss2的过表达会切割pros以产生er保留的s2a和更少的s2b(图3f，图9b，9c)并且不在s2’处切割pros。为了确认s2a和s2b是由er中的tmprss2活性产生的，hela-ace2细胞与已知抑制tmprss2的120μm卡莫司他一起孵育。数据表明，这种抑制剂可以到达er，因为它阻止了tmprss2在处的自催化活化(在培养基中损失～25kda形式)，随着tmprss2浓度的增加阻止s2a和s2b的形成，并逐渐允许在s1/s2处恢复弗林蛋白酶样切割(图12a)。[0311]因此，探索了tmprss2可能发挥的其他功能，以解释其报告的病毒进入增强。因此，增涨量的trmpss2在hela-ace2细胞中表达，并按照通过使用抗s1和抗trmpss2抗体的wb分析进行s1和trmpss2加工。首先，发现tmprss2将弗林蛋白酶生成的s1亚基(～135kda)切割成分泌到培养基中的较短的s1’片段(～115kda)(图12a)。当s1与ace-2结合时，但在s2亚基与膜融合之前，这种切割可能会增强s1和s2结构域的分离效率。此前有报道称，tmprss2将ace2脱落为可溶形式(sace2)，后者的活性可能与细胞间融合(合胞体)和ace2受体病毒摄取的增强动力学有关。一致地，过度表达hela-ace2细胞中的tmprss2增强了ace2脱落为～120和～110kdasace2形式。[0312]sace2和大部分s1’的生成都被120μm卡莫司他抑制(图12a)。需要注意的是，ace2的少量背景脱落对卡莫司他不敏感，这表明另一种内源性蛋白酶，可能是adam17，也与此有关。共免疫沉淀实验表明sace2和s1’在培养基中被发现为相互结合的复合物(图12b)。将表达s的hela细胞与含有sace2的培养基和通过在hek293细胞中共表达全长ace2和tmprss2产生的活性成熟～25kdatmprss2m的培养基进行孵育表明，sace2提高了细胞中s2’和培养基中s1的水平(图13a)。最后，在没有或存在ace2的情况下，tmprss2与wtpros或其μs1/s2突变体在hela细胞中的共表达导致类似的产生：(i)仅在ace2存在时分泌的s1’和(ii)分泌的sace2(图13b)。此外，这些数据表明，在s1/s2处的弗林蛋白酶加工不是这些tmprss2介导的切割的先决条件。[0313]实施例5.免疫细胞化学。[0314]还在细胞透化(p；v5和ace2抗体)和非透化(np；s2和ace2抗体)条件下研究了在不存在或存在1μm化合物192的情况下共表达s-蛋白或μs1/s2与ace2的hela细胞的免疫细胞化学分析(图14、15)。在没有化合物192的情况下，s-蛋白和ace2在细胞表面大量共定位(图14-a)。[0315]表达s蛋白和ace2的hela细胞形成了许多合胞体，这与s蛋白的细胞表面表达减少以及甚至更大的ace2的减少有关(图14-b)。同时表达μs1/s2和ace2的细胞显示出pros和ace2在细胞内和细胞表面的积累(图14-c)。然而，它们几乎不诱导合胞体的形成，并且当它们诱导时，s蛋白的细胞表面表达以及在较小程度上ace2的表达降低(图14-d)。在存在1μm化合物192的情况下，表达s的hela细胞(图15-a、b)对那些表达μs1/s2的细胞进行表型模拟(图6b-c、d)。[0316]实施例6.细胞间融合。[0317]在确定s蛋白和ace2在细胞表面共定位后，分析了s1/s2处弗林蛋白酶切割对s蛋白诱导细胞间融合能力的影响。因此，在hiv-1长末端重复序列(ltr)(其可以被hivtat蛋白激活)的控制下使用基于hiv-1的表达荧光素酶的载体稳定转染的helatzm-bl报告细胞开发基于发光的测定。这些细胞内源性表达hiv受体cd4及其共同受体ccr5和cxcr4。不希望受任何特定理论的束缚，供体wthela细胞(表达tat和融合s蛋白)与表达ace2的受体tzm-bl细胞的融合可能会导致荧光素酶活性的增加(图6a)。当表达hivgp160和tat的供体细胞与tzm-bl受体细胞融合时，与在与仅表达tat的供体hela细胞共培养的tzm-bl对照细胞中观察到的相比，荧光素酶活性增加。(图16c)。hela细胞中s蛋白的表达不诱导与tzm-bl对照细胞融合(图16a、16c)。然而，tzm-bl中的ace2表达允许以剂量依赖性方式与表达s蛋白的hela融合(图16b)。我们测定的线性(相关系数为0.87)验证了使用发光作为细胞间融合的指标。相反，μs1/s2在供体细胞中的表达不增强与表达ace2的tzm-bl的融合，并且在将细胞与300nm的化合物93、192或219或10μm的pc-抑制剂rvkr-cmk一起孵育时观察到》60％的融合抑制(图6b)，表明s1/s2切割促进ace2依赖性细胞间融合。[0318]tmprss2在供体细胞中与s蛋白或μs1/s2共表达，以评估tmprss2在细胞间融合中的作用。与我们的细胞生物学数据一致(图3f、4)，tmprss2消除了s的融合活性，提供了证据表明tmprss2介导的s蛋白在er中的保留通过产生s2a和s2b在质膜上损害了s蛋白的细胞间融合活性(图6c)。然而，tmprss2和ace2在受体细胞中的共表达倾向于增强与供体含s细胞的融合，这种效果在含μs1/s2的供体细胞中更为明显，导致表达wt-s或μs1/s2的供体细胞和受体ace2-tmprss2细胞之间的相似细胞间融合(图6d)。这种表型表明，在没有弗林蛋白酶切割(μs1/s2)的情况下，tmprss2生成的s1’会释放s1帽的n端部分，从而有利于s2’处的弗林蛋白酶切割和细胞间融合。事实上，ace2与不同剂量的tmprss2在受体细胞中的共表达逐渐促进了μs1/s2的融合达到与wt-s诱导的融合相似的水平(图17)。然而，单独的sace2对μs1/s2没有影响(a与b)，因为s2’位点仍会被未切割的s1亚基覆盖(图17)。因此，只有在ace2受体细胞中高水平的tmprss2才能与表达wt-s和μs1/s2的供体细胞进行类似的融合(图17a)。有趣的是，受体细胞中可溶性形式的ace2(sace2)的过表达显著增强了与含有wt-s的供体细胞的融合。在这里，sace2-s1复合物可以通过其rgd基序或s1与神经毛蛋白1,2结合受体细胞上的受体，例如与整联蛋白结合以促进细胞间融合。[0319]实施例7.弗林蛋白酶抑制剂对假病毒进入的影响。[0320]为了评估s1/s2位点的刺突加工在sars-cov-2进入中的重要性，对带有wt或μs1/s2s-蛋白的gp160缺陷hiv进行假分型，并在不同的靶细胞中测试病毒进入。使用肺calu-3和肾hek293t-ace2作为模型细胞靶标，表达μs1/s2的病毒的细胞进入在calu-3中完全有缺陷，但在表现出增强的病毒进入的293t-ace2中则没有(图7a)，veroe6细胞类似。由于sars-cov-2可以通过“不依赖ph”或“依赖ph”的途径进入靶细胞，据报道该病毒使用后者来感染veroe6细胞。提高ph值的氯喹有效地阻止了假型sars-cov-2及其μs1/s2突变体的进入(图18)，这表明在293t-ace2系统中，介导病毒进入的s蛋白被内体ph依赖性蛋白酶激活。这与之前的发现一致，即hek293细胞允许通过网格蛋白包被的囊泡内吞携带sars-cov-2刺突蛋白的假病毒颗粒。[0321]当在病毒包装期间用本公开的代表性化合物处理产生293t17的细胞时，表达wtpros-蛋白的hiv颗粒在293t-ace2中保持高度传染性，但在calu-3中完全有缺陷(图7b；图19)。因此，用本公开的化合物处理细胞在两种靶细胞中表型模拟出μs1/s2的作用。重要的是，这些表型不是由于假病毒产生/释放增加，因为hivp24的水平在所有情况下都是相当的(图7c)。同样，在存在1μm化合物93的情况下，wt-s的加工明显受损，而整体μs1/s2表达谱不受影响(图7c)。数据表明弗林蛋白酶样转化酶对s蛋白的加工对于calu-3细胞中的ph非依赖性病毒进入至关重要，但在稳定表达ace2的hek293细胞(病毒通过内吞途径进入)中则不然。[0322]实施例8.弗林蛋白酶样抑制剂减少sars-cov-2感染细胞中的病毒产生。[0323]在感染实验室分离的sars-cov-2病毒(moi：0.01)前24小时用1μm化合物93、192或219预处理calu-3细胞并在感染后12、24和48小时收集用于噬斑测定，从而分析评估了这些弗林蛋白酶样抑制剂对sars-cov-2复制的可能抗病毒作用。化合物93、192或219在感染后12、24和48小时显著降低病毒滴度(图8a)。研究了不同剂量的这些抑制剂对感染后24小时产生的感染性病毒产量的抑制作用，发现用1μm化合物93使后代病毒的滴度降低了30倍以上，尽管抑制作用可以从0.25μm开始观察到(图8b；左图)。此外，化合物93的ic50和选择性指数(si)分别为0.2μm和624.1，突显了抑制剂的真正功效(图8b；右图)。对化合物219和化合物192进行的类似分析揭示了相当的抗病毒作用和选择性指数(图20a、20b)。重要的是，用不同剂量的化合物93处理的calu-3细胞中的病毒刺突蛋白(全长和切割的s)和核衣壳蛋白水平以及相应的后代病毒水平同样下降(图8c)，强调了在肺上皮细胞感染期间传染性sars-cov-2的产生中弗林蛋白酶样转化酶发挥的关键作用。此外，还在veroe6中评估了这些抑制剂对sars-cov-2感染的抗病毒作用，veroe6是一种据报道主要通过内吞途径感染的细胞靶标。在该系统中，1μm化合物93的最佳抑制效果表明，在持续12-48小时的感染期内，病毒产量下降～5.7倍(图21)，这反映了内体中的某些弗林蛋白酶活性。[0324]基于veroe6和calu-3细胞中代表性化合物的si，化合物192进一步与卡莫司他联合使用，以探索这些抑制剂对calu-3细胞中病毒复制的潜在协同作用。为此，观察到这两种抑制剂可以单独且有意义地减少病毒复制，但两者(1μm化合物192 100μm卡莫司他)共同治疗抑制了》99％的后代病毒(图8d)。这突出了这些药物的协同作用以及内源性弗林蛋白酶样蛋白酶(可能是tmprss2)在sars-cov-2有效感染calu-3细胞中的重要性。[0325]实施例9.实验方法。[0326]酶促pc抑制和弗林蛋白酶抑制剂的细胞弗林蛋白酶抑制[0327]生化测定：前蛋白转化酶弗林蛋白酶(108-574-tev-flag-6his)、pc5a(pcsk5；115-63-tev-flag-6his)、pace4(pcsk6；150-693-tev-flag-6his)和pc7(pcsk7；142-634-tev-flag-6his)酶从bacmam转导的cho细胞中纯化。反应在黑色384孔聚苯乙烯低体积板(greiner)中进行，最终体积为10μl。将小分子抑制剂(例如，化合物93、化合物219和化合物192)溶解在dmso(1mm)中，并用dmso通过11次稀释连续稀释1至3倍，以提供0.00017至10μm的最终化合物浓度范围。将0.05μl的每种浓度转移到测定板的相应孔中，然后将测定缓冲液(100mmhepesph7.5、1mmcacl2和0.005％tritonx-100)中的5μl酶(弗林蛋白酶、pcsk5、pcsk6和pcsk7)使用multidropcombi(thermo)添加到化合物板中以得到分别为0.02、0.5、2.5和1.0nm的最终蛋白质浓度。将板倒置混合，并在室温(～22℃)将酶与化合物预孵育30分钟后，将底物fam-qrvrravgidk-tamra(anaspec#808143，对于弗林蛋白酶、pcsk5、pcsk6和pcsk7，在测定缓冲液中分别为1、0.25、0.20和0.5μm的5μl溶液)使用multidropcombi添加到整个测定板中。将板以500xg离心1分钟并在室温孵育2小时。然后使用envision仪器(perkinelmer)对酶抑制进行量化。将数据标准化为由1μm癸酰基-arg-val-lys-arg-氯甲基酮(calbiochem#344930)确定的最大抑制。高尔基体成像测定：该测定使用基于图像的平台来评估弗林蛋白酶抑制剂的细胞内活性。反应在黑色384孔、组织培养处理的透明底板(greiner)中进行。将分析中的化合物溶解在dmso(1.0mm)中，并用dmso连续稀释1至3倍，经过11次稀释。这产生了从0.00017到10μm的最终化合物浓度范围，并且将每种浓度的0.1μl转移到测定板的相应孔中。[0328]细胞分析：通过添加u2os细胞开始分析，所述u2os细胞同时用bacmam递送的构建体转染，所述构建体包含高尔基体靶向序列，随后是来自骨形态发生蛋白10(bmp10)的12-氨基酸弗林蛋白酶/pcsk切割位点，然后是c末端的gfp。二碱基弗林蛋白酶切割位点序列的侧翼是富含甘氨酸的连接基(galnac-t2-ggggs-dstarirrnakg-ggggs-gfp)。简而言之，冷冻细胞在测定培养基(dulbecco改良的eagle培养基营养混合物f-12(ham)，不含酚红，含5％fbs)中解冻，并使用multidropcombi(thermo)稀释以将6000个细胞/孔(50μl)递送到板。在37℃孵育24小时后，细胞用cellmaskdeepred染色，固定在多聚甲醛中，细胞核用ho33342染色。以靶向高尔基体的gfp在细胞内形成明亮的点状簇。在没有弗林蛋白酶/pcsk抑制剂的情况下，内源性蛋白酶从其n-乙酰半乳糖胺基转移酶-2高尔基体系链中切割gfp，将gfp释放到高尔基体腔中，其中荧光被稀释至低于测定灵敏度阈值。在存在细胞可渗透弗林蛋白酶/pcsk抑制剂的情况下，gfp荧光随着高尔基体内蛋白酶活性的降低而增加。细胞gfp强度由基于图像的放大40倍，每孔测量4个区域的采集(incell2200，perkinelmer)确定。多尺度顶帽分割用于识别gfp标记的斑点并在每个细胞的基础上量化所有斑点的平均荧光。平行测定细胞毒性。[0329]弗林蛋白酶和trmpss2荧光测定：重组弗林蛋白酶购自biolegend(#719406)，trmpss2购自cusabio，包含不同切割位点的dabcylglu-edans标记的肽(补充表1)购自genscript。反应在室温在黑色384孔聚苯乙烯低体积板(cellstar-greinerbio-one#784476)中进行，最终体积为15μl。荧光肽以5μm使用，反应在50mmtris缓冲液(ph6.5或7.5)、0.2％tritonx-100、1mmcacl2中进行且弗林蛋白酶以2-100nm的最终浓度添加。将小分子抑制剂(化合物93、化合物219和化合物192)溶解在dmso(1mm)中，并用dmso连续稀释1至2倍，以在酶促测定中提供50μm至0.01nm的最终化合物浓度范围，其中含有5％dmso。对于tmprss2，荧光肽以5μm使用，反应在50mmtris缓冲液(ph6.5或7.5)、0.2％tritonx-100、50mmnacl中进行，且tmprss2以25-100nm的最终浓度添加。通过确定释放dabcyl猝灭剂后edans(493nm)荧光(使用safire2tecan荧光计在335nm处激发)的增加来定量合成肽的切割。在90分钟内跟踪荧光，并通过测量反应线性阶段荧光的增加来推断酶活性。每个反应一式三份进行，并使用excel-ecart类型函数计算标准偏差。[0330]质粒[0331]将sars-cov-2(优化序列)的c端v5标记的刺突糖蛋白及其突变体克隆到pires-neo3载体上。根据制造商的说明，使用quick-change试剂盒(stratagene,ca)实现定点诱变。质粒pci-neo-hace2来自dwlambert(利兹大学)，pires-neo3-htmprss2来自pjolicoeur(ircm)。δenvvpr荧光素酶报告载体(pnl4-3.luc.r-e-)是nathaniellandau博士通过nihaids试剂项目获得的，而phiv-1nl4-3δenv-nanoluc构建体是pbieniasz博士的友好礼物。编码vsv-g、作为hiv-1env和tat的质粒先前已经描述。[0332]细胞培养和转染[0333]hela、hek293t、hek293t17和veroe6细胞的单层在37℃、5％的二氧化碳条件下在补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs；invitrogen)的dulbecco改良eagle培养基(dmem；invitrogen)中培养。hek293t-ace2是paulbieniasz博士慷慨赠送的，其在含有10％fbs、1％非必需氨基酸(neaa)和50μg/ml杀稻瘟素(invivogen)的dmem中维持。calu-3在含有10％fbs的f12k/dmem中培养。在补充有10％(v/v)胎牛血清(fbs；invitrogen)的dulbecco改良eagle培养基(dmem；invitrogen)中于37℃在5％co2中培养细胞。根据制造商的说明(polyplustransfection，newyork，usa)用jetprime转染试剂转染细胞。在转染后24小时，将培养基更换为无血清dmem，并再培养24小时。为了建立过表达人ace2的稳定hela细胞，将细胞在含有500μg/ml新霉素(g418，wisent)的培养基中维持两周。[0334]为了产生用sars-cov-2s假型化的hiv颗粒，用1μgpnl4-3.luc.r-e-(或phiv-1nlδenv-nanoluc)在存在或不存在0.3μgpir-2019-ncov-sv5质粒的情况下使用lipofectamine-3000(lifetechnologies)转染293t17细胞(600,000个细胞接种在6孔容器中)。在某些实验中，293t17细胞在转染后6小时用小分子抑制剂(例如，化合物93、219或192)处理。分别在转染后24小时或48小时收集表达纳米或萤火虫荧光素酶的假病毒颗粒。通过以300xg离心澄清病毒上清液，通过0.45-μm孔径聚偏二氟乙烯(pvdf；milipore)注射器过滤器(millipore；slgvr33rs)，并在-80℃冷冻等分试样。对于纯化的假病毒颗粒的wb分析，病毒上清液通过在20％蔗糖垫上以35,000rpm超速离心3小时进行浓缩；beckmancouteroptimaxe；ti70.1转子)。在所有实验中，缺乏sars-cov-2s糖蛋白的hiv颗粒作为阴性对照。[0335]使用mtt的细胞活力测定[0336]将在前一天以10,000(hek-293t和veroe6)或50,000(calu-3)细胞接种在96孔板中的细胞用连续10倍稀释的小分子抑制剂(例如，化合物93、192或219)处理长达48小时。仅用载体处理的细胞用作阴性对照。随后将mtt添加到培养基中(终浓度：2.5mg/ml)并将细胞进一步在37℃孵育4小时。除去培养基后，加入dmso并使用微孔板分光光度计在595nm处读取吸光度。一式三份进行的两次独立实验的数据用于使用graphpadprismv5.0软件通过非线性回归计算cc50。[0337]蛋白质印迹(westernblot)[0338]用pbs洗涤细胞，然后使用ripa缓冲液(1％tritonx-100、150mmnacl、5mmedta和50mmtris，ph7.5)在4℃裂解30分钟。以14,000×g离心10分钟后收集细胞裂解物。通过sds-page在7％tris-甘氨酸或8％甲基甘氨酸凝胶(tricinegel)上分离蛋白质并转移到pvdf膜(perkinelmer)。当指定时，收集来自经培养和经转染细胞的培养基并使用具有10kda截止值的amiconultra2ml设备(millipore；ufc201024)浓缩10倍，如制造商指定的，并通过sds-page分析，然后蛋白质印迹。使用v5单克隆抗体(v5-mabv2660；1:5000；invitrogen)、ace2抗体(兔单克隆ab108252；1:3,000；abcam)、tmprss2抗体(兔多克隆；14427-1-ap；1:1,000；proteintech)，肌动蛋白抗体(兔多克隆a2066；1:5,000；sigma)或sars-cov-2刺突抗体(兔多克隆gentexgtx135356；1:2,000；gentex)。使用适当的hrp缀合的二抗和增强的化学发光试剂盒(ecl；amersham或bio-rad)使抗原-抗体复合物可视化，并将标准化报告为β-肌动蛋白。使用imagelab软件(bio-rad)对条带进行量化。[0339]为了分析sars-cov-2s病毒颗粒或假病毒颗粒，纯化的病毒颗粒和相应的产生细胞(分别为calu-3或293t17)的蛋白质提取物在10％tris-甘氨酸凝胶上拆分，并进行免疫印迹以检测刺突、核衣壳、hiv-1gagp24或肌动蛋白，其分别使用抗v5(用于假病毒颗粒检测；v2660)/抗s2(用于病毒颗粒检测；sinobiologicals；40590-t62)、抗n(sinobiologicals；40143-mm05)、抗p24(mbs杂交瘤细胞系31-90-25)或抗肌动蛋白(mpbiomedicals,sku08691001)。[0340]糖苷酶处理[0341]按照制造商(newenglandbiolabs)的建议，在37℃用内切糖苷酶-h(endo-h；p0702l)或内切糖苷酶-f(endo-f；p0705s)消化30至50μg蛋白质90分钟。[0342]抑制剂处理[0343]在转染后24小时，将细胞与以下两种泛pc抑制剂一起孵育6小时：细胞可渗透癸酰基-rvkr-氯甲基酮(cmk；50mm；4026850.001；bachem)，或与细胞表面pc-抑制剂六-d-精氨酸(d6r；20μm；344931；emd)。然后用含有抑制剂的新鲜培养基更换再持续24小时。对于选择性可渗透细胞的弗林蛋白酶样抑制剂，从转染前5小时开始并在整个实验期间用指定浓度的抑制剂处理细胞。[0344]细胞间融合测定[0345]hela或helatzm-bl细胞以200,000个细胞铺板在12孔板中。hela细胞用sars-cov-2刺突或nl4.3-hivenv的不同构建体或空载体和0.2μgcmv-tat质粒瞬时转染。helatzm-bl细胞用人ace2、tmprss2或两者的组合转染。在转染后6小时，用含有弗林蛋白酶抑制剂的新鲜培养基替换培养基，24小时后用pbs-edta(1μm)分离细胞。将hela和hela-tzm-bl细胞的不同组合以1:1的比例置于共培养板中，在96孔板中总共有60,000个细胞/孔。18-24小时后，除去培养基并在每个孔中加入50μl细胞裂解试剂。使用50μl海肾荧光素酶试剂(promega，madison，wi，usa)将20μl细胞裂解液用于荧光素酶读数。使用promegaglomax读板器(promega,madison,wi,usa)测量相对光单位(rlu)，并将值报告为在转染ev的hela细胞与相应tzm-bl细胞的共培养中测量的rlu的倍数增加。[0346]显微镜检查[0347]为了建立荧光素酶测定，将细胞共培养物铺板在玻璃盖玻片上。18-24小时后，将细胞与488cellmasktm一起孵育以染色膜，然后在4℃用4％pfa固定15分钟。使用含有dapi(invitrogen)的prolongtmgoldantifade将玻璃盖玻片安装在载玻片上。对10个区域的合胞体数量进行计数。[0348]免疫荧光[0349]在玻璃盖玻片上进行细胞培养和转染。细胞用pbs洗涤两次，并在室温用新鲜的4％多聚甲醛固定10分钟。洗涤后，细胞未透化或用含有2％bsa的pbs中的0.2％tritonx-100透化5分钟，洗涤，然后用含有2％bsa的pbs进行封闭1小时。使用针对v5(小鼠单克隆r960-25；1:1000；invitrogen)、刺突(小鼠单克隆gtx632604；1:500；genetex)和ace2(山羊多克隆af933；1:500；rndsystems)的抗体在4℃将细胞与一抗孵育过夜。洗涤后，将相应的物种特异性alexa-fluor(488或555)标记的抗体(molecularprobes)在室温孵育1小时。使用带有dapi(p36935，lifetechnologies)的prolonggold试剂将盖玻片安装在载玻片上。在zen软件上使用带有plan-apochromat63x/1.40oildicm27物镜的共聚焦激光扫描显微镜(lsm710，carlzeiss)对样品进行可视化。[0350]假病毒进入[0351]293t-ace2或calu-3(10,000个细胞/孔，前一天在96孔培养皿中铺板)与多达200μl过滤的假病毒颗粒一起孵育过夜。除去病毒接种物，然后加入新鲜培养基并将细胞培养至多72小时。去除用过的培养基后，用pbs轻轻洗涤293t-ace2和calu-3细胞两次，并分别使用promega荧光素酶测定法(cat#e1501)或nano-glo荧光素酶系统(cat#n1110)分别分析萤火虫或纳米荧光素酶活性。[0352]活病毒测定[0353]具有复制能力的sars-cov-2病毒[0354]作为病毒来源的sars-cov-2最初是从加拿大魁北克的一名covid-19患者中分离出来的，并被指定为lspq1。使用如下详述的噬斑测定法在veroe6中扩增临床分离物并滴定，并通过测序验证s蛋白多碱基蛋白转化酶位点的完整性。所有涉及传染性sars-cov-2病毒的实验均在先前批准用于sars-cov-2工作的生物安全3级实验室(ircm)的指定区域进行。[0355]veroe6中的噬斑测定[0356]在感染前两天，将veroe6细胞(1.2x105细胞/孔)一式四份接种在补充有10％fbs的dmem中的24孔组织培养板中。在37℃(200μl感染体积)，用含有sars-cov-2的病毒上清液以最多6个10倍系列稀释度(10-2-10-6)感染细胞1小时。在1小时期间，板每15分钟手动摇动一次。随后，去除病毒，洗涤细胞并添加覆盖培养基(在dmem中含有0.6％低熔点琼脂糖和10％fbs)，并在37℃静置孵育60-65小时。孵育后，用4％甲醛固定细胞并用0.25％结晶紫(在30％甲醇中制备)染色。使用高分辨率dlsr相机(nikon型号：d80，物镜：“afmicro-nikkor60mmf/2.8d”)拍摄了高质量的斑块照片。手动和平行计数斑块，处理成像的斑块板，并使用基于自动算法的matlab软件计数斑块。病毒滴度表示为每毫升的噬斑形成单位(pfu/ml)：(噬斑数x病毒稀释因子)x1000/用于感染的病毒稀释体积(以微升为单位)。感染复数(moi)表示为：moi＝用于感染的病毒的pfu/细胞数。[0357]完全复制的sars-cov-2的细胞感染[0358]前一天将veroe.6和calu-3细胞一式两份接种在12孔板中(2.3x105个细胞/孔)。用各种浓度(0.1-1μm)的小分子抑制剂(例如，化合物93、192或219)和单独的媒介物(dmso)对细胞进行长达24小时的预处理。在某些实验中，calu-3也用卡莫司他预处理1小时。此后，在37℃的350μl无血清dmem中偶尔手动摇动培养板以0.001的moi用sars-cov-2病毒感染细胞1小时(veroe6)或以0.01的moi用sars-cov-2病毒感染细胞3小时(calu-3细胞)。将仅细胞加培养基用作对照。孵育后，去除病毒，细胞单层依次用pbs和无血清dmem洗涤两次。随后将含有上述浓度的小分子抑制剂的新培养基(共1ml)添加到细胞中。在感染后12、24和48小时去除无细胞上清液(250μl)。在感染后24小时将药物补充到1ml培养基中。将病毒上清液储存在-80℃直至进一步使用。如上所述，使用对veroe6.1细胞的噬斑测定对上清液中的病毒产生进行量化。在某些实验中，在感染结束时收集病毒上清液，并使用如上所述的超速离心在20％蔗糖垫上进行纯化。适当时通过蛋白质印迹分析所得到的浓缩的病毒和相应的感染细胞。[0359]量化和统计分析：通过噬斑测定一式三份量化的病毒滴度显示为平均值±标准偏差。一式三份进行的实验结果用于使用graphpadprismv5.0软件通过非线性回归计算ic50。通过student’st检验评估对照细胞(含有0.001％dmso的病毒)和用小分子抑制剂(例如，化合物93、192或219)处理的细胞之间的差异。0.05或更低的p值被认为具有统计学意义(*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001)。[0360]等效物和范围[0361]在权利要求书中，除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则例如“一(a/an)”和“所述”的冠词可以意指一或大于一。除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则如果一个、一个以上或所有的群组成员存在、使用于既定产品或方法中或另外与其有关，那么在群组的一或多个成员之间包括“或”的权利要求书或说明书被视为满足。本公开包括群组中恰好一个成员存在、使用于既定产品或方法中或另外与其有关的实施例。本公开包括一个以上或所有的群组成员存在、使用于既定产品或方法中或另外与其有关的实施例。[0362]此外，本公开涵盖其中来自一或多条所列权利要求的一或多个限制、要素、条款和描述性用语被引入到另一条权利要求中的所有变化、组合和排列。举例来说，附属于另一权利要求的任何权利要求可以经修改以包括在附属于同一基本权利要求的任何其它权利要求中可见的一或多个限制。在要素以清单形式(例如以马库什群组(markushgroup)形式)呈现时，所述要素的每一子组也被公开，并且可以从所述群组去除任何要素。应理解，一般来说，在本公开或本公开的方面被称为包含具体要素和/或特征时，本公开的或本公开的方面的某些实施例由此类要素和/或特征组成或主要由此类要素和/或特征组成。出于简单的目的，那些实施例尚未专门地以这些词语阐述在本文中。还应注意，术语“包含”和“含有”打算为开放的并且允许包括另外要素或步骤。在给出范围时，包括端点。此外，除非另外指明或另外从上下文和本领域的普通技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可以在本公开的不同实施例中采用所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则达到所述范围下限的单位的十分之一。[0363]本技术提及各种颁予的专利、公开的专利申请、杂志文章和其它出版物，其都以引用的方式并入本文中。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，那么应以本说明书为准。另外，属于现有技术内的本公开的任何具体实施例可以从权利要求中的任何一或多者明确排除。因为此类实施例被认为是本领域的普通技术人员已知的，所以其可以被排除，即使所述排除在本文中并未明确阐述。本公开的任何具体实施例可以出于任何原因从任何权利要求排除，无论与现有技术的存在相关与否。[0364]本领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别或能够确定本文所述的特定实施例的许多等效物。本文所述的本公开的实施例的范围并不打算限于上述描述，而是实际上如所附权利要求书中所阐述。本领域的普通技术人员将了解，可以在不脱离如随附权利要求书中定义的本公开的精神或范围的情况下对本说明书作出各种改变和修改。当前第1页12当前第1页12