包封的rna复制子和使用方法
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技术领域
5.本公开内容总体上涉及免疫学、炎症和癌症治疗剂的领域。更具体地，本公开内容涉及具有改进的负载能力和编码有效负载分子的异源多核苷酸的病毒复制子，以及颗粒包封的病毒复制子。本公开内容进一步涉及增殖性障碍诸如癌症的治疗和预防。
背景技术：
6.本领域中仍然存在对与病毒和/或病毒复制子的治疗用途相关的组合物和方法的长期且未得到满足的需求，所述病毒和/或病毒复制子包含对一种或多种治疗分子的改进的负载能力和/或功能。本公开内容提供了这样的组合物和方法等。
技术实现要素：
7.本公开内容提供了重组rna复制子，其包含：a)小核糖核酸病毒基因组，其中所述小核糖核酸病毒基因组包含在一个或多个蛋白编码区中的缺失或截短；和b)异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组包含在一个或多个vp编码区中的缺失或截短。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组包含在vp1、vp3和vp2编码区中的每一个中的缺失或截短。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组包含vp1和vp3编码区的缺失以及vp2编码区的截短。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含至少2000bp。在某些实施方案中，所述缺失的位点或所述截短的位点包含所述异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在2a编码区和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在3d编码区和3’非翻译区(utr)之间。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸包含至少1000bp、至少2000bp或至少3000bp。
8.本公开内容提供了重组rna复制子，其包含：a)塞内卡谷病毒(svv)基因组，其中所述svv基因组包含在一个或多个蛋白编码区中的缺失或截短；和b)异源多核苷酸(即，所述复制子是svv衍生出的复制子)。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含根据seq id no:1的编号在核苷酸1261和3477(包括端点)之间的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至3477(包括端点)。在
某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp或至少2000bp。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含至少2000bp。在某些实施方案中，所述svv基因组包含5’前导蛋白编码序列。在某些实施方案中，所述svv基因组包含vp4编码区。在某些实施方案中，所述svv基因组包含vp2编码区或其截短体。在某些实施方案中，所述svv基因组从5’至3’方向包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体。在某些实施方案中，包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体的svv基因组的部分与seq id no:1的核苷酸1至1260具有至少90％序列同一性。在某些实施方案中，所述svv基因组从5’至3’方向包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区、vp2编码区或其截短体和异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述svv基因组包含顺式作用复制元件(cre)。在某些实施方案中，所述cre包含10-200bp。在某些实施方案中，所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1117至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述svv基因组进一步包含2a编码区。在某些实施方案中，所述2a编码区位于vp2编码区或其截短体和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述svv基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区中的一个或多个。在某些实施方案中，所述svv基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。在某些实施方案中，所述svv基因组从5’至3’包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。在某些实施方案中，包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区的svv基因组的部分与根据seq id no:1的核苷酸3505至7310具有至少90％序列同一性。在某些实施方案中，所述svv基因组从5’至3’包含异源多核苷酸和2b编码区。
9.本公开内容提供了重组rna复制子，其包含：a)柯萨奇病毒基因组，其中所述柯萨奇病毒基因组包含在一个或多个蛋白编码区中的缺失或截短；和b)异源多核苷酸(即，所述复制子是柯萨奇病毒衍生出的复制子)。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含根据seq id no:3的编号在核苷酸717至3332(包括端点)之间的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含根据seq id no:3的编号的核苷酸717至3332(包括端点)。在某些实施方案中，所述缺失或所述截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp或至少2600bp。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒基因组包含5’utr。在某些实施方案中，包含5’utr的柯萨奇病毒基因组的部分与seq id no:4具有至少90％序列同一性。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒基因组包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr中的一个或多个。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒基因组包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒基因组从5’至3’方向包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。在某些实施方案中，包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr的柯萨奇病毒基因组的部分与seq id no:3中的核苷酸3492至7435具有至少90％序列同一性。在某些实施方案中，所述柯萨奇
病毒基因组从5’至3’包含5’utr、异源多核苷酸和2a编码区。
10.本公开内容提供了重组rna复制子，其包含：a)脑心肌炎病毒(emcv)基因组，其中所述emcv基因组包含在一个或多个蛋白编码区中的缺失或截短；和b)异源多核苷酸(即，所述复制子是emcv衍生出的复制子)。
11.在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含插入在异源多核苷酸和2b编码区之间的内部核糖体进入位点(ires)。
12.在某些实施方案中，所述重组rna复制子的异源多核苷酸编码一个或多个有效负载分子。在某些实施方案中，所述重组rna复制子的异源多核苷酸编码两个或更多个有效负载分子。在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子通过一个或多个切割多肽可操作地连接。在某些实施方案中，所述切割多肽包含2a家族自切割肽、3c切割位点、弗林蛋白酶位点、igsf1多肽或hiv蛋白酶位点。在某些实施方案中，所述切割多肽包含igsf1多肽，且其中所述igsf1多肽包含与seq id no:75具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含hiv蛋白酶位点。在某些实施方案中，所述切割多肽包含2a家族自切割肽。在某些实施方案中，所述切割多肽包含弗林蛋白酶位点。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸编码包含两个或更多个有效负载分子和切割多肽的多肽，所述多肽从n-端至c-端包含：n
’‑
有效负载分子1-切割多肽-有效负载分子2-c’。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸进一步包含编码hiv蛋白酶的编码区，且其中所述异源多核苷酸包含编码多肽的编码区，所述多肽从n-端至c-端包含：n
’‑
有效负载分子1-hiv蛋白酶位点-hiv蛋白酶-hiv蛋白酶位点-有效负载分子2-c’。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸进一步包含编码第三有效负载分子的编码区，且其中所述异源多核苷酸包含编码多肽的编码区，所述多肽从n-端至c-端包含：n
’‑
有效负载分子1-hiv蛋白酶位点-hiv蛋白酶-hiv蛋白酶位点-有效负载分子2-hiv蛋白酶位点-有效负载分子3-c’。在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子进一步包含在所编码的多肽的c-端处的切割多肽。
13.在某些实施方案中，所述有效负载分子选自荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子、抗原、能够结合细胞表面受体的抗原结合分子和细胞表面受体的配体。在某些实施方案中，所述有效负载分子选自：
14.a)一种或多种细胞因子，包含ifnγ、gm-csf、il-2、il-12、il-15、il-18、il-23和il-36γ；
15.b)一种或多种趋化因子，包含cxcl10、ccl4、ccl5和ccl21；
16.c)一种或多种抗体，包含抗-pd1-vhh-fc抗体、抗-cd47-vhh-fc抗体和抗-tgfβ-vhh(或scfv)-fc抗体；
17.d)一种或多种双组分多肽，包含结合dll3和效应细胞靶抗原的双组分多肽、结合fap和效应细胞靶抗原的双组分多肽、以及结合epcam和效应细胞靶抗原的双组分多肽；
18.e)一种或多种肿瘤相关抗原，包含存活素、mage家族蛋白和根据表6的所有抗原；
19.f)一种或多种肿瘤新抗原；
20.g)一种或多种结合mhc-肽抗原复合物的双组分多肽；
21.h)一种或多种促融合蛋白，包含单纯疱疹病毒(hsv)ul27/糖蛋白b/gb，hsv ul53/糖蛋白k/gk，呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，fastp15，vsv-g，syncitin-1(来自人内源性逆转录病毒-w(herv-w))或syncitin-2(来自hervfrde1)，副粘病毒sv5-f，麻疹病毒-h，麻疹
病毒-f，来自逆转录病毒或慢病毒诸如长臂猿白血病病毒(galv)、鼠白血病病毒(mlv)、mason-pfizer猴病毒(mpmv)和马传染性贫血病毒(eiav)的糖蛋白，任选地除去了r跨膜肽(r-版本)；
22.i)一种或多种其它有效负载分子，包含il15r、pgdh、ada、ada2、hyal1、hyal2、chips、mlkl(或仅它的4hb结构域)、gsdmd(或它的l192a突变体、或它的氨基酸1-233片段、或它的具有l192a突变的氨基酸1-233片段)、gsdme(或它的氨基酸1-237片段)、hmgb1(或仅它的box b结构域)、蜂毒肽(例如，α-蜂毒肽)、smac/diablo(或它的氨基酸56-239片段)、蛇laao、蛇解聚素、瘦素、flt3l、trail、gasdermin d或其截短体、gasdermin e或其截短体；
23.j)一种或多种来自病原体的抗原，所述病原体包含登革热病毒、切昆贡亚病毒、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒、sars-cov-2、冠状病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、甲型流感病毒、流感b病毒和兽医病毒；或
24.k)它们的任意组合。
25.在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子选自荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子、能够结合细胞表面受体的抗原结合分子和细胞表面受体的配体。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸编码两个或更多个有效负载分子，其包含：
26.il-2和il-36γ；
27.cxcl10以及结合fap和cd3的抗原结合分子；
28.il-2以及结合dll3和cd3的抗原结合分子；
29.il-36γ以及结合dll3和cd3的抗原结合分子；或
30.il-2、il-36γ以及结合dll3和cd3的抗原结合分子。
31.在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子进一步包含微rna(mirna)靶序列(mir-ts)盒，其包含一个或多个mirna靶序列。在某些实施方案中，所述一个或多个mirna包含mir-124、mir-1、mir-143、mir-128、mir-219、mir-219a、mir-122、mir-204、mir-217、mir-137和mir-126。
32.本公开内容提供了重组dna分子，其从5’至3’包含启动子序列、5’连接切割序列、编码本公开内容的重组rna复制子的多核苷酸序列和3’连接切割序列。在某些实施方案中，所述启动子序列是t7启动子序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是核酶序列且所述3’连接切割序列是核酶序列。在某些实施方案中，所述5’核酶序列是锤头核酶序列且其中所述3’核酶序列是丁型肝炎病毒核酶序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是核酶序列且所述3’连接切割序列是限制性酶识别序列。在某些实施方案中，所述5’核酶序列是锤头核酶序列、手枪核酶序列或经修饰的手枪核酶序列。在某些实施方案中，3’限制性酶识别序列是iis型限制性酶识别序列。在某些实施方案中，所述iis型识别序列是sapi识别序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是rna酶h引物结合序列且所述3’连接切割序列是限制性酶识别序列。
33.本公开内容提供了生产重组rna复制子的方法，其包含体外转录本公开内容的dna分子和纯化得到的重组rna复制子。
34.本公开内容提供了组合物，其包含有效量的本公开内容的重组rna复制子和适用于施用给哺乳动物受试者的载体。
35.本公开内容提供了载体，其包含本公开内容的重组rna复制子。在某些实施方案
中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述载体是非病毒载体。
36.本公开内容提供了颗粒，其包含本公开内容的重组rna复制子。在某些实施方案中，所述颗粒选自纳米颗粒、外泌体、脂质体和脂质体复合物。在某些实施方案中，所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒(lnp)，其包含阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和磷脂-聚合物缀合物。在某些实施方案中，所述阳离子脂质选自dlindma、dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma(mc3)、ss-lc(以前名称:ss-18/4pe-13)、ss-ec(以前名称:ss-33/4pe-15)、ss-oc、ss-op、9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(l-319)或n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)。在某些实施方案中，所述辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)；和胆固醇。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)，且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)。在某些实施方案中，所述磷脂-聚合物缀合物选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg)；1,2-二棕榈酰基-消旋-甘油甲氧基聚乙二醇(dpg-peg)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dsg-peg)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dsg-peg)；1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dmg-peg)；和1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dmg-peg),或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg-胺)。在某些实施方案中，所述磷脂-聚合物缀合物选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-5000](dspe-peg5k)；1,2-二棕榈酰基-消旋-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(dpg-peg2k)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-5000(dsg-peg5k)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-2000(dsg-peg2k)；1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-5000(dmg-peg5k)；和1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-2000(dmg-peg2k)。在某些实施方案中，所述阳离子脂质包含ss-oc，其中所述一种或多种辅助脂质包含胆固醇(chol)和dspc，且其中所述磷脂-聚合物缀合物包含dpg-peg2000。在某些实施方案中，ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是a:b:c:d，其中：
[0037]
(a)a＝40％-60％，b＝10％-25％，c＝20％-30％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0038]
(b)a＝45％-50％，b＝20％-25％，c＝25％-30％，且d＝0％-1％并且其中a b c d＝100％
[0039]
(c)a＝40％-60％，b＝10％-30％，c＝20％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0040]
(d)a＝40％-60％，b＝10％-30％，c＝25％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0041]
(e)a＝45％-55％，b＝10％-20％，c＝30％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％；
[0042]
(f)a＝45％-50％，b＝10％-15％，c＝35％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％；
[0043]
(g)a＝45％-65％，b＝5％-20％，c＝20％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0044]
(h)a＝50％-60％，b＝5％-15％，c＝30％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0045]
(i)a＝55％-60％，b＝5％-15％，c＝30％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％；或
[0046]
(j)a＝55％-60％，b＝5％-10％，c＝30％-35％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％。
[0047]
在某些实施方案中，ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是：约49:22:28.5:0.5；约49:11:38.5:1.5；或约58:7:33.5:1.5。在某些实施方案中，ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约49:22:28.5:0.5。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)，且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)。
[0048]
在某些实施方案中，本公开内容的颗粒进一步包含磷脂-聚合物缀合物，其中所述磷脂-聚合物缀合物是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(dspe-peg)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg-胺)。
[0049]
在某些实施方案中，本公开内容的颗粒进一步包含编码溶瘤病毒的第二重组rna分子。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒是小核糖核酸病毒。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒是塞内卡谷病毒(svv)。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒是柯萨奇病毒。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒是脑心肌炎病毒(emcv)。
[0050]
本公开内容提供了治疗组合物，其包含本公开内容的多个脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约50nm至约120nm的平均大小。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约100nm的平均大小。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约20mv至约-20mv、约10mv至约-10mv、约5mv至约-5mv、或约20mv至约-40mv、-50mv至约-20mv、约-40mv至约-20mv、或约-30mv至约-20mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约-30mv、约-31mv、约-32mv、约-33mv、约-34mv、约-35mv、约-36mv、约-37mv、约-38mv、约-39mv或约-40mv的平均ζ电位。
[0051]
本公开内容提供了杀死癌细胞的方法，包含将所述癌细胞暴露于本公开内容的颗粒、载体、重组rna复制子或组合物。在某些实施方案中，在体内、在体外或离体执行所述方法。
[0052]
本公开内容提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包含给遭受癌症的受试者施用有效量的本公开内容的颗粒、载体、重组rna复制子或组合物。在某些实施方案中，将所述重组rna复制子或其组合物静脉内地、鼻内地、作为吸入剂施用，或直接注射进肿瘤中。在某些实施方案中，将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物重复施用给所述受试者。在某些实施方案中，所述受试者是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、马、非人灵长类动物或人。
[0053]
在某些实施方案中，所述癌症选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌(例如，阉割抗性的神经内分泌前列腺癌)、睾丸癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、甲状腺癌、恶性神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、b-细胞慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)、肉瘤、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤、膀胱癌、边缘区淋巴瘤(mzl)、梅克尔细胞癌和肾细胞癌。在某些实施方案中，所述肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌；所述肝癌是肝细胞癌(hcc)；和/或所述前列腺癌是治疗引发的神经内分泌前列腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是神经内分泌癌。
[0054]
本公开内容提供了针对疾病免疫受试者的方法，其包含给所述受试者施用有效量的本公开内容的颗粒、载体、重组rna复制子或组合物。在某些实施方案中，将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物静脉内地、肌肉内地、真皮内地、鼻内地或作为吸入剂施用。在某些实施方案中，将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物重复施用给所述受试者。在某些实施方案中，所述疾病是传染性疾病。在某些实施方案中，所述传染性疾病由病原体之一造成，所述病原体包含登革热病毒、切昆贡亚病毒、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒、sars-cov-2、冠状病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、甲型流感病毒、流感b病毒和兽医病毒。
[0055]
本公开内容提供了包含小核糖核酸病毒基因组和异源多核苷酸的重组rna复制子。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在2a编码区和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在5’utr和2a编码区之间。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在3d编码区和3’utr之间。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。
附图说明
[0056]
图1是描绘野生型svv病毒基因组和一种示例性的svv衍生出的重组rna复制子的示意图。
[0057]
图2的一系列图显示了包含各种长度的异源多核苷酸的svv的病毒复制率。
[0058]
图3a是描绘具有mcherry报道基因的各种svv衍生出的重组rna复制子构建体的示意图。图3b的一系列成像图显示了用复制子转染的h1299细胞中mcherry的表达。
[0059]
图4a的一系列成像图显示了用复制子trunc5和/或野生型svv病毒基因组转染的h1299细胞中mcherry的表达。图4b所含的图显示了用于评价病毒滴度的h446细胞中的ic50测定的结果。
[0060]
图5a是描绘具有mcherry报道基因的各种svv衍生出的重组rna复制子构建体的示意图。图5b是显示体外t7 rna合成的结果的凝胶图像。图5c的一系列成像图显示了用每种复制子转染的细胞的mcherry信号。
[0061]
图6a是描绘野生型svv病毒基因组和携带mcherry报道基因的svv衍生出的重组rna复制子示意图。图6b是描绘携带不同报道基因的svv衍生出t的重组rna复制子runc10的示意图。
[0062]
图7a是描绘携带编码鼠il-2有效负载的转基因的svv-复制子trunc10的示意图。图7b所含的两幅图显示了mil-2表达的结果。图7c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0063]
图8a是描绘svv-复制子trunc10的示意图，其携带编码单链mil-12(scmil-12)的转基因，具有和没有信号序列。图8b的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。图8c所含的两幅图显示了鼠il-12的表达。
[0064]
图9a是描绘svv-复制子trunc10的示意图，其携带编码人il-36γ的转基因，具有天然信号序列或具有il2信号序列。图9b所含的两幅图显示了转染或转衣壳化以后hil-36γ的分泌。图9c所含的两幅图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0065]
图10a是描绘在单个有效负载下游掺入脑心肌炎病毒(emcv)ires的双顺反子复制子的示意图。图10b的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0066]
图11a是描绘在多个有效负载下游掺入脑心肌炎病毒(emcv)ires的双顺反子双重有效负载复制子的示意图，在第一有效负载和第二有效负载(egfp)之间被弗林蛋白酶-t2a位点隔开。图11b的一系列图像显示了在感染后24小时mcherry和gfp的表达。
[0067]
图12a是描绘双重有效负载复制子示意图，所述复制子在rdrp和3’utr之间在复制子的3’末端掺入第二有效负载。图12b的图显示了转染以后hil-36γ的分泌。图12c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0068]
图13a是分析his-标记的1dlt176-mtt10-dll3-vhh-cd3 lite的表达的抗-his蛋白质印迹。图13b的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0069]
图14a是分析his-标记的rdll3-αcd3-bite的表达的抗-his蛋白质印迹。图14b的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0070]
图15a是描绘trunc10复制子的示意图，所述复制子包含在his-标记的抗mfap bite和cxcl10之间的替代切割肽(3c,或弗林蛋白酶-3c,或弗林蛋白酶t2a)。图15b的图显示了cxcl10的表达的结果。图15c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0071]
图16a是描绘trunc10复制子的示意图，所述复制子包含在his-标记的抗-mfap bite和cxcl10之间的替代切割肽(t2a、p2a、f2a或e2a)。图16b的图显示了cxcl10的表达的结果。图16c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0072]
图17a是描绘复制子多核苷酸的构型的示意图，所述复制子多核苷酸编码通过igsf1多肽可操作地连接的双重有效负载分子(seq id no:75和76)。图17b的图显示了il-36γ的表达的结果。图17c的图显示了il-2的表达的结果。图17d的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0073]
图18a是描绘相同开放读码框中两个分泌型有效负载的hiv-1蛋白酶介导的加工的示意图的示意图。图18b的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。图18c所含的两幅图显示了两个有效负载的表达的结果。
[0074]
图19a是描绘包含bite和hil-36γ的双重有效负载复制子的示意图。图19b的图显示了hil-36γ的表达。图19c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0075]
图20a是描绘三重有效负载复制子t10-bite-il3g6-il2的示意图。图20b所含的两幅图显示了hil-36和mil-2的表达。图20c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0076]
图21a是描绘三重有效负载复制子t10-mil2-bite-hil-36γ的替代设计的示意图。图21b所含的两幅图显示了hil-36和mil-2的表达。图21c的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。
[0077]
图22a是描绘三重有效负载复制子t10-mil2-hil-36γ-bite的另一种设计的示意图。图22b的图显示了通过taqman测定分析的rna拷贝数的结果。图22c的一系列图显示了上清液和裂解物中hil-36和mil-2的表达。
[0078]
图23a的图显示了基于nci-h69细胞的小鼠模型中体内hil-36γ表达的结果。图23b的图显示了基于nci-h446细胞的小鼠模型中体内hil-36γ表达的结果。
[0079]
图24是描绘野生型柯萨奇病毒病毒基因组和一种示例性的柯萨奇病毒衍生出的携带mcherry报道基因的重组rna复制子的示意图。
[0080]
图25a的一系列图像显示了用复制子和/或对照载体转染的细胞中的mcherry和gfp表达。图25b所含的两个图像显示了mcherry的表达，其证实了在与野生型病毒基因组一起的共转染中复制子的转衣壳化。
[0081]
图26的简图描绘了svv衍生出的复制子和neg-rna的体外转录过程。5’和3’核酶(rib)对svv衍生出的复制子的自动催化切割产生了svv衍生出的复制子，其具有复制所需的单独5’和3’末端。相反，neg-rna构建体缺乏核酶序列且不能复制和病毒粒子产生。
[0082]
图27的简图描绘了为了维持复制子的天然5’和3’单独末端使用连接切割序列从基因组转录物除去非病毒rna多核苷酸。
[0083]
图28a-28b的示意图显示了用于产生单独5’末端的锤头核酶。图28a的示意图显示了在箭头处在5’末端退火和切割的最小锤头核酶(hhr)的结构模型(seq id no:108)。图28b的示意图显示了在箭头处切割5’末端的具有稳定化茎i(stbl)的核酶的结构模型(seq id no:109)。
[0084]
图29a-29b的示意图显示了用于产生单独5’末端的手枪核酶。图29a的示意图显示了野生型手枪核酶(seq id no:110,111)特征。图29b的示意图显示了来自多粘类芽孢杆菌(p.polymyxa)的手枪核酶(seq id no:112)，其具有加入的四环以融合通过mfold建模的p3链。虚线框是为了在病毒序列的背景下保持核酶的折叠而诱变处理的区域。在虚线框中显示的“guc”序列被突变为“uca”以产生手枪1，且“guc”序列被突变为“tta”以产生手枪2。
具体实施方式
[0085]
溶瘤病毒是具有能够感染和裂解肿瘤细胞的裂解生命周期的有复制能力的病毒。直接的肿瘤细胞裂解不仅导致细胞死亡，而且产生针对由局部抗原呈递细胞摄取和呈递的肿瘤抗原的适应性免疫应答。因此，溶瘤病毒通过直接细胞裂解和通过促进能够在病毒清除后维持抗肿瘤应答的抗原特异性适应性应答来对抗肿瘤细胞生长。
[0086]
可以将溶瘤病毒基因工程改造以表达有效负载分子-例如，通过将编码合乎需要的有效负载蛋白的异源多核苷酸掺入病毒基因组中。但是，由于病毒衣壳蛋白的包装能力，只有有限长度的多核苷酸可以整合到完整病毒基因组中而不会损害病毒的复制率、衣壳化和/或功能。此外，从单个合成的病毒基因组或病毒复制子表达多种功能性有效负载分子可能具有挑战性。有效负载分子掺入的这些限制限制了病毒治疗剂在转移性癌症的治疗中的使用。
[0087]
本领域需要溶瘤病毒衍生出的复制子，其包含改进的掺入编码有效负载分子的异源多核苷酸的能力，其可以用于各种治疗剂诸如抗癌治疗剂中。异源序列可以编码一个或多个在本文中称为有效负载分子的分子。在某些实施方案中，本公开内容的有效负载序列
和有效负载分子不介导病毒功能。在某些实施方案中，本公开内容的有效负载序列和有效负载分子可以分离自或衍生自特定物种，所述特定物种与意图施用病毒复制以表达有效负载序列或有效负载分子的受试者或细胞的物种匹配或同源。异源序列可以编码以下中的一种或多种：编码或非编码核酸序列、dna序列、rna序列、氨基酸序列、肽、多肽、蛋白或它们的任意组合。
[0088]
本公开内容提供了衍生自小核糖核酸病毒基因组的重组rna复制子，其具有改进的掺入编码有效负载分子的异源多核苷酸的能力。在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子表达来自相同复制子的两个或更多个功能性有效负载分子。描述了表达两个或更多个有效负载分子的复制子的示例性构型。本公开内容进一步提供了包含重组rna复制子的颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒进一步包含完整病毒基因组。在某些实施方案中，所述重组rna复制子可以被完整病毒基因组表达的衣壳蛋白转衣壳化。在某些实施方案中，使细胞与所述颗粒接触允许产生两组感染性病毒颗粒，一组包含重组rna复制子，且另一组包含完整病毒基因组。在某些实施方案中，两组的病毒颗粒可以一起感染细胞，这允许在体内或在体外连续产生两组的病毒颗粒。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗和预防增殖性疾病和障碍(例如，癌症)的重组rna复制子和使用方法。本公开内容能够全身性递送适用于治疗广泛的增殖性障碍(例如，癌症)的有效重组rna复制子。
[0089]
在本文中使用的章节标题仅仅用于组织目的，不应解释为限制描述的主题。本文引用的所有文件或文件的部分，包括、但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，出于任何目的特此明确地通过引用整体并入。在一个或多个并入的文件或文件的部分定义了与本技术中该术语的定义相矛盾的术语的情况下，以出现在本技术中的定义为准。但是，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及并不且不应被视为承认或任何形式的暗示：它们在世界上的任何国家构成有效的现有技术或形成普通一般知识的一部分。
[0090]
重组rna复制子
[0091]
小核糖核酸病毒基因组遵循保守的4-3-4格式，其中单个多蛋白被病毒编码的蛋白酶切割成5'前导蛋白(仅存在于某些物种中)、四种结构蛋白和七种(3 4)非结构蛋白。小核糖核酸病毒基因组以5'非翻译区(utr)开始，并包括内部核糖体进入位点(ires)。与ires相邻，5'前导蛋白是一种蛋白酶，其位于翻译的小核糖核酸病毒多蛋白的5'末端，尽管它并不存在于小核糖核酸病毒科的所有成员中。这之后是多蛋白的p1区域，分别按顺序编码衣壳蛋白vp4、vp2、vp3和vp1。这些蛋白分别由vp4编码区、vp2编码区、vp3编码区和vp1编码区编码(这四个编码区统称为“vp编码区”)。翻译的多蛋白的p2区域由2a、2b和2c组成。小核糖核酸病毒2a是这样的蛋白：其在小核糖核酸病毒基因组中可以不存在，或者在某些情况下以超过一个拷贝存在。小核糖核酸病毒多蛋白的最后一段是p3，包含3a、3b、3c和3d。3b(也被称作vpg)是一种与基因组的5
′
末端结合并在基因组复制中起重要作用的小蛋白。由3c编码的蛋白酶执行小核糖核酸病毒多蛋白的大部分切割以及抑制宿主转录。最后一种小核糖核酸病毒蛋白是3d，即rna依赖性的rna聚合酶(rdrp)。小核糖核酸病毒的3
′
utr通常具有聚腺苷酸尾巴。
[0092]
本公开内容提供了包含小核糖核酸病毒基因组的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒基因组包含在一个或多个编码区中的缺失和/或截短。在某些实施方案中，所述
编码区编码结构蛋白(vp4、vp2、vp3和vp1)。在某些实施方案中，所述复制子的小核糖核酸病毒基因组包含所有vp编码区的缺失。在某些实施方案中，所述复制子的小核糖核酸病毒基因组包含vp1、vp3和vp2编码区中的每一个的缺失和/或截短。在某些实施方案中，所述复制子的小核糖核酸病毒基因组包含vp1和vp3编码区的缺失和vp2编码区的截短。在某些实施方案中，在小核糖核酸病毒基因组的vp编码区内的缺失和截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp。在某些实施方案中，在小核糖核酸病毒基因组的vp编码区内的总缺失和截短是至少2000bp。
[0093]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含一个或多个异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入所述缺失或截短的位点中。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在2a编码区和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸插入在3d(rdrp)编码区和3’非翻译区(utr)之间。在某些实施方案中，所述一个或多个异源多核苷酸包含至少1000bp、至少2000bp或至少3000bp。
[0094]
在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组选自塞内卡病毒基因组、心病毒基因组、肠道病毒基因组和口蹄疫病毒基因组。在某些实施方案中，所述病毒基因组衍生自小核糖核酸病毒，其选自心病毒、cosavirus、肠道病毒、嗜肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、rosavirus、salivirus、pasivirus、塞内卡病毒及其嵌合病毒基因组。在某些实施方案中，所述病毒基因组衍生自小核糖核酸病毒，其选自人鼻病毒、hrv(seq id no:5；genbank登记号k02121.1)、脊髓灰质炎病毒、pv(seq id no:6；genbank登记号af111984.2)、柯萨奇病毒a、cva(seq id no:7；genbank登记号af546702.1)、牛肠道病毒、bev(seq id no:8；genbank登记号nc_001859.1)、肠道病毒71、ev71(seq id no:9；genbank登记号kj686308.1)、埃可病毒、echo(seq id no:10；genbank登记号af029859.2)、口蹄疫病毒、fmdv(seq id no:11；genbank登记号dq989323.1)、塞内卡谷病毒、svv(seq id no:12；genbank登记号nc_011349.1)、theiler氏鼠脑脊髓炎病毒、tmev(seq id no:13；genbank登记号m20301.1)、门戈病毒、mev(seq id no:14；genbank登记号l22089.1)、脑心肌炎、emcv(seq id no:15；genbank登记号x74312.1)-每种病毒的ncbi genbank登记号在括号中指出。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组是塞内卡谷病毒基因组。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组是柯萨奇病毒基因组。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组是脑心肌炎病毒基因组。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒基因组是脊髓灰质炎病毒基因组(包括嵌合脊髓灰质炎病毒诸如pvs-ripo)。
[0095]
在某些实施方案中，本文所述的重组rna复制子包含嵌合小核糖核酸病毒基因组(例如，这样的病毒基因组，其包含一个衍生自第一种小核糖核酸病毒的部分，诸如衣壳蛋白或ires，和另一个衍生自第二种小核糖核酸病毒的部分，诸如非结构蛋白酶或聚合酶编码区)。
[0096]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子保留正链和/或负链rna合成的能力。在某些实施方案中，所述重组rna复制子的正链和/或负链rna合成率为对应的野生型病毒基因组的合成率的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
[0097]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子保留与野生型病毒基因组相当的病毒复制率。在某些实施方案中，所述重组rna复制子的病毒复制率为对应的野生型病毒基因组的
病毒复制率的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
[0098]
在某些实施方案中，将所述重组rna复制子提供为重组核糖核酸(rna)。在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含一个或多个核酸类似物。核酸类似物的例子包括2
’‑
o-甲基-取代的rna、2
’‑
o-甲氧基-乙基碱基、2’氟碱基、锁核酸(lnas)、未锁核酸(una)、桥连核酸(bna)、吗啉代和肽核酸(pna)。在某些实施方案中，所述重组rna复制子是环状rna分子(circrna)或单链rna(ssrna)。在某些实施方案中，所述单链rna是有义或负义链。
[0099]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子是环状rna分子(circrna)。circrna分子缺乏外切核酸酶介导的降解所必需的游离末端，因此延长了rna分子的半衰期，并随着时间的推移实现更稳定的蛋白生产。为了从circrna分子产生功能性rna复制子，有必要一旦进入细胞内就“打开”环状构建体，使得可以产生具有适当3’和5’天然末端的线性rna复制子。因此，在某些实施方案中，将所述重组rna复制子提供为circrna分子并且进一步包含一个或多个额外的rna序列，所述rna序列有助于细胞内circrna分子的线性化。这样的额外的rna序列的例子包括sirna靶位点、mirna靶位点和指导rna靶位点。对应的sirna、mirna或grna可以与circrna分子共同配制。可替换地，可以基于同源mirna在靶细胞中的表达来选择mirna靶位点，使得circrna分子的切割和复制子的复制限于表达特定mirna的靶细胞。
[0100]
重组svv复制子
[0101]
本公开内容提供了包含塞内卡谷病毒(svv)病毒基因组的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含在一个或多个svv蛋白编码区中的缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含异源多核苷酸。
[0102]
在某些实施方案中，所述svv基因组选自野生型svv基因组(诸如svv-a,seq id no:1)或突变体svv基因组(诸如svv-ir2,seq id no:2)。在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子包含嵌合svv基因组。
[0103]
对于svv病毒基因组，所述vp4编码区包括根据seq id no:1的核苷酸904至核苷酸1116。所述vp2编码区包括根据seq id no:1的核苷酸1117至核苷酸1968。所述vp3编码区包括根据seq id no:1的核苷酸1969至核苷酸2685。所述vp1编码区包括根据seq id no:1的核苷酸2686至核苷酸3477。所述2a编码区包括根据seq id no:1的核苷酸3478至核苷酸3504。所述2b编码区包括根据seq id no:1的核苷酸3505至核苷酸3888。
[0104]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在一个或多个vp编码区中的缺失和/或截短。在某些实施方案中，将本文所述的复制子与合成的病毒基因组联合施用给受试者。不希望受任何特定理论约束，有人认为，删除和/或截短复制子中的vp编码区将：1)便利比病毒本身更大的有效负载盒的容纳，和/或2)使复制子自身不能在细胞之间传播。
[0105]
在某些实施方案中，vp4、vp2、vp3和vp1编码区中的一个或至少一个被删除和/或截短。在某些实施方案中，包含vp4、vp2、vp3和vp1的vp编码区中的两个或至少两个被删除和/或截短。在某些实施方案中，包含vp2、vp3和vp1的vp编码区中的两个或至少两个被删除和/或截短。在某些实施方案中，包含vp4、vp2、vp3和vp1的vp编码区中的三个或至少三个被删除和/或截短。在某些实施方案中，所有的vp4、vp2、vp3和vp1编码区被删除和/或截短。在某些实施方案中，所述vp2编码区被截短且vp3编码区和vp1编码区中的一个被删除或截短。在某些实施方案中，所述vp2编码区被截短且vp3和vp1编码区都被删除和/或截短。在某些
实施方案中，所述复制子的svv基因组包含vp1、vp3和vp2编码区中的每一个的缺失和/或截短。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含vp1和vp3编码区的缺失和vp2编码区的截短。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含遵循以下表1中列出的模式之一的在vp2-vp3-vp1区域中的一个或多个缺失或截短。
[0106]
表1.在svv基因组的vp2-vp3-vp1区域中的缺失或截短的模式
[0107]
模式**\编码区vp2vp3vp11tnn2tnt3tnd4ttn5ttt6ttd7tdn8tdt9tdd10nnn11nnt12nnd13ntn14ntt15ntd16ndn17ndt18ndd
[0108]
**“d”指示缺失；“t”指示截短；“n”指示无截短或缺失。
[0109]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1和图1的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含与根据seq id no:1的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的svv基因组区域的缺失。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1407至核苷酸3477对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1599至核苷酸3477对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1683至核苷酸3477对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1924至核苷酸3477对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸2467至核苷酸3477对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1261至核苷酸3300对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1261至核苷酸3000对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施
方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1261至核苷酸2700对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1261至核苷酸2400对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:1的核苷酸1261至核苷酸2100对应的区域内的一个或多个缺失或截短。所有范围都包括端点。
[0110]
在某些实施方案中，每个缺失或截短包含1个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含10个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含50个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含100个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含500个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含1000个或更多个核苷酸。
[0111]
在某些实施方案中，所述一个或多个缺失或截短包含共计至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp、至少2000bp、至少2100bp或至少2200bp的核苷酸。在某些实施方案中，所述一个或多个缺失或截短由共计500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp、2400bp(或之间的任何值)的核苷酸组成。在某些实施方案中，所述一个或多个缺失或截短由共计500-2400bp之间、500-2300bp之间、500-2200bp之间、500-2000bp之间、500-1500bp之间、500-1000bp之间、1000-2300bp之间、1000-2200bp之间、1000-2000bp之间、1000-1500bp之间、1500-2300bp之间、1500-2200bp之间、1500-2000bp之间、2000-2300bp或2000-2200bp之间的核苷酸组成。所有范围都包括端点。
[0112]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含5’utr。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含5’前导蛋白编码序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含非截短的vp4编码区。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含vp2编码区或其截短体。
[0113]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组从5’至3’包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体。在某些实施方案中，包含5’utr、5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体的复制子的svv基因组的部分与seq id no:1或seq id no:2的核苷酸1至1260具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。在某些实施方案中，包含5’utr、5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体的复制子的svv基因组的部分与seq id no:1或seq id no:2的核苷酸1至1260具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或100％序列同一性。在某些实施方案中，包含5’utr、5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体的复制子的svv基因组的部分具有根据seq id no:1或seq id no:2的核苷酸1至1260的至多1个、至多5个、至多10个或至多20个核苷酸突变。
[0114]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含vp2编码区的5’部分。在某些实施方案中，所述内源性vp2编码区的5’部分是至少50bp、至少60bp、至少70bp、至少80bp、至少90bp、至少100bp、至少110bp、至少120bp、至少130bp、至少140bp或至少145bp的长度。在
某些实施方案中，所述内源性vp2编码区的5’部分包含约50bp、约60bp、约70bp、约80bp、约90bp、约100bp、约110bp、约120bp、约130bp、约140bp、约145bp、或之间的任何值。在某些实施方案中，所述内源性vp2编码区的5’部分是小于50bp、小于60bp、小于70bp、小于80bp、小于90bp、小于100bp、小于110bp、小于120bp、小于130bp、小于140bp或小于145bp的长度。所有范围都包括端点。
[0115]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含顺式作用复制元件(cre)。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组的vp2编码区或其截短体包含cre。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组中包含vp4编码区和vp2编码区或其截短体的区域包含cre。
[0116]
在某些实施方案中，所述cre包含约10bp、约20bp、约30bp、约40bp、约50bp、约60bp、约70bp、约80bp、约90bp、约100bp、约110bp、约120bp、约130bp、约140bp、约150bp、约160bp、约170bp、约180bp、约190bp、约200bp(或之间的任何值)的核苷酸。在某些实施方案中，所述cre包含至少10bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少60bp、至少70bp、至少80bp、至少90bp、至少100bp、至少110bp、至少120bp、至少130bp、至少140bp、至少150bp、至少160bp、至少170bp、至少180bp、至少190bp或至少200bp的核苷酸。在某些实施方案中，所述cre包含10-200bp之间、10-150bp之间、10-100bp之间、10-75bp之间、10-60bp之间、10-50bp之间、20-200bp之间、20-150bp之间、20-100bp之间、20-75bp之间、20-60bp之间、20-50bp之间、30-200bp之间、30-150bp之间、30-100bp之间、30-75bp之间、30-60bp之间、30-50bp之间、40-200bp之间、40-150bp之间、40-100bp之间、40-75bp之间、40-60bp之间、40-50bp之间、50-200bp之间、50-150bp之间、50-100bp之间、50-75bp之间或50-60bp之间的核苷酸。所有范围都包括端点。
[0117]
在某些实施方案中，所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260、核苷酸1050至核苷酸1260、核苷酸1100至核苷酸1260、核苷酸1150至核苷酸1260、核苷酸1200至核苷酸1260、核苷酸1000至核苷酸1250、核苷酸1050至核苷酸1250、核苷酸1100至核苷酸1250、核苷酸1150至核苷酸1250、核苷酸1200至核苷酸1250、核苷酸1000至核苷酸1200、核苷酸1050至核苷酸1200、核苷酸1100至核苷酸1200、核苷酸1150至核苷酸1200、核苷酸1000至核苷酸1150、核苷酸1050至核苷酸1150、核苷酸1100至核苷酸1150、核苷酸1000至核苷酸1100或核苷酸1050至核苷酸1100对应的区域内的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述cre位于与根据seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260、核苷酸1050至核苷酸1260、核苷酸1100至核苷酸1260、核苷酸1150至核苷酸1260、核苷酸1200至核苷酸1260、核苷酸1000至核苷酸1250、核苷酸1050至核苷酸1250、核苷酸1100至核苷酸1250、核苷酸1150至核苷酸1250、核苷酸1200至核苷酸1250、核苷酸1000至核苷酸1200、核苷酸1050至核苷酸1200、核苷酸1100至核苷酸1200、核苷酸1150至核苷酸1200、核苷酸1000至核苷酸1150、核苷酸1050至核苷酸1150、核苷酸1100至核苷酸1150、核苷酸1000至核苷酸1100或核苷酸1050至核苷酸1100对应的区域内。所有范围都包括端点。
[0118]
在某些实施方案中，所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260、核苷酸1050至核苷酸1260、核苷酸1100至核苷酸1260、核苷酸1150至核苷酸1260、核苷酸1200至核苷酸1260、核苷酸1000至核苷酸1250、核苷酸1050至核
苷酸1250、核苷酸1100至核苷酸1250、核苷酸1150至核苷酸1250、核苷酸1200至核苷酸1250、核苷酸1000至核苷酸1200、核苷酸1050至核苷酸1200、核苷酸1100至核苷酸1200、核苷酸1150至核苷酸1200、核苷酸1000至核苷酸1150、核苷酸1050至核苷酸1150、核苷酸1100至核苷酸1150、核苷酸1000至核苷酸1100或核苷酸1050至核苷酸1100对应的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与对应于seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260、核苷酸1050至核苷酸1260、核苷酸1100至核苷酸1260、核苷酸1150至核苷酸1260、核苷酸1200至核苷酸1260、核苷酸1000至核苷酸1250、核苷酸1050至核苷酸1250、核苷酸1100至核苷酸1250、核苷酸1150至核苷酸1250、核苷酸1200至核苷酸1250、核苷酸1000至核苷酸1200、核苷酸1050至核苷酸1200、核苷酸1100至核苷酸1200、核苷酸1150至核苷酸1200、核苷酸1000至核苷酸1150、核苷酸1050至核苷酸1150、核苷酸1100至核苷酸1150、核苷酸1000至核苷酸1100或核苷酸1050至核苷酸1100的多核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。所有范围都包括端点。
[0119]
在某些实施方案中，所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1117至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。该cre区域的多核苷酸序列由seq id no:149表示。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的10个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的20个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的30个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的40个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的50个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的60个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的70个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的80个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的90个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实
施方案中，所述cre包含与seq id no:149的100个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的110个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的120个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的130个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述cre包含与seq id no:149的140个连续核苷酸区段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。
[0120]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少500bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少600bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少700bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少800bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少900bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截
短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1000bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1100bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1200bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1300bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1400bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1500bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1600bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1700bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少
1800bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少1900bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少2000bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少2100bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含在与根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至核苷酸3477(包括端点)对应的区域内所述svv基因组的一个或多个缺失或截短，其中所述一个或多个缺失或截短包含共计至少2200bp，且其中所述复制子的svv基因组包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的cre多核苷酸序列。
[0121]
在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区中的一个或多个。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组包含2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。在某些实施方案中，所述复制子的svv基因组从5’至3’包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。在某些实施方案中，包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区的复制子的svv基因组的部分与根据seq id no:1的核苷酸3505至7310具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
[0122]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子从5’至3’包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区、vp2编码区或其截短体和异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述复制子从5’至3’包含异源多核苷酸和2b编码区。在某些实施方案中，所述重组rna复制子从5’至3’包含异源多核苷酸、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)。
[0123]
在某些实施方案中，所述svv基因组包含2a编码区。在某些实施方案中，所述2a编码区位于vp2编码区或其截短体和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述2a编码区位于异源多核苷酸和2b编码区之间。
[0124]
在某些实施方案中，所述svv衍生出的复制子包含一个或多个异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述复制子的异源多核苷酸包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp。在某些实施方案中，所述一个或多个异源多核苷酸包含共计至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp。
[0125]
在某些实施方案中，所述svv衍生出的复制子包含与seq id no:20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58和60中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的序列。
[0126]
在某些实施方案中，所述svv衍生出的复制子包含svv基因组和异源多核苷酸；其中所述svv基因组包含根据seq id no:1的编号在核苷酸1261和3477(包括端点)之间的缺失，其中所述缺失是至少500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp或2400bp总长度；其中所述svv基因组包含cre，所述cre包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的多核苷酸序列。
[0127]
在某些实施方案中，所述svv衍生出的复制子包含svv基因组和异源多核苷酸；其中所述svv基因组包含根据seq id no:1的编号在核苷酸1261和3477(包括端点)之间的缺失，其中所述缺失是至少500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp或2400bp总长度；其中所述svv基因组包含cre，所述cre包含与seq id no:149具有至少90％同一性的多核苷酸序列。
[0128]
在某些实施方案中，所述svv衍生出的复制子包含svv基因组和异源多核苷酸；其中所述svv基因组包含根据seq id no:1的编号在核苷酸1261和3477(包括端点)之间的缺失，其中所述缺失是至少500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp或2400bp总长度；其中所述svv基因组包含与根据seq id no:1的核苷酸1至1260具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的多核苷酸序列；其中所述svv基因组包含与根据seq id no:1的核苷酸3505至7310具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的多核苷酸序列；且其中所述svv基因组包含cre，所述cre包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的多核苷酸序列。
[0129]
在某些实施方案中，所述svv衍生出的复制子包含svv基因组和异源多核苷酸；其中所述svv基因组包含根据seq id no:1的编号在核苷酸1261和3477(包括端点)之间的缺失，其中所述缺失是至少500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp或2400bp总长度；其中所述svv基因组包含与根据seq id no:1的核苷酸1至1260具有至少90％同一性的多核苷酸序列；其中所述svv基因组包含与根据seq id no:1的核苷酸3505至
7310具有至少90％同一性的多核苷酸序列；且其中所述svv基因组包含cre，所述cre包含与seq id no:149具有至少90％同一性的多核苷酸序列。
[0130]
重组柯萨奇病毒复制子
[0131]
本公开内容提供了包含柯萨奇病毒病毒基因组的重组rna复制子，其中所述柯萨奇病毒基因组包含在一个或多个柯萨奇病毒蛋白编码区中的缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含异源多核苷酸。
[0132]
在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒选自cvb3、cva21和cva9。示例性的柯萨奇病毒的核酸序列提供为genbank参考编号m33854.1(cvb3；seq id no:16),genbank参考编号kt161266.1(cva21；seq id no:17),和genbank参考编号d00627.1(cva9；seq id no:18)。在某些实施方案中，本文所述的重组rna复制子编码嵌合柯萨奇病毒。
[0133]
对于柯萨奇病毒病毒基因组，所述vp4编码区包括根据seq id no:3的核苷酸714至核苷酸920。所述vp2编码区包括根据seq id no:3的核苷酸921至核苷酸1736。所述vp3编码区包括根据seq id no:3的核苷酸1737至核苷酸2456。所述vp1编码区包括根据seq id no:3的核苷酸2457至核苷酸3350。所述2a编码区包括根据seq id no:3的核苷酸3351至核苷酸3797。所述2b编码区包括根据seq id no:3的核苷酸3798至核苷酸4088。
[0134]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含柯萨奇病毒基因组，其包含seq id no:4的5’utr序列。在这样的实施方案中，与其它先前描述的5’utr序列相比，seq id no:4的5’utr序列出乎意料地增加功能性柯萨奇病毒的产生。在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含根据seq id no:3的序列的经修饰的cva21柯萨奇病毒基因组。
[0135]
在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含在一个或多个vp编码区中的缺失和/或截短。在某些实施方案中，vp4、vp2、vp3和vp1编码区中的一个或至少一个被删除和/或截短。在某些实施方案中，包含vp4、vp2、vp3和vp1的vp编码区中的两个或至少两个被删除和/或截短。在某些实施方案中，包含vp4、vp2、vp3和vp1的vp编码区中的三个或至少三个被删除和/或截短。在某些实施方案中，所有的vp4、vp2、vp3和vp1编码区被删除和/或截短。
[0136]
在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含在与根据seq id no:3的核苷酸714至核苷酸3350(包括端点)对应的区域内柯萨奇病毒基因组的一个或多个缺失或截短、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含与根据seq id no:3的核苷酸714至核苷酸3350(包括端点)对应的柯萨奇病毒基因组区域的缺失。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:3的核苷酸1000至核苷酸3350对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:3的核苷酸714至核苷酸3350、核苷酸1000至核苷酸3350、核苷酸1500至核苷酸3350、核苷酸2000至核苷酸3350、核苷酸2500至核苷酸3350、核苷酸714至核苷酸3000、核苷酸1000至核苷酸3000、核苷酸1500至核苷酸3000、核苷酸2000至核苷酸3000、核苷酸2500至核苷酸3000、核苷酸714至核苷酸2500、核苷酸1000至核苷酸2500、核苷酸1500至核苷酸2500、核苷酸2000至核苷酸2500、核苷酸714至核苷酸2000、核苷酸1000至核苷酸2000、核苷酸1500至核苷酸2000、核苷酸714至核苷酸1500或核苷酸1000至核苷酸1500(包括端点)对应的区域内的一个或多个缺失或截短。所有范围都包括端点。
[0137]
在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含在与根据seq id no:3
的核苷酸717至核苷酸3332(包括端点)对应的区域内柯萨奇病毒基因组的一个或多个缺失或截短、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含与根据seq id no:3的核苷酸717至核苷酸3332(包括端点)对应的柯萨奇病毒基因组区域的缺失。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:3的核苷酸1000至核苷酸3332对应的区域内的一个或多个缺失或截短。在某些实施方案中，所述复制子包含在与根据seq id no:3的核苷酸717至核苷酸3332、核苷酸1000至核苷酸3332、核苷酸1500至核苷酸3332、核苷酸2000至核苷酸3332、核苷酸2500至核苷酸3332、核苷酸717至核苷酸3000、核苷酸1000至核苷酸3000、核苷酸1500至核苷酸3000、核苷酸2000至核苷酸3000、核苷酸2500至核苷酸3000、核苷酸717至核苷酸2500、核苷酸1000至核苷酸2500、核苷酸1500至核苷酸2500、核苷酸2000至核苷酸2500、核苷酸717至核苷酸2000、核苷酸1000至核苷酸2000、核苷酸1500至核苷酸2000、核苷酸717至核苷酸1500或核苷酸1000至核苷酸1500(包括端点)对应的区域内的一个或多个缺失或截短。所有范围都包括端点。
[0138]
在某些实施方案中，每个缺失或截短包含1个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含10个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含50个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含100个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含500个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，每个缺失或截短包含1000个或更多个核苷酸。所有范围都包括端点。
[0139]
在某些实施方案中，所述一个或多个缺失或截短包含共计至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp、至少900bp、至少1000bp、至少1100bp、至少1200bp、至少1300bp、至少1400bp、至少1500bp、至少1600bp、至少1700bp、至少1800bp、至少1900bp、至少2000bp、至少2100bp、至少2200bp、至少2300bp、至少2400bp、至少2500bp、至少2600bp、至少2615bp、至少2636bp、至少2650bp或至少2700bp的核苷酸。在某些实施方案中，所述一个或多个缺失或截短由共计500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp、1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、2000bp、2100bp、2200bp、2300bp、2400bp、2500bp、2600bp、2700bp(或之间的任何值)的核苷酸组成。在某些实施方案中，所述一个或多个缺失或截短由共计500-2700bp之间、500-2600bp之间、500-2300bp之间、500-2000bp之间、500-1500bp之间、500-1000bp之间、1000-2700bp之间、1000-2600bp之间、1000-2300bp之间、1000-2000bp之间、1000-1500bp之间、1500-2700bp之间、1500-2600bp之间、1500-2300bp之间、1500-2200bp之间、1500-2000bp之间、2000-2700bp之间、2000-2600bp之间、2000-2300bp之间或2000-2200bp之间的核苷酸组成。所有范围都包括端点。
[0140]
在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含5’utr。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组的包含5’utr的部分与seq id no:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组的包含5’utr的部分与seq id no:4具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或100％序列同一性。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组的包含5’utr的部分具有根据seq id no:4的至多1个、至多5个、至多10个或至多20个核苷酸突变。
[0141]
在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含2b编码区、2c编码区、3a
编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr中的一个或多个。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组从5’至3’方向包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒基因组的包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr的部分与根据seq id no:3的核苷酸3797至7435具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
[0142]
在某些实施方案中，所述复制子从5’至3’包含5’utr和异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述复制子从5’至3’包含异源多核苷酸和2b编码区。在某些实施方案中，所述重组rna复制子从5’至3’包含异源多核苷酸、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。
[0143]
在某些实施方案中，所述复制子进一步包含2a编码区。在某些实施方案中，所述2a编码区位于5’utr和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述2a编码区位于异源多核苷酸和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述复制子从5’至3’包含5’utr、异源多核苷酸和2a编码区。在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组从5’至3’方向包含异源多核苷酸、2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。
[0144]
在某些实施方案中，所述复制子的柯萨奇病毒基因组从5’至3’方向包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。在某些实施方案中，包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr的柯萨奇病毒基因组的部分与根据seq id no:3的核苷酸3492至7435具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性。
[0145]
在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒衍生出的复制子包含一个或多个异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述复制子的异源多核苷酸具有至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp的长度。在某些实施方案中，所述一个或多个异源多核苷酸具有至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp的总长度。所有范围都包括端点。
[0146]
在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒衍生出的复制子包含与seq id no:62具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％序列同一性的序列。
[0147]
异源多核苷酸和有效负载分子
[0148]
在某些实施方案中，所述复制子包含编码一个或多个有效负载分子的异源多核苷酸。
[0149]
在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入在所述复制子的病毒基因组的2a编码区和2b编码区之间的病毒基因组位置。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入在所述复制子的病毒基因组的2a编码区上游的病毒基因组位置。在某些实施方案中，所述异源核苷酸
插入在3d(rdrp)或3d pol编码区下游的病毒基因组位置。
[0150]
在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入包含svv病毒基因组的复制子中。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入与seq id no:1的核苷酸1117至3479对应的病毒基因组的区域。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入与seq id no:1的核苷酸3504至3505对应的病毒基因组的区域。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入与seq id no:1的核苷酸7209至7210对应的病毒基因组的区域。
[0151]
在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入包含柯萨奇病毒病毒基因组的复制子。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入与seq id no:3的核苷酸713至3351对应的病毒基因组的区域。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入与seq id no:3的核苷酸3797至3798对应的病毒基因组的区域。在某些实施方案中，所述异源核苷酸插入与seq id no:3的核苷酸7334至7335对应的病毒基因组的区域。
[0152]
在某些实施方案中，将一个或多个mirna靶序列插入编码有效负载分子的异源多核苷酸中。在某些实施方案中，将一个或多个mirna靶序列掺入编码有效负载分子的异源多核苷酸的3’或5’utr中。在某些实施方案中，将一个或多个mirna靶序列掺入编码有效负载分子的异源多核苷酸的编码区中。在这样的实施方案中，在表达对应的mirna的细胞中，有效负载的翻译和随后表达没有发生，或大幅减少。在某些实施方案中，所述有效负载分子是蛋白。
[0153]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是分泌型蛋白。在某些实施方案中，所述分泌型蛋白包含信号肽。在某些实施方案中，所述分泌型蛋白包含非天然信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽促进有效负载分子的分泌。在某些实施方案中，所述分泌型蛋白不具有信号肽。
[0154]
在某些实施方案中，所述编码有效负载分子的异源多核苷酸与一个或多个病毒蛋白编码区形成连续开放读码框。在这里，连续开放读码框表示可以翻译成连续多肽的特定核苷酸三联体的序列。在某些实施方案中，所述有效负载分子和所述病毒蛋白通过切割多肽连接。在某些实施方案中，所述病毒蛋白是2b。
[0155]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是细胞毒性肽。本文中使用的“细胞毒性肽”表示当在宿主细胞中表达时能够诱导细胞死亡和/或当被宿主细胞分泌时能够诱导相邻细胞的细胞死亡的蛋白。在某些实施方案中，所述细胞毒性肽是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、p53、白喉毒素(dt)、假单胞菌属外毒素a(pea)、i型核酶灭活蛋白(rip)(例如，皂草素和白树毒素)、ii型rip(例如，蓖麻蛋白)、志贺样毒素1(slt1)、光敏活性氧物质(例如杀手红)。在某些实施方案中，所述细胞毒性肽由通过细胞凋亡导致细胞死亡的自杀基因(诸如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶基因)编码。
[0156]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是免疫调节肽。本文中使用的“免疫调节肽”是能够调节(例如，活化或抑制)特定免疫受体和/或途径的肽。在某些实施方案中，所述免疫调节肽可以作用于任何哺乳动物细胞，包括免疫细胞、组织细胞和间质细胞。在一个优选的实施方案中，所述免疫调节肽作用于免疫细胞诸如t细胞、nk细胞、nkt t细胞、b细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞。示例性的免疫调节肽包括抗原结合分子诸如抗体或其抗原结合片段、细胞因子、趋化因子、可溶性受体、细胞表面受体配体、双组分多肽和酶。
[0157]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是细胞因子诸如ifng、gm-csf、il-1、il-2、il-12、il-15、il-18、il-36γ、tnfα、ifnα、ifnβ、ifnγ或tnfsf14。在某些实施方案中，所述有效负载分子是趋化因子诸如cxcl10、cxcl9、ccl21、ccl4或ccl5。在某些实施方案中，所述有效负载分子是细胞表面受体的配体诸如nkg2d配体、神经纤毛蛋白配体、flt3配体、cd47配体(例如，sirp1α)。在某些实施方案中，所述有效负载分子是可溶性受体，诸如可溶性的细胞因子受体(例如，il-13r、tgfβr1、tgfβr2、il-35r、il-15r、il-2r、il-12r和干扰素受体)或可溶性的先天性免疫受体(例如，toll-样受体、补体受体等)。在某些实施方案中，所述有效负载分子是参与细胞内rna和/或dna传感的蛋白的显性激动剂突变体(例如sting、rig-1或mda-5的显性激动剂突变体)。
[0158]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是抗原结合分子诸如抗体或其抗原结合片段(例如，单链可变片段(scfv)、f(ab)等)。在某些实施方案中，所述抗原结合分子特异性地结合细胞表面受体，诸如免疫检验点受体(例如，pd-1、pd-l1和ctla4)或参与细胞生长和活化的另外细胞表面受体(例如，ox40、cd200r、cd47、csf1r、41bb、cd40和nkg2d)。在某些实施方案中，所述抗原结合分子特异性地结合在表3和/或4中所示的抗原。
[0159]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是蝎子多肽诸如氯代毒素、bmkn-2、neopladine 1、neopladine 2和mauriporin。在某些实施方案中，所述有效负载分子是蛇多肽诸如蛇毒解聚素、apoxin-i、具窍蝮蛇毒素-i、bjcul、ohap-1、rhodostomin、drct-i、ctx-iii、b1l和actx-6。在某些实施方案中，所述有效负载分子是蜘蛛多肽诸如latarcin和透明质酸酶。在某些实施方案中，所述有效负载分子是蜜蜂多肽诸如蜂毒肽和蜂毒明肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是蛙多肽诸如pst-1、pdt-1和pdt-2。
[0160]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是酶。在某些实施方案中，所述酶能够通过改变细胞外基质调节肿瘤微环境。在这样的实施方案中，所述酶可以包括、但不限于基质金属蛋白酶(例如，mmp9)、胶原酶、透明质酸酶、明胶酶或弹性蛋白酶。在某些实施方案中，所述酶是基因导向的酶前药治疗(gdept)系统的组成部分，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧肽酶g2、嘌呤核苷磷酸化酶或细胞色素p450。在某些实施方案中，所述酶能够在靶细胞中诱导或活化细胞死亡途径(例如，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)。在某些实施方案中，所述酶能够降解细胞外代谢物或信息(例如精氨酸酶或15-羟基前列腺素脱氢酶)。
[0161]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是双组分多肽(双组分抗原结合分子)。本文中使用的“双组分多肽”表示包含能够结合在非癌性效应细胞(例如，t细胞)上表达的细胞表面抗原的第一结构域和能够结合由靶细胞(例如，癌细胞、肿瘤细胞或不同类型的效应细胞)表达的细胞表面抗原的第二结构域的多聚体蛋白。在某些实施方案中，双组分多肽的各个多肽结构域可以包含抗体或其结合片段(例如，单链可变片段(scfv)或f(ab))、纳米抗体、双体、flexibody、dock-and-lock
tm
抗体或单克隆抗-独特型抗体(mab2)。在某些实施方案中，所述双组分多肽的结构可以是双可变结构域抗体(dvd-ig
tm
)、双特异性的t细胞接合剂(bite
tm
)、或双亲和力重新靶向(dart)多肽。在某些实施方案中，所述双组分多肽是bite且包含特异性地结合在表3和/或4中所示的抗原的结构域。示例性的bite显示在下面表2中。
[0162]
表2：在临床前和临床研究中使用的经验证的bite
[0163][0164][0165]
在某些实施方案中，双组分多肽所结合的、在效应细胞上表达的细胞表面抗原选自下面表3。在某些实施方案中，所述双组分多肽结合cd3或其组分之一。cd3是一种蛋白复合物和t细胞共受体，其作为t细胞多分子受体(tcr)的组成部分在t淋巴细胞上表达。它包含cd3γ、cd3δ、cd3ε和/或cd3ξ受体链。在某些实施方案中，所述双组分多肽结合nkp46。nkp46(也被称作cd335)属于天然的细胞毒性受体(ncr)家族并且是具有2个ig-样结构域和一个短细胞质尾巴的糖蛋白。在某些实施方案中，所述双组分多肽结合cd16。cd16(也被称作fcγriii)是在天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的表面上发现的分化簇分子。在某些实施方案中，所述双组分多肽结合sirpα。sirpα(也被称作信号调节蛋白α)是一种来自主要由髓样细胞和干细胞或神经元表达的sirp家族的调节性膜糖蛋白，其与跨膜蛋白cd47相互作用。
[0166]
在某些实施方案中，在肿瘤细胞或效应细胞上表达的细胞表面抗原选自下面表4。在某些实施方案中，在肿瘤细胞上表达的细胞表面抗原是肿瘤抗原。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原选自cd19、epcam、cea、psma、cd33、egfr、her2、epha2、mcsp、adam17、psca、17-a1、nkgd2配体、csf1r、fap、gd2、dll3或神经纤毛蛋白。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原选自在表4中列出的那些。
[0167]
在某些实施方案中，所述双组分多肽选自结合dll3和效应细胞靶抗原的分子、结
合fap和效应细胞靶抗原的分子、以及结合epcam和效应细胞靶抗原的分子。在某些实施方案中，所述效应细胞靶抗原选自表3。在某些实施方案中，所述效应细胞靶抗原是t细胞靶抗原。在某些实施方案中，所述效应细胞靶抗原是cd3。在某些实施方案中，所述效应细胞靶抗原是cd3ε。
[0168]
表3：示例性的效应细胞靶抗原
[0169][0170]
表4：示例性的靶细胞抗原
[0171]
[0172]
[0173][0174]
在某些实施方案中，所述双组分多肽特异性地结合根据下面表5标记为“x”的两种抗原的组合。在表5中具有相同抗原的那些“x”标记的组合指示，双组分多肽特异性地结合相同抗原的两种不同表位。在某些实施方案中，所述双组分多肽是bite。
[0175]
表5.用于双组分多肽结合的两种抗原的组合
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183][0184]
表5.(续)
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192][0193]
表5.(续)
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202][0203]
表5.(续)
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211][0212]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是抗原。在某些实施方案中，所述抗原是选自在表4中列出的那些的蛋白或其部分。在某些实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原(taa)或其部分。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原在肿瘤细胞的细胞表面上表达。在
某些实施方案中，所述抗原或其部分的表达诱导针对肿瘤细胞的免疫应答。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自cd19、epcam、cea、psma、cd33、egfr、her2、epha2、mcsp、adam17、psca、17-a1、nkgd2配体、csf1r、fap、gd2、dll3、神经纤毛蛋白、存活素或mage家族蛋白。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原是存活素。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原是mage(黑色素瘤抗原基因)家族蛋白。所述mage家族蛋白包含mage-b1、magea1、magea10、magea11、magea12、magea2b、magea3、magea4、magea6、magea8、magea9、mageb1、mageb10、mageb16、mageb18、mageb2、mageb3、mageb4、mageb5、mageb6、mageb6b、magec1、magec2、magec3、maged1、maged2、maged4、magee1、magee2、magef1、mageh1、magel2、ndn、ndnl2或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自下面表6中的抗原。在某些实施方案中，所述复制子编码本公开内容的二、三、四、五种或更多种肿瘤相关抗原。
[0213]
在某些实施方案中，所述有效负载分子包含本公开内容的肿瘤相关抗原(taa)的片段(即，肽片段)或由其组成。在某些实施方案中，所述taa的片段具有约10个氨基酸(aa)、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约60个氨基酸、约70个氨基酸、约80个氨基酸、约90个氨基酸、约100个氨基酸或之间的任何值的长度。在某些实施方案中，所述taa的片段具有至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或至少100个氨基酸的长度。在某些实施方案中，所述复制子包含二、三、四、五种或更多种有效负载分子，各自包含不同taa的片段或由其组成。在某些实施方案中，所述复制子包含二、三、四、五种或更多种有效负载分子，各自包含相同taa的不同片段或由其组成。在某些实施方案中，所述复制子包含有效负载分子的二、三、四、五个或更多个拷贝，各自包含相同taa的相同片段或由其组成。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含taa的相同肽片段的重复，诸如相同肽片段的2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个重复。
[0214]
表6.肿瘤相关抗原
[0215]
[0216][0217]
在某些实施方案中，所述有效负载分子包含肿瘤新抗原或由其组成。术语“肿瘤新抗原”表示存在于受试者的肿瘤细胞或组织中、但不存在于受试者的相应正常细胞或组织中的新抗原。肿瘤新抗原可以是肽或蛋白。在某些实施方案中，所述肿瘤新抗原是患者特异性的或受试者特异性的。在某些实施方案中，所述复制子编码多种包含肿瘤新抗原的有效负载分子，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10种包含肿瘤新抗原的有效负载分子。在某些实施方案中，所述复制子可以编码相同肿瘤新抗原的多个拷贝。
[0218]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是对主要组织相容性复合物(mhc)-肽抗原复合物具有特异性结合的双组分多肽。在某些实施方案中，所述双组分多肽特异性地结合mhc-肽抗原复合物。在某些实施方案中，所述mhc是i类mhc。在某些实施方案中，所述肽抗原衍生自taa或肿瘤新抗原。在某些实施方案中，所述双组分多肽包含特异性地结合mhc-肽抗原复合物的t-细胞受体(tcr)的片段(例如tcr的细胞外结构域)。在某些实施方案中，所述双组分多肽也结合根据表3的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，所述双组分多肽特异性地结合cd3。在某些实施方案中，所述双组分多肽特异性地结合cd3ε。
[0219]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含一个或多个有效负载分子，其中所述有效负载分子包含：
[0220]
a)一种或多种细胞因子，包含ifnγ、gm-csf、il-2、il-12、il-15、il-18、il-23和il-36γ；
[0221]
b)一种或多种趋化因子，包含cxcl10、ccl4、ccl5和ccl21；
[0222]
c)一种或多种抗体，包含抗-pd1-vhh-fc抗体、抗-cd47-vhh-fc抗体和抗-tgfβ-vhh(或scfv)-fc抗体；
[0223]
d)一种或多种双组分多肽，包含结合dll3和效应细胞靶抗原的双组分多肽、结合fap和效应细胞靶抗原的双组分多肽、以及结合epcam和效应细胞靶抗原的双组分多肽；
[0224]
e)一种或多种肿瘤相关抗原，包含存活素、mage家族蛋白和根据表6的所有抗原；
[0225]
f)一种或多种肿瘤新抗原；
[0226]
g)一种或多种结合mhc-肽抗原复合物的双组分多肽；
[0227]
h)一种或多种促融合蛋白，包含单纯疱疹病毒(hsv)ul27/糖蛋白b/gb，hsv ul53/糖蛋白k/gk，呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，fastp15，vsv-g，syncitin-1(来自人内源性逆转录病毒-w(herv-w))或syncitin-2(来自hervfrde1)，副粘病毒sv5-f，麻疹病毒-h，麻疹病毒-f，以及来自逆转录病毒或慢病毒诸如长臂猿白血病病毒(galv)、鼠白血病病毒(mlv)、mason-pfizer猴病毒(mpmv)和马传染性贫血病毒(eiav)的糖蛋白，任选地除去了r跨膜肽(r-版本)；
[0228]
i)一种或多种其它有效负载分子，包含il15r、pgdh、ada、ada2、hyal1、hyal2、chips、mlkl(或仅它的4hb结构域)、gsdmd(或它的l192a突变体、或它的氨基酸1-233片段、
或它的具有l192a突变的氨基酸1-233片段)、gsdme(或它的氨基酸1-237片段)、hmgb1(或仅它的box b结构域)、蜂毒肽(例如，α-蜂毒肽)、smac/diablo(或它的氨基酸56-239片段)、蛇laao、蛇解聚素、瘦素、flt3l、trail、gasdermin d或其截短体和gasdermin e或其截短体；
[0229]
j)一种或多种来自病原体的抗原，所述病原体包含登革热病毒、切昆贡亚病毒、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒、sars-cov-2、冠状病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、甲型流感病毒、流感b病毒和兽医病毒；或
[0230]
k)它们的任意组合。
[0231]
促融合蛋白是促进细胞与细胞膜融合的蛋白。由本公开内容的复制子编码的有效负载分子或至少一个有效负载分子可以是促融合蛋白，其包含单纯疱疹病毒(hsv)ul27/糖蛋白b/gb，hsv ul53/糖蛋白k/gk，呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，fastp15，vsv-g，syncitin-1(来自人内源性逆转录病毒-w(herv-w))或syncitin-2(来自hervfrde1)，副粘病毒sv5-f，麻疹病毒-h，麻疹病毒-f，以及来自逆转录病毒或慢病毒诸如长臂猿白血病病毒(galv)、鼠白血病病毒(mlv)、mason-pfizer猴病毒(mpmv)和马传染性贫血病毒(eiav)的糖蛋白，任选地除去了r跨膜肽(r-版本)。
[0232]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是gm-csf。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:81具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的gm-csf多肽。
[0233]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-2。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:82具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-2多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:83具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-2多肽。
[0234]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-12β亚基。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:84具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-12β亚基多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-12α亚基。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:85具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-12α亚基多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-23α亚基。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:86具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-23α亚基多肽。
[0235]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-18。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:87具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-18多肽。
[0236]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-36γ。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:88具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-36γ多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:89具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-36γ多肽。
[0237]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是cxcl10。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:90具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的cxcl10多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:91具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的cxcl10多肽。
[0238]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是ccl4。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:92具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的ccl4多肽。
[0239]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是ccl5。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:93具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的ccl5多肽。
[0240]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是ccl21。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:94具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的ccl21多肽。
[0241]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是抗-pd1-vhh-fc。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:95具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的抗-pd1-vhh-fc(higg4)多肽。
[0242]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是抗-dll3双组分多肽。在某些实施方案中，所述抗-dll3双组分多肽是抗-dll3双特异性的t-细胞接合剂(bite)。在某些实施方案中，所述抗-dll3双组分多肽或抗-dll3双特异性的t-细胞接合剂(bite)包含能够结合效应细胞的细胞表面抗原的第一结构域和能够结合dll3的第二结构域。在某些实施方案中，所述第一结构域结合cd3。在某些实施方案中，所述第二结构域(结合dll3)是scfv或纳米抗体(vhh)。在某些实施方案中，所述dll3结合结构域选自在国际pct申请号pct/us2021/030836(其通过引用整体并入本文)中描述的那些。在某些实施方案中，所述dll3抗原包含与seq id no:96具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0243]
在某些实施方案中，所述有效负载分子包含抗-fap重链可变区。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含与seq id no:97具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的抗-fap重链可变区多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含抗-fap轻链可变区。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含与seq id no:98具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的抗-fap轻链可变区多肽。
[0244]
在某些实施方案中，所述有效负载分子包含抗-cd3重链可变区。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含与seq id no:99具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的抗-cd3重链可变区多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含抗-cd3轻链可变区。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含与seq id no:100具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的抗-cd3轻链可变区多肽。
[0245]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是兰妥莫单抗。在某些实施方案中，所述有
效负载分子是与seq id no:101具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的兰妥莫单抗-样多肽。
[0246]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是mt110。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:102具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的mt110-样多肽。
[0247]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是帕妥昔珠单抗。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:103具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的帕妥昔珠单抗-样多肽。
[0248]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是amg330。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:104具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的amg330-样多肽。
[0249]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是cova420重链。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:105具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的cova420重链-样多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是cova420轻链。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:106具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的cova420轻链-样多肽。
[0250]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是存活素。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:107具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的存活素多肽。
[0251]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是ifnγ。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:113具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的ifnγ多肽。
[0252]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是il-15。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:114具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的il-15多肽。
[0253]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是il15r。在某些实施方案中，所述il15r包含il15ra和/或il15rb。在某些实施方案中，所述il15ra与seq id no:115具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，所述il15rb多肽与seq id no:116具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
[0254]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是pgdh。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:117具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的pgdh多肽。
[0255]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是ada2。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:118具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的ada2多肽。
[0256]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是hyal1。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:119具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少
95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的hyal1多肽。
[0257]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是hyal2。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:120具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的hyal2多肽。
[0258]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是mlkl。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:121具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的mlkl多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含mlkl 4hb结构域或由其组成。
[0259]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是gsdmd。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:122具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的gsdmd多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是gsdmd 1-233片段和/或l192a突变体。
[0260]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是gsdme。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:123具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的gsdme多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是gsdme 1-237片段。
[0261]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是hmgb1。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:124具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的hmgb1多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含hmgb1 box b结构域或由其组成。
[0262]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是蜂毒肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:125具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的蜂毒肽多肽。
[0263]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是smac/diablo。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:126具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的smac/diablo多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子包含smac/diablo氨基酸56-239片段或由其组成。
[0264]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是蛇laao。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:127具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的蛇laao多肽。
[0265]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是瘦素。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:128具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的瘦素多肽。
[0266]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是flt3l。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:129具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的flt3l多肽。
[0267]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是trail。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:130具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的trail多肽。
kyushu肺癌抗原1)多肽。
[0280]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是sage(肉瘤抗原)。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:143具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的sage(肉瘤抗原)多肽。
[0281]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是spa17(精子自身抗原蛋白17)。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:144具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的spa17(精子自身抗原蛋白17)多肽。
[0282]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是细胞周期蛋白a。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:145具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的细胞周期蛋白a多肽。
[0283]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是kmhn1(ccdc110)。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:146具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的kmhn1(ccdc110)多肽。
[0284]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是lmp-1。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:147具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的lmp-1多肽。
[0285]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是lmp-2。在某些实施方案中，所述有效负载分子是与seq id no:148具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的lmp-2多肽。
[0286]
在某些实施方案中，所述有效负载分子是不由受试者自身的基因组编码的抗原。在某些实施方案中，所述有效负载分子是由病原微生物表达的抗原。病原微生物包含细菌、病毒、寄生虫和真菌。在某些实施方案中，所述有效负载分子是来自病原体之一的抗原，所述病原体包含登革热病毒、切昆贡亚病毒、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒、sars-cov-2、冠状病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、甲型流感病毒、流感b病毒和兽医病毒。
[0287]
切割多肽
[0288]
在某些实施方案中，一个或多个切割多肽可操作地连接至有效负载分子。这样的切割多肽的存在允许将有效负载分子与由复制子编码的多肽的其余部分分离。在某些实施方案中，所述复制子包含编码两个或更多个有效负载分子的异源多核苷酸，所述有效负载分子可操作地连接至一个或多个切割多肽，这允许所述有效负载分子的分离。在某些实施方案中，另外的肽接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头)可以存在于有效负载分子和切割多肽之间。
[0289]
所述切割多肽包含2a家族自切割肽、3c切割位点、弗林蛋白酶位点、igsf1和hiv-1蛋白酶位点。应当注意，超过一种切割多肽可以可操作地连接至有效负载分子，且不同的切割多肽可以用在相同复制子中。例如，不同的切割多肽可以可操作地连接至有效负载分子的n-端和c-端。另外，两个或更多个切割多肽可以连接在一起或连续连接以形成更长的切割多肽，其可以具有改进的切割性能。
[0290]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含2a家族自切割肽或由其组成。自切割肽存
在于小核糖核酸病毒科的成员中，包括口蹄疫病毒属诸如口蹄疫病毒(fmdv)、马甲型鼻炎病毒(erav)、thosea asigna病毒(tav)和猪捷申病毒-1(ptv-1)(donnelly,m l,等人,j.gen.virol.,82,1027-101(2001)；ryan,m d,等人,j.gen.virol.,72,2727-2732(2001)和心病毒属诸如theilovirus(例如，theiler氏鼠脑脊髓炎)和脑心肌炎病毒。从fmdv、erav、ptv-1和tav衍生出的2a肽在本文中有时分别被称作“f2a”、“e2a”、“p2a”和“t2a”。口蹄疫病毒2a多肽通常含有dx1ex2npg(seq id no:63)基序，其中x1经常是缬氨酸或异亮氨酸。不希望受任何特定理论约束，认为2a序列介导脯氨酸和甘氨酸之间的“核糖体跳跃”，从而损害p和g之间的正常肽键形成而不影响下游翻译。示例性的2a自切割肽可以在下表7中找到。另外的示例性的2a自切割肽可以在美国专利号9,497,943和souza-moreira等人,fems yeast res.2018年8月1日；18(5)(它们通过引用并入本文)中找到。在某些实施方案中，所述切割多肽包含根据表7的2a自切割肽之一。在某些实施方案中，所述切割多肽包含由根据表7中的2a自切割肽之一的至多1个、至多2个、至多3个或至多4个突变组成的氨基酸序列。
[0291]
表7.示例性的2a自切割肽
[0292]
名称序列seq id not2aegrgslltcgdveenpgp64p2aatnfsllkqagdveenpgp65e2aqctnyallklagdvesnpgp66f2avkqtlnfdllklagdvesnpgp67svv 2asgdietnpgp68
[0293]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含svv 2a自切割肽或由其组成。在某些实施方案中，所述svv 2a自切割肽具有sgdietnpgp(seq id no:68)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述svv 2a自切割肽具有由根据sgdietnpgp(seq id no:68)的至多1个、至多2个或至多3个突变组成的氨基酸序列。
[0294]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含柯萨奇病毒2a切割位点或由其组成。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒2a切割位点具有gfghq(seq id no:69)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒2a切割位点具有由根据gfghq(seq id no:69)的至多1个、至多2个或至多3个突变组成的氨基酸序列。
[0295]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含3c切割位点或由其组成。在某些实施方案中，所述3c切割位点是具有氨基酸序列ivyelqgp(seq id no:70)的svv 3c切割位点。在某些实施方案中，所述3c切割位点具有由根据ivyelqgp(seq id no:70)的至多1个、至多2个或至多3个突变组成的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含融合素位点和3c切割位点。在某些实施方案中，所述切割多肽包含rrkrivyelqgp(seq id no:71)的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述3c切割位点具有由根据rrkrivyelqgp(seq id no:71)的至多1个、至多2个、至多3个或至多4个突变组成的氨基酸序列。
[0296]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含一个或多个切割位点或由其组成，所述切割位点可以被由哺乳动物细胞产生的蛋白酶切割。在某些实施方案中，所述蛋白酶是弗林蛋白酶蛋白酶。在某些实施方案中，所述切割多肽包含一个弗林蛋白酶位点或由其组成。在某些实施方案中，所述切割多肽包含两个或更多个弗林蛋白酶位点或由其组成。在某些实
施方案中，所述弗林蛋白酶位点具有arg-x-x-arg(seq id no:72)的共有序列。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶位点具有arg-x-lys/arg-arg(seq id no:73)的共有序列。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶位点具有rrkr(seq id no:74)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含一个或多个gs接头(氨基酸序列gly-ser)。在某些实施方案中，所述切割多肽包含一个或多个gsg接头(氨基酸序列gly-ser-gly)。在某些实施方案中，所述切割多肽采用“gsg接头-2a肽”的构型。在某些实施方案中，所述切割多肽采用“弗林蛋白酶位点-2a肽”的构型。在某些实施方案中，所述切割多肽采用“弗林蛋白酶位点-gsg接头-2a肽”的构型。
[0297]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含igsf1多肽或由其组成。在某些实施方案中，所述igsf1多肽包含neairlslimqlvalllvvlwirwkcrrlrireawllgtaqgvtmlfivtallccglcng(seq id no:75)的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述igsf1多肽包含与seq id no:75具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，除了igsf1多肽以外，所述切割多肽还包含一个或多个弗林蛋白酶位点。在某些实施方案中，所述切割多肽包含含有肽的弗林蛋白酶位点或由其组成，所述肽具有gsrrkrgsrrkrgs(seq id no:76)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含gsrrkrgsrrkrgsneairlslimqlvalllvvlwirwkcrrlrireawllgtaqgvtmlfivtallccglcng(seq id no:77)的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述切割多肽包含与seq id no:77具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述有效负载分子中的两个可操作地连接至包含igsf多肽的切割多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子中的两个可操作地连接至包含igsf多肽和一个或多个弗林蛋白酶位点的切割多肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子中的两个可操作地连接至包含seq id no:77的氨基酸序列或由其组成的切割多肽。
[0298]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含一个或多个可以被非哺乳动物蛋白酶识别的切割位点或由其组成。在某些实施方案中，所述非哺乳动物蛋白酶是hiv蛋白酶。在某些实施方案中，所述切割多肽包含hiv蛋白酶位点或由其组成。在某些实施方案中，所述hiv蛋白酶位点包含pr切割序列或由其组成，所述pr切割序列具有iflets(seq id no:78)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述hiv蛋白酶位点包含pr切割序列或由其组成，所述pr切割序列具有根据iflets(seq id no:78)的至多一个、至多两个、或至多三个突变或保守突变。在某些实施方案中，所述切割多肽包含gs接头和pr切割序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含gsgiflets(seq id no:79)的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述切割多肽包含特定氨基酸序列或由其组成，所述特定氨基酸序列具有根据gsgiflets(seq id no:79)的至多一个、至多两个、至多三个或至多四个突变或保守突变。
[0299]
在某些实施方案中，所述异源核酸包含hiv蛋白酶编码序列。在某些实施方案中，所述hiv蛋白酶包含特定氨基酸序列或由其组成，所述特定氨基酸序列与seq id no:80具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性：
[0300]
qitlwqrplvtikiggqlkealldtgaddtvleemslpgrwkpkmiggiggfikvrqydqilieicghkaigtvlvgptpvniigrnlltqigctlnf(seq id no:80)
[0301]
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸包含编码区，其编码可操作地连接至一个或多个切割多肽的有效负载分子。在某些实施方案中，所述有效负载分子可操作地连接至两个切割多肽。在某些实施方案中，至少一个切割多肽侧接有效负载分子的n-端和/或至少一个切割多肽侧接有效负载分子的c-端。在某些实施方案中，所述切割肽和所述有效负载分子采用以下构型：
[0302]n’‑
切割多肽1-有效负载分子-切割多肽2-c’。
[0303]
在某些实施方案中，另外的切割多肽可以存在于在该段落中在上面描述的构型的n’和/或c’末端处。在某些实施方案中，所述另外的切割多肽包含2a自切割肽。在某些实施方案中，在c-端处的切割多肽2包含t2a自切割肽或由其组成。在某些实施方案中，在n-端处的切割多肽1包含2a自切割肽或由其组成。在某些实施方案中，另外的肽接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头)可以存在于有效负载分子和切割多肽之间。
[0304]
多个有效负载分子的共表达
[0305]
在某些实施方案中，本公开内容提供了重组rna复制子，其包含编码两个或更多个有效负载分子的异源核苷酸。在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子能够从一个复制子表达两个或更多个有效负载分子。
[0306]
在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子由连续的异源多核苷酸编码。在某些实施方案中，至少一个有效负载分子由第二异源多核苷酸编码。在某些实施方案中，所述两个或更多个异源多核苷酸插入在病毒基因组的不同位置。
[0307]
在某些实施方案中，至少一个有效负载分子是分泌型蛋白。在某些实施方案中，所述分泌型蛋白包含天然信号肽或非天然信号肽。在某些实施方案中，所述有效负载分子中的两个是分泌型蛋白。在某些实施方案中，所述有效负载分子中的至少两个是分泌型蛋白。在某些实施方案中，所有的有效负载分子是分泌型蛋白。在某些实施方案中，至少一个有效负载分子是分泌型蛋白，其包含用于分泌的天然信号肽序列。在某些实施方案中，至少一个有效负载分子是分泌型蛋白，其包含用于分泌的非天然信号肽序列。在某些实施方案中，至少一个有效负载分子是没有信号肽序列的分泌型蛋白。
[0308]
在某些实施方案中，每个有效负载分子在其c-端可操作地连接至切割多肽。在某些实施方案中，每个有效负载分子在其n-端和其c-端可操作地连接至切割多肽。
[0309]
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸包含编码区，其编码可操作地连接至切割多肽的两个或更多个有效负载分子。在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子和所述切割多肽采用以下构型：
[0310]n’‑
有效负载分子1-切割多肽-有效负载分子2-c’。
[0311]
在某些实施方案中，另外的切割多肽可以存在于在该段落中在上面描述的构型的n’和/或c’末端处。在某些实施方案中，所述另外的切割多肽包含2a自切割肽。在某些实施方案中，t2a自切割肽侧接有效负载分子2的c-端。在某些实施方案中，另外的肽接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头)可以存在于有效负载分子和切割多肽之间。
[0312]
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸包含编码区，其编码可操作地连接至切割多肽的两个有效负载分子，所述切割多肽包含igsf多肽或由其组成。在某些实施方案中，所述igsf1多肽具有以下氨基酸序列：neairlslimqlvalllvvlwirwkcrrlrireawllgtaqgvtmlfivtallccglcng(seq id no:75)。
[0313]
在某些实施方案中，所述igsf1多肽与seq id no:75具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性。在某些实施方案中，所述切割多肽包含含有特定肽的弗林蛋白酶位点，所述特定肽具有gsrrkrgsrrkrgs(seq id no:76)的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含以下氨基酸序列或由其组成：gsrrkrgsrrkrgsneairlslimqlvalllvvlwirwkcrrlrireawllgtaqgvtmlfivtallccglcng(seq id no:77)。
[0314]
在某些实施方案中，所述切割多肽包含与seq id no:77具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0315]
在某些实施方案中，所述异源多核苷酸包含编码区，其编码可操作地连接至切割多肽的两个有效负载分子，所述切割多肽包含一个或多个hiv蛋白酶位点或由其组成。在某些实施方案中，所述hiv蛋白酶位点包含pr切割序列或由其组成，所述pr切割序列具有iflets(seq id no:78)的氨基酸序列，或具有根据iflets(seq id no:78)的至多一个、至多两个、或至多三个突变或保守突变的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含gs接头和pr切割序列。在某些实施方案中，所述切割多肽包含gsgiflets(seq id no:79)的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，所述切割多肽包含特定氨基酸序列或由其组成，所述特定氨基酸序列具有根据gsgiflets(seq id no:79)的至多一个、至多两个、至多三个或至多四个突变或保守突变。
[0316]
在某些实施方案中，所述异源核酸进一步包含hiv蛋白酶编码区。在某些实施方案中，所述hiv蛋白酶通过切割多肽可操作地连接至一个或多个有效负载分子，所述切割多肽包含hiv蛋白酶位点或由其组成。在某些实施方案中，所述hiv蛋白酶位于两个有效负载分子之间。
[0317]
在某些实施方案中，所述异源核酸包含编码区，其编码两个有效负载分子和hiv蛋白酶。在某些实施方案中，所述异源核酸包含编码区，其编码采用以下构型的多肽：
[0318]n’‑
有效负载分子1-hiv蛋白酶位点-hiv蛋白酶-hiv蛋白酶位点-有效负载分子2-c’。
[0319]
在某些实施方案中，另外的切割多肽可以存在于在该段落中在上面描述的构型的n’和/或c’末端处。在某些实施方案中，所述另外的切割多肽包含hiv蛋白酶位点。在某些实施方案中，所述另外的切割多肽包含2a自切割肽。在某些实施方案中，t2a自切割肽侧接有效负载分子2的c-端。在某些实施方案中，另外的肽接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头)可以存在于有效负载分子和hiv蛋白酶位点之间。
[0320]
在某些实施方案中，所述异源核酸包含编码区，其编码三个有效负载分子和hiv蛋白酶。在某些实施方案中，所述异源核酸包含编码区，其编码采用以下构型的多肽：
[0321]n’‑
有效负载分子1-hiv蛋白酶位点-hiv蛋白酶-hiv蛋白酶位点-有效负载分子2-hiv蛋白酶位点-有效负载分子3-c’。
[0322]
在某些实施方案中，另外的切割多肽可以存在于在该段落中在上面描述的构型的n’和/或c’末端处。在某些实施方案中，所述另外的切割多肽包含hiv蛋白酶位点。在某些实施方案中，所述另外的切割多肽包含2a自切割肽。在某些实施方案中，t2a自切割肽侧接有效负载分子3的c-端。在某些实施方案中，另外的肽接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头)可以存在于有效负载分子和hiv蛋白酶位点之间。
[0323]
在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子选自荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子、能够结合细胞表面受体的抗原结合分子和细胞表面受体的配体。在某些实施方案中，至少一个有效负载分子是分泌型蛋白。在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子是分泌型蛋白。在某些实施方案中，所述有效负载分子选自在本公开内容的“异源多核苷酸和有效负载分子”部分中描述的有效负载分子。
[0324]
在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子包含：
[0325]
a.il-2和il-36γ；
[0326]
b.cxcl10以及结合fap和cd3的抗原结合分子；
[0327]
c.il-2以及结合dll3和cd3的抗原结合分子；
[0328]
d.il-36γ以及结合dll3和cd3的抗原结合分子；或
[0329]
e.il-2、il-36γ以及结合dll3和cd3的抗原结合分子
[0330]
在某些实施方案中，所述两个或更多个有效负载分子包含抗-dll3双组分多肽、抗-fap双组分多肽、抗-pd1-vhh-fc抗体、il-2、il-12、il-18、il-23、il-36γ、ccl21、cxcl10或其任意组合。在某些实施方案中，所述抗-dll3双组分多肽是抗-dll3/抗-cd3双组分多肽。在某些实施方案中，所述抗-fap双组分多肽是抗-fap/抗-cd3双组分多肽。
[0331]
在某些实施方案中，本公开内容的复制子或所述复制子的异源多核苷酸包含根据下面表8中列出的有效负载分子组合之一的两个或至少两个有效负载分子的编码区。在某些实施方案中，所述复制子是svv衍生出的复制子。在某些实施方案中，所述复制子是cva21衍生出的复制子。根据下面表8，两个有效负载分子的每种组合被标记为“x”。在表8中具有相同有效负载分子的那些“x”标记的组合指示，所述复制子包含有效负载分子的两个拷贝。
[0332]
表8.两个有效负载分子组合
[0333]
[0334]
[0335][0336]
表8.(续)
[0337]
[0338]
[0339]
[0340][0341]
表8.(续)
[0342]
[0343]
[0344][0345]
表8.(续)
[0346]
[0347]
[0348][0349]
表8.(续)
[0350]
[0351]
[0352]
[0353][0354]
在某些实施方案中，本公开内容的复制子或所述复制子的异源多核苷酸包含根据下面表9中列出的有效负载分子组合之一的三个或至少三个有效负载分子的编码区。在某些实施方案中，所述复制子是svv衍生出的复制子。在某些实施方案中，所述复制子是cva21衍生出的复制子。
[0355]
表9.三个有效负载分子组合
[0356]
[0357]
[0358]
[0359]
[0360][0361]
在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-dll3双组分多肽结合dll3和在表3中列出的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-dll3双组分多肽结合dll3和选自cd3、nkp46和cd16的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-dll3双组分多肽是bite。
[0362]
在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-fap双组分多肽结合fap和在表3中列出的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-fap双组分多肽结合fap和选自cd3、nkp46和cd16的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-fap双组分多肽是bite。
[0363]
在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-epcam双组分多肽结合epcam和在表3中列出的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-epcam双组分多肽结合epcam和选自cd3、nkp46和cd16的效应细胞抗原之一。在某些实施方案中，在表8或表9中的抗-epcam双组分多肽是bite。
[0364]
在某些实施方案中，各种塞内卡谷病毒(svv)衍生出的重组rna复制子包含编码一种或多种免疫调节蛋白(例如，抗-dll3双特异性的t-细胞接合剂(bite))的异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述svv衍生出的重组rna复制子进一步包含一种或多种细胞因子(例如，il-2、il-12、il-36γ)和/或一种或多种趋化因子(例如，ccl21、ccl4)的编码区。在某些实施方案中，所述svv衍生出的重组rna复制子包含根据下面表10的两个或更多个有效负载分子的编码区。
[0365]
表10.svv衍生出的复制子的有效负载分子
[0366]
svv衍生出的复制子有效负载分子复制子构建体#a1:抗-dll3bite,il-2复制子构建体#a2:抗-dll3bite,il-12复制子构建体#a3:抗-dll3bite,il-36γ复制子构建体#a4:抗-dll3bite,ccl21复制子构建体#a5:抗-dll3bite,ccl4复制子构建体#a6:抗-dll3bite,il-2,il-12
复制子构建体#a7:抗-dll3bite,il-2,il-36γ复制子构建体#a8:抗-dll3bite,il-2,ccl21复制子构建体#a9:抗-dll3bite,il-2,ccl4复制子构建体#a10:抗-dll3bite,il-12,il-36γ复制子构建体#a11:抗-dll3bite,il-12,ccl21复制子构建体#a12:抗-dll3bite,il-12,ccl4复制子构建体#a13:抗-dll3bite,il-36γ,ccl21复制子构建体#a14:抗-dll3bite,il-36γ,ccl4复制子构建体#a15:抗-dll3bite,ccl21,ccl4
[0367]
在某些实施方案中，所述柯萨奇病毒a21(cva21)衍生出的重组rna复制子包含编码一种或多种免疫调节蛋白(例如，抗-dll3双特异性的t-细胞接合剂(bite))的异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述cva21衍生出的重组rna复制子进一步包含一种或多种细胞因子(例如，il-2、il-12、il-36γ)和/或一种或多种趋化因子(例如，ccl21、ccl4)的编码区。在某些实施方案中，所述cva21衍生出的重组rna复制子包含根据下面表11的两个或更多个有效负载分子的编码区。
[0368]
表11.cva21衍生出的复制子的有效负载分子
[0369][0370][0371]
内部核糖体进入位点
[0372]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含在5’utr之外的ires。在某些实施方
案中，所述ires位于5’utr和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述ires位于2a编码区和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述ires位于有效负载分子编码序列和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述ires位于cre和2b编码区之间。在某些实施方案中，所述ires位于5’utr和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述ires位于cre和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述ires位于vp编码区和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述ires位于2a编码区和异源多核苷酸之间。在某些实施方案中，所述ires是emcv ires。在某些实施方案中，所述复制子是包含svv基因组的复制子。
[0373]
转衣壳化
[0374]
在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子可以被另一种编码溶瘤病毒的重组rna分子(例如，rna病毒基因组)转衣壳化。这样的重组rna分子可以包含病毒基因组(例如，合成的病毒基因组)。在某些实施方案中，这样的重组rna分子或rna病毒基因组当通过非病毒递送媒介物引入细胞时能够产生感染性的、裂解的病毒，并且不需要另外的外源基因或蛋白存在于细胞中即可复制和产生感染性病毒。在某些实施方案中，这样的rna病毒基因组都包含vp编码区。表达的病毒蛋白然后介导病毒复制并组装成包含rna病毒基因组的感染性病毒颗粒(其可以包含衣壳蛋白、包膜蛋白和/或膜蛋白)。在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子可以通过从这样的rna病毒基因组表达的衣壳蛋白转衣壳化。在某些实施方案中，当所述重组rna复制子和所述rna病毒基因组存在于相同细胞中(例如，通过颗粒将它们递送进细胞中)时，所述重组rna复制子可以被转衣壳化。这样，当引入相同宿主细胞中时，本文所述的重组rna复制子和rna病毒基因组可以产生两组病毒颗粒-一组包含重组rna复制子，另一组包含rna病毒基因组，它们二者能够感染另一种宿主细胞。
[0375]
mirna靶序列(mir-ts)盒
[0376]
在某些实施方案中，所述重组rna复制子包含一个或多个微rna(mirna)靶序列(mir-ts)盒，其中所述mir-ts盒包含一个或多个mirna靶序列，且其中一个或多个对应mirna在细胞中的表达抑制所述复制子在细胞中的复制。在某些实施方案中，所述一个或多个mirna选自mir-124、mir-1、mir-143、mir-128、mir-219、mir-219a、mir-122、mir-204、mir-217、mir-137和mir-126。在某些实施方案中，所述mir-ts盒包含mir-124靶序列的一个或多个拷贝、mir-1靶序列的一个或多个拷贝和mir-143靶序列的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述mir-ts盒包含mir-128靶序列的一个或多个拷贝、mir-219靶序列的一个或多个拷贝和mir-122靶序列的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述mir-ts盒包含mir-128靶序列的一个或多个拷贝、mir-204靶序列的一个或多个拷贝和mir-219靶序列的一个或多个拷贝。在某些实施方案中，所述mir-ts盒包含mir-217靶序列的一个或多个拷贝、mir-137靶序列的一个或多个拷贝和mir-126靶序列的一个或多个拷贝。
[0377]
在某些实施方案中，将包含一个或多个mir-ts盒的重组rna复制子掺入一个或多个必需病毒基因(蛋白编码区)的5’非翻译区(utr)或3’utr。在某些实施方案中，将包含一个或多个mir-ts盒的重组rna复制子掺入一个或多个非必需基因的5’非翻译区(utr)或3’utr。在某些实施方案中，将包含一个或多个mir-ts盒的重组rna复制子掺入一个或多个必需病毒基因的5’或3’。
[0378]
生产重组rna复制子的方法
[0379]
在某些实施方案中，使用一种或多种dna载体模板在体外产生本公开内容的重组
rna复制子，所述模板包含编码重组rna复制子的多核苷酸。术语“载体”在本文中用于表示能够转移、编码或运输另一种核酸分子的核酸分子。被转移的核酸通常插入到载体核酸分子中。载体可以包括指导细胞中自主复制的序列，和/或可以包括足以允许整合到宿主细胞dna中的序列。在某些实施方案中，使用一种或多种病毒载体产生本公开内容的重组rna复制子。
[0380]
在某些实施方案中，通过将编码重组rna复制子的多核苷酸引入(例如，借助于转染、转导、电穿孔等)到合适的体外宿主细胞中来产生本公开内容的重组rna复制子。合适的宿主细胞包括昆虫和哺乳动物细胞系。将宿主细胞培养适当量的时间以允许多核苷酸的表达和重组rna复制子的产生。然后将重组rna复制子从宿主细胞中分离并配制用于治疗用途(例如，包封在颗粒中)。图26显示了具有3'和5'核酶的重组rna复制子的体外合成的示意图(使用svv衍生出的复制子作为实施例，但它也适用于其它复制子)。相同的示意图适用于使用连接切割序列的其它组合合成重组rna复制子。
[0381]
在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子的复制需要对于复制子的病毒基因组而言天然的单独5’和3’末端。由体外t7 rna聚合酶或哺乳动物rna pol ii产生的rna转录物含有哺乳动物5’和3’utr，不含有产生感染性的rna病毒所需的单独天然末端。例如，t7 rna聚合酶需要在模板多核苷酸的5’末端上的鸟苷残基才能启动转录。但是，svv用在其5'末端上的尿苷残基开始。因此，必须除去包含svv病毒基因组的复制子的体外转录所需的t7前导序列，以生成生产功能性复制子所需的天然5’svv末端。因此，在某些实施方案中，适用于生产本公开内容的重组rna复制子的多核苷酸需要另外的非病毒5’和3’序列，其能够产生对于病毒而言天然的单独5’和3’末端。这样的序列在本文中被称作连接切割序列(jcs)。在某些实施方案中，连接切割序列的作用是在病毒rna和哺乳动物mrna序列的连接处切割t7 rna聚合酶或pol ii编码的rna转录物，从而从转录物除去非病毒rna多核苷酸，以便保持病毒基因组的内源性5’和3’单独末端(参见图27中所示的示意图)。在某些实施方案中，连接切割序列用于在编码重组rna复制子的dna质粒的线性化期间产生适当的末端(例如，在质粒模板的线性化后和重组rna复制子的体外转录之前，使用3’限制性酶识别序列产生适当的3’末端)。
[0382]
连接切割序列的性质和非病毒rna从病毒基因组转录物的除去可以通过多种方法完成。例如，在某些实施方案中，所述连接切割序列是rna干扰(rnai)分子的靶标。本文中使用的“rna干扰分子”表示通过内源基因沉默途径(例如，dicer和rna诱导的沉默复合物(risc))介导靶mrna序列的降解的rna多核苷酸。示例性的rna干扰剂包括微rna(mirna)、人工mirna(amirna)、短发夹rna(shrna)和小干扰rna(sirna)。此外，本领域中目前已知的或将在未来定义的用于在特定位点切割rna转录物的任何系统都可以用于产生对于病毒而言天然的单独末端。
[0383]
在某些实施方案中，所述rnai分子是mirna。mirna表示长度为约18-25个核苷酸的天然存在的非编码小rna分子，其至少部分地与靶mrna序列互补。在动物中，mirna的基因被转录为初级mirna(pri-mirna)，它是双链的并形成茎-环结构。然后初级mirna在细胞核中被包含类别2rna酶iii、drosha和微处理器亚基dcgr8的微处理器复合物切割，以形成70-100个核苷酸的前体mirna(前-mirna)。前-mirna形成发夹结构并被转运到细胞质，在此它被rna酶iii酶dicer加工成约18-25个核苷酸的mirna双链体。尽管双链体的任一条链都可
能充当功能性mirna，但通常mirna的一条链被降解，且只有一条链被加载到argonaute(ago)核酸酶上以产生效应rna诱导的沉默复合物(risc)，其中mirna与其mrna靶标相互作用(wahid等人,1803:11,2010,1231-1243)。在某些实施方案中，5’和/或3’连接切割序列是mirna靶序列。
[0384]
在某些实施方案中，所述rnai分子是人工mirna(amirna)，其来源于嵌入pol ii转录物中的合成mirna。(参见例如，liu等人,nucleic acids res(2008)36:9；2811-2834；zeng等人,molecular cell(2002),9；1327-1333；fellman等人,cell reports(2013)5；1704-1713)。在某些实施方案中，所述5’和/或3’连接切割序列是amirna靶序列。
[0385]
在某些实施方案中，所述rnai分子是sirna分子。sirna表示通常长度为约21-23个核苷酸的双链rna分子。双链体sirna分子在细胞质中通过与多蛋白复合物(被称作rna诱导的沉默复合物(risc))的结合而加工，在此期间“乘客”有义链从双链体中酶促切割。在活化的risc中所含的反义“引导”链然后通过序列互补性将risc引导至相应的mrna，并且ago核酸酶切割靶mrna，产生特异性基因沉默。在某些实施方案中，所述sirna分子衍生自shrna分子。shrna是长度为约50-70个核苷酸的单链人工rna分子，其形成茎-环结构。通过用质粒或病毒载体引入编码shrna的dna多核苷酸，实现shrna在细胞中的表达。然后将shrna转录成模拟前-mirna的茎-环结构的产物，并在核输出后，发夹由dicer加工以形成双链体sirna分子，其然后由risc进一步加工以介导靶标-基因沉默。在某些实施方案中，所述5’和/或3’连接切割序列是sirna靶序列。
[0386]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是指导rna(grna)靶序列。在这样的实施方案中，grna可以被设计和用具有rna酶活性的cas内切核酸酶(例如，cas13)引入，以介导病毒基因组转录物在精确连接位点处的切割。在某些实施方案中，所述5’和/或3’连接切割序列是grna靶序列。
[0387]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是初级-mirna编码序列。在编码病毒基因组的多核苷酸(例如，重组rna分子)的转录后，这些序列形成初级-mirna茎-环结构，其然后在细胞核中被drosha切割以在精确连接位点切割转录物。在某些实施方案中，所述5’和/或3’连接切割序列是初级-mrna靶序列。
[0388]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是促进核糖核酸内切酶rna酶h的切割的引物结合序列。在这样的实施方案中，将与5’和/或3’连接切割序列对合的引物与rna酶h酶一起添加到体外反应中。rna酶h特异性水解与dna杂交的rna的磷酸二酯键，因此能够在精确的连接切割序列处切割重组rna复制子中间体以产生所需的5’和3’天然末端。
[0389]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是限制性酶识别位点并且导致在用t7 rna聚合酶线性化质粒模板径流(runoff)rna合成期间产生病毒转录物的单独末端。在某些实施方案中，所述连接切割序列是iis型限制性酶识别位点。iis型限制性酶包含一组特定的酶，它们识别不对称的dna序列并在其识别序列之外(通常在1至20个核苷酸内)的特定距离处切割。示例性的iis型限制性酶包括acui、alwi、baei、bbsi、bbvi、bcci、bceai、bcgi、bcivi、bcodi、bfuai、bmri、bpmi、bpuei、bsai、bsaxi、bseri、bsgi、bsmai、bsmbi、bsmfi、bsmi、bspcni、bspmi、bspqi、bsrdi、bsri、btgzi、btsci、bsti、caspci、eari、ecii、esp3i、faui、foki、hgai、hphi、hpyav、mboli、mlyi、mmei、mnll、nmeaiii、plei、sapi和sfani。这些iis型限制性酶的识别序列是本领域已知的。参见位于neb.com/tools-and-resources/
selection-charts/type-iis-restriction-enzymes的new england biolabs网站。在某些实施方案中，所述连接切割序列是sapi限制性酶识别位点。
[0390]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是核酶编码序列并且介导重组rna复制子中间体的自我切割以产生最终重组rna复制子和随后感染性rna病毒产生所需的天然单独5’和3’末端。示例性的核酶包括锤头核酶(例如，图28a-28b中所示的锤头核酶)、varkud卫星(vs)核酶、发夹核酶、gir1分支核酶、glms核酶、twister核酶、twister姊妹核酶、手枪核酶(例如，图29a-29b中所示的手枪1和手枪2)、斧头核酶和丁型肝炎病毒核酶。在某些实施方案中，所述5’和/或3’连接切割序列是核酶编码序列。
[0391]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是编码配体诱导型自切割核酶(被称作“适体酶”)的序列。适体酶是含有对配体特异的整合适体结构域的核酶序列。与适体结构域结合的配体触发核酶的酶活性的活化，从而导致rna转录物的切割。示例性的适体酶包括茶碱依赖性适体酶(例如，与茶碱依赖性适体连接的锤头核酶)、四环素依赖性适体酶(例如，与tet依赖性适体连接的锤头核酶)、鸟嘌呤依赖性适体酶(例如，与鸟嘌呤依赖性适体连接的锤头核酶)。在某些实施方案中，所述5’和/或3’连接切割序列是适体酶编码序列。
[0392]
在某些实施方案中，所述连接切割序列是rnai分子(例如，sirna分子、shrna分子、mirna分子或amirna分子)、grna分子或rna酶h引物的靶序列。在这样的实施方案中，所述连接切割序列至少部分地与rnai分子、grna分子或引物分子的序列互补。用于对比和确定序列同一性百分比和互补性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。用于对比的序列的最佳比对可以例如通过下述方法实现：needleman和wunsch,(1970)j.mol.biol.48:443的同源性比对算法，pearson和lipman的检索相似性方法,(1988)proc.nat’l.acad.sci.usa 85:2444，这些算法的计算机化实现(在威斯康辛州遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta,genetics computer group,575science dr.,madison,wi)，手工比对和目检(参见，例如，brent等人,(2003)current protocols in molecular biology)，使用本领域已知的算法，包括blast和blast 2.0算法，其分别描述于altschul等人,(1977)nuc.acids res.25:3389-3402；和altschul等人,(1990)j.mol.biol.215:403-410。用于执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)公开获得。
[0393]
在某些实施方案中，所述5’连接切割序列和3’连接切割序列来自同一组(例如，都是rnai靶序列，都是核酶编码序列等)。例如，在某些实施方案中，所述连接切割序列是rnai靶序列(例如，sirna、shrna、amirna或mirna靶序列)，并掺入编码重组rna复制子的多核苷酸的5’和3’末端。在这样的实施方案中，所述5’和3’rnai靶序列可以相同(即，相同sirna、amirna或mirna的靶标)或不同(即，5’序列是一种sirna、shmirna或mirna的靶标，且3’序列是另一种sirna、amirna或mirna的靶标)。在某些实施方案中，所述连接切割序列是指导rna靶序列，并掺入编码重组rna复制子的多核苷酸的5’和3’末端。在这样的实施方案中，所述5’和3’grna靶序列可以是相同的(即，相同grna的靶标)或不同的(即，5’序列是一种grna的靶标且3’序列是另一种grna的靶标)。在某些实施方案中，所述连接切割序列是初级-mrna编码序列，并掺入编码重组rna复制子的多核苷酸的5’和3’末端。在某些实施方案中，所述连接切割序列是核酶编码序列，并掺入编码重组rna复制子的多核苷酸序列的5’和3’紧邻处。
[0394]
在某些实施方案中，所述5’连接切割序列和3’连接切割序列来自同一组，但是不同的变体或类型。例如，在某些实施方案中，所述5’和3’连接切割序列可以是rnai分子的靶序列，其中所述5’连接切割序列是sirna靶序列且所述3’连接切割序列是mirna靶序列(或反之亦然)。在某些实施方案中，所述5’和3’连接切割序列可以是核酶编码序列，其中所述5’连接切割序列是锤头核酶编码序列且所述3’连接切割序列是丁型肝炎病毒核酶编码序列。
[0395]
在某些实施方案中，所述5’连接切割序列和3’连接切割序列是不同的类型。例如，在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是rnai靶序列(例如，sirna、amirna或mirna靶序列)且所述3’连接切割序列是核酶序列、适体酶序列、初级-mirna序列或grna靶序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是核酶序列且所述3’连接切割序列是rnai靶序列(例如，sirna、amirna或mirna靶序列)、适体酶序列、初级-mirna编码序列或grna靶序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是适体酶序列且所述3’连接切割序列是rnai靶序列(例如，sirna、amirna或mirna靶序列)、核酶序列、初级-mirna序列或grna靶序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是初级-mirna序列且所述3’连接切割序列是rnai靶序列(例如，sirna、amirna或mirna靶序列)、核酶序列、适体酶序列或grna靶序列。在某些实施方案中，所述5’连接切割序列是grna靶序列且所述3’连接切割序列是rnai靶序列(例如，sirna、amirna或mirna靶序列)、核酶序列、初级-mirna序列或适体酶序列。
[0396]
连接切割序列相对于编码重组rna复制子的多核苷酸的示例性排列显示在下面表12和13中。
[0397]
表12：对称的连接切割序列(jsc)排列
[0398]5’
jcs jcs3
’ꢀ
sirna ts复制子sirna ts
ꢀꢀ
mir ts复制子mir ts
ꢀꢀ
amir ts复制子amir ts
ꢀꢀ
grna ts复制子grna ts
ꢀꢀ
pri-mir复制子pri-mir
ꢀꢀ
核酶复制子核酶
ꢀꢀ
适体酶复制子适体酶
ꢀꢀ
rna酶h引物ts复制子rna酶h引物ts [0399]
表13：不对称的jcs排列
[0400]
[0401]
[0402][0403]
在某些实施方案中，通过体外rna转录在体外产生本公开内容的重组rna复制子(参见图27中的示意图)。然后将重组rna复制子纯化和配制用于治疗用途(例如，包封进脂质纳米颗粒中)。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’核酶序列；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’核酶序列。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’锤头核酶序列(例如，野生型hhr或经修饰的hhr诸如在图28a-28b中提供的)；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’丁型肝炎病毒核酶序列。
[0404]
在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’锤头核酶序列(例如，野生型hhr或经修饰的hhr诸如在图28a-28b中提供的)；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’丁型肝炎病毒核酶序列。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’锤头核酶序列(例如，野生型hhr或经修饰的hhr诸如在图28a-28b中提供的)；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’丁型肝炎病毒核酶序列。
[0405]
在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚
合酶启动子)；(ii)5’核酶序列；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’限制性酶识别位点。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’锤头核酶序列(例如，野生型hhr或经修饰的hhr诸如在图28a-28b中提供的)；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’sapi限制性酶识别位点。
[0406]
在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’锤头核酶序列(例如，野生型hhr或经修饰的hhr诸如在图28a-28b中提供的)；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’sapi限制性酶识别位点。
[0407]
在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’手枪核酶序列(例如，在图29a-29b中显示的手枪1或手枪2核酶序列)；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’sapi限制性酶识别位点。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’手枪1核酶序列；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’sapi限制性酶识别位点。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’手枪2核酶序列；(iii)编码野生型svv基因组的多核苷酸；和(iv)3’sapi限制性酶识别位点。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸包含与seq id no:15具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在某些实施方案中，所述dna多核苷酸包含seq id no:15或由其组成。
[0408]
在某些实施方案中，所述dna多核苷酸从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’rna酶h引物结合位点；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’限制性酶识别位点。在某些实施方案中，所述dna载体包含多核苷酸，其从5’至3’包含：(i)启动子序列(例如，t7聚合酶启动子)；(ii)5’rna酶h引物结合位点；(iii)编码重组rna复制子的多核苷酸；和(iv)3’sapi限制性酶识别位点。
[0409]
包含重组rna复制子的颗粒
[0410]
在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子被包封在“颗粒”中。本文中使用的颗粒表示非组织衍生出的物质组合物，诸如脂质体、脂质体复合物、纳米颗粒、纳米囊、微米颗粒、微米球、脂质颗粒、外泌体、囊泡等。在某些实施方案中，所述颗粒是非蛋白性的和非免疫原性的。在这样的实施方案中，本公开内容的重组rna复制子的包封允许递送病毒基因组而不诱导全身性的抗病毒免疫应答，并且减轻中和抗病毒抗体的作用。此外，本公开内容的重组rna复制子的包封保护基因组免于降解并促进向靶宿主细胞中的引入。在某些实施方案中，所述颗粒是纳米颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒是脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒是外泌体。
[0411]
本公开内容提供了颗粒，其包含本公开内容的重组rna复制子。在某些实施方案中，所述颗粒是脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒进一步包含编码溶瘤病毒的第二重组rna分子。在某些实施方案中，所述编码溶瘤病毒的第二重组rna分子包含rna病毒基因组(例如，溶瘤病毒的rna病毒基因组)。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒是小核糖核酸病毒。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒是塞内卡谷病毒(svv)。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒是柯萨奇病毒。在某些实施方案中，所述小核糖核酸病毒是脑心肌炎病毒(emcv)。在某些实施方案中，所述rna病毒基因组包含完整vp1、vp2、vp3和vp4编码区。在某
些实施方案中，所述包含完整vp1、vp2、vp3和vp4编码区的rna病毒基因组属于与所述复制子的病毒基因组相同的病毒种或相同的病毒属。在某些实施方案中，所述重组rna复制子可以通过从包含完整vp编码区的rna病毒基因组表达的衣壳蛋白转衣壳化。在某些实施方案中，当所述重组rna复制子和所述rna病毒基因组存在于相同细胞中(例如，通过颗粒将它们递送进细胞中)时，所述重组rna复制子可以被转衣壳化。
[0412]
在某些实施方案中，所述颗粒在受试者中是可生物降解的。在这样的实施方案中，可以将多剂量的颗粒施用给受试者，而不在受试者中积累颗粒。合适的颗粒的例子包括聚苯乙烯颗粒、聚(乳酸-共聚-羟乙酸)plga颗粒、基于多肽的阳离子聚合物颗粒、环糊精颗粒、壳聚糖颗粒、基于脂质的颗粒、聚(β-氨基酯)颗粒、低分子量聚乙烯亚胺颗粒、聚磷酸酯颗粒、二硫化物交联的聚合物颗粒、聚酰氨基胺颗粒、聚乙烯亚胺(pei)颗粒和plurionics稳定化的聚丙烯硫化物颗粒。
[0413]
在某些实施方案中，将本公开内容的多核苷酸包封在无机颗粒中。在某些实施方案中，所述无机颗粒是金纳米颗粒(gnp)、金纳米棒(gnr)、磁性纳米颗粒(mnp)、磁性纳米管(mnt)、碳纳米角(cnh)、碳富勒烯、碳纳米管(cnt)、磷酸钙纳米颗粒(cpnp)、介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)、二氧化硅纳米管(snt)或星形中空二氧化硅纳米颗粒(shnp)。
[0414]
在某些实施方案中，本公开内容的颗粒在尺寸上是纳米级的，以提高溶解度、避免体内聚集引起的可能并发症以及促进胞饮作用。在某些实施方案中，所述颗粒具有约小于约1000nm的平均直径。在某些实施方案中，所述颗粒具有小于约500nm的平均直径。在某些实施方案中，所述颗粒具有约30至约100nm之间、约50至约100nm之间、或约75至约100nm之间的平均直径。在某些实施方案中，所述颗粒具有约30至约75nm之间、或约30至约50nm之间的平均直径。在某些实施方案中，所述颗粒具有约100至约500nm之间的平均直径。在某些实施方案中，所述颗粒具有约200至400nm之间的平均直径。在某些实施方案中，所述颗粒具有约350nm的平均大小。
[0415]
外泌体
[0416]
在某些实施方案中，本公开内容的重组rna复制子被包封在外泌体中。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多泡体与亲本细胞(例如，释放外泌体的细胞，在本文中也被称作供体细胞)的质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体的表面包含衍生自亲本细胞的细胞膜的脂质双层，并且可以进一步包含在亲本细胞表面上表达的膜蛋白。在某些实施方案中，外泌体还可以含有来自亲本细胞的胞质溶胶。外泌体由许多不同的细胞类型产生，包括上皮细胞、b和t淋巴细胞、肥大细胞(mc)和树突细胞(dc)，并已在血浆、尿、支气管肺泡灌洗液、肠上皮细胞和肿瘤组织中鉴定。因为外泌体的组成取决于它们来源的亲本细胞类型，所以不存在“外泌体特异性的”蛋白。但是，许多外泌体包含与外泌体在亲本细胞中所起源的细胞内囊泡相关的蛋白(例如，与核内体和溶酶体相关和/或由其表达的蛋白)。例如，外泌体可以富含抗原呈递分子诸如主要组织相容性复合物i和ii(mhc-i和mhc-ii)、四次穿膜蛋白(例如，cd63)、几种热激蛋白、细胞骨架组分诸如肌动蛋白和微管蛋白、参与细胞内膜融合、细胞-细胞相互作用(例如cd54)的蛋白、信号转导蛋白和细胞溶质酶。
[0417]
通过外泌体膜与靶细胞的质膜的融合，外泌体可以介导细胞蛋白从一个细胞(例如，亲本细胞)向靶细胞或受体细胞的转移。因此，修饰被外泌体包封的材料提供了一种机制，通过该机制可以将外源性试剂(诸如本文所述的多核苷酸)引入靶细胞。已被修饰以含
有一种或多种外源性试剂(例如，本文所述的多核苷酸)的外泌体在本文中被称作“经修饰的外泌体”。在某些实施方案中，通过将外源性试剂(例如，本文所述的多核苷酸)引入亲本细胞中而产生经修饰的外泌体。在这样的实施方案中，将外源核酸引入产生外泌体的亲本细胞中，从而将外源核酸本身或外源核酸的转录物掺入由亲本细胞产生的经修饰的外泌体中。通过本领域已知的方式，例如外源核酸的转导、转染、转化和/或显微注射，可以将外源核酸引入亲本细胞。
[0418]
在某些实施方案中，通过将本公开内容的重组rna复制子直接引入外泌体中来产生经修饰的外泌体。在某些实施方案中，将本公开内容的重组rna复制子引入完整外泌体中。“完整外泌体”表示包含衍生自产生它们的亲本细胞的蛋白和/或遗传物质的外泌体。获得完整外泌体的方法是本领域已知的(参见例如，alvarez-erviti l.等人,nat biotechnol.2011年4月；29(4):34-5；ohno s,等人,mol ther 2013年1月；21(l):185-91；和欧洲专利公开号2010663)。
[0419]
在某些实施方案中，将重组rna复制子引入空外泌体。“空外泌体”表示缺乏衍生自亲本细胞的蛋白和/或遗传物质(例如，dna或rna)的外泌体。产生空外泌体(例如，缺乏亲本细胞衍生出的遗传物质)的方法是本领域已知的，包括紫外线暴露、介导核酸向外泌体中的负载的内源蛋白的突变/缺失、以及电穿孔和化学处理以打开外泌体膜中的孔使得内源性遗传物质通过开放的孔从外泌体中排出。在某些实施方案中，空外泌体通过以下方式产生：通过用具有从约9至约14的ph的水溶液处理打开外泌体以获得外泌体膜，除去囊泡内的组分(例如，囊泡内的蛋白和/或核酸)，并重新组装外泌体膜以形成空外泌体。在某些实施方案中，通过超速离心或密度梯度超速离心除去囊泡内的组分(例如，囊泡内的蛋白和/或核酸)。在某些实施方案中，通过声处理、机械振动、穿过多孔膜的挤出、电流或这些技术中的一种或多种的组合，重新组装所述膜。在特定实施方案中，通过声处理重新组装所述膜。
[0420]
在某些实施方案中，用本文所述的重组rna复制子装载完整或空外泌体以产生经修饰的外泌体可以使用常规分子生物学技术诸如体外转化、转染和/或显微注射来实现。在某些实施方案中，通过电穿孔将外源性试剂(例如，本文所述的多核苷酸)直接引入完整或空外泌体中。在某些实施方案中，通过脂转染(例如，转染)将外源性试剂(例如，本文所述的多核苷酸)直接引入完整或空外泌体中。适用于生产根据本公开内容的外泌体的脂转染试剂盒是本领域已知的和商购可得的(例如，来自roche的hd转染试剂，和来自invitrogen的lipofectamine
tm 2000)。在某些实施方案中，通过使用热激的转化将外源性试剂(例如，本文所述的多核苷酸)直接引入完整或空外泌体中。在这样的实施方案中，将从亲本细胞分离的外泌体在二价阳离子诸如ca
2
(在cacl2中)存在下冷却，以使外泌体膜透化。然后可以将外泌体与外源核酸一起温育并短暂热激(例如，在42℃温育30-120秒)。在特定实施方案中，通过在除去囊泡内组分后将试剂与外泌体膜混合或共温育，可以实现用外源性试剂(例如，本文所述的多核苷酸)对空外泌体的负载。因此，从外泌体膜重新组装的经修饰的外泌体会将外源性试剂掺入囊泡内空间中。用于产生外泌体包封的核酸的其它方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号9,889,210、9,629,929和9,085,778；国际pct公开号wo 2017/161010和wo 2018/039119)。
[0421]
从许多不同的亲本细胞，包括细胞系、骨髓衍生出的细胞和从原代患者样品衍生出的细胞，可以获得外泌体。通过本领域已知的方式，可以从亲本细胞培养物的上清液分离
从亲本细胞释放的外泌体。例如，外泌体的物理性能可以用于将它们与介质或其它源材料分离，包括基于电荷(例如，电泳分离)、大小(例如，过滤、分子筛分等)、密度(例如，常规或梯度离心)和svedberg常数(例如，或没有外力的沉降等)的分离。可替换地或另外，分离可以基于一种或多种生物学性能，并且包括可以采用表面标志物的方法(例如，对于沉淀，与固相可逆结合、facs分离、特异性配体结合、非特异性配体结合等)。使用针对外泌体相关蛋白诸如cd63的荧光标记的抗体，通过流式细胞计量术可以确定外泌体表面蛋白的分析。用于表征外泌体的其它标志物描述于国际pct公开号wo 2017/161010。在又进一步考虑的方法中，还可以使用化学和/或物理方法融合外泌体，包括peg诱导的融合和/或超声融合。
[0422]
在某些实施方案中，尺寸排阻色谱法可以用于分离外泌体。在某些实施方案中，如本领域公知的，可以在色谱分离后通过离心技术(对一种或多种色谱级分)进一步分离外泌体。在某些实施方案中，外泌体的分离可以包含方法的组合，所述方法包括、但不限于如前所述的差速离心(参见raposo,g.等人,j.exp.med.183,1161-1172(1996))、超速离心、基于尺寸的膜过滤、浓缩和/或速率区带离心。
[0423]
在某些实施方案中，所述外泌体膜包含磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、甾醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸中的一种或多种。此外，所述膜可以包含一种或多种多肽以及一种或多种多糖，诸如聚糖。用于改变一种或多种膜组分的相对量的示例性外泌体膜组合物和方法描述于国际pct公开号wo 2018/039119中。
[0424]
在某些实施方案中，所述颗粒是外泌体且具有约30至约100nm之间、约30至约200nm之间、或约30至约500nm之间的直径。在某些实施方案中，所述颗粒是外泌体且具有约10nm至约100nm之间、约20nm至约100nm之间、约30nm至约100nm之间、约40nm至约100nm之间、约50nm至约100nm之间、约60nm至约100nm之间、约70nm至约100nm之间、约80nm至约100nm之间、约90nm至约100nm之间、约100nm至约200nm之间、约100nm至约150nm之间、约150nm至约200nm之间、约100nm至约250nm之间、约250nm至约500nm之间、或约10nm至约1000nm之间的直径。在某些实施方案中，所述颗粒是外泌体且具有约20nm至300nm之间、约40nm至200nm之间、约20nm至250nm之间、约30nm至150nm之间、或约30nm至100nm之间的直径。
[0425]
脂质纳米颗粒
[0426]
在某些实施方案中，将本文所述的重组rna复制子包封在脂质纳米颗粒(lnp)中。在某些实施方案中，所述lnp包含一种或多种脂质诸如诸如甘油三酯(例如三硬脂精)、甘油二酯(例如山嵛酸甘油酯)、甘油单酯(例如单硬脂酸甘油酯)、脂肪酸(例如硬脂酸)、类固醇(例如胆固醇)和蜡类(例如棕榈酸鲸蜡酯)。在某些实施方案中，所述lnp包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质。在某些实施方案中，所述lnp包含一种或多种阳离子脂质、胆固醇和一种或多种中性脂质。
[0427]
阳离子脂质表示在选定的ph(诸如生理ph)携带净正电荷的多种脂质种类中的任一种。这样的脂质包括、但不限于1,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、双十八烷基二甲基铵(dodma)、二硬脂酰二甲基铵(dsdma)、n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)；n-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)；n,n-二硬脂酰-n,n-二甲基溴化铵(ddab)；n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)；3-(n-(n
′
,n
′‑
二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)
cer)(包括n-辛酰基-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](c8 peg-2000神经酰胺))在本文所述的脂质体和药物组合物中的应用和包含，优选地与本文中公开的化合物和脂质中的一种或多种组合。
[0432]
在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒可以进一步包含一种或多种peg修饰的脂质，其包含与包含一个或多个c6-c20烷基的脂质共价连接的至多5kda长度的聚乙二醇链。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(dspe-peg)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg-胺)。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含peg修饰的脂质，其选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-5000](dspe-peg5k)；1,2-二棕榈酰基-消旋-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(dpg-peg2k)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-5000(dsg-peg5k)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-2000(dsg-peg2k)；1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-5000(dmg-peg5k)；和1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-2000(dmg-peg2k)。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含dspe-peg5k。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含dpg-peg2k。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含dsg-peg2k。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含dmg-peg2k。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含dsg-peg5k。在某些实施方案中，所述lnp进一步包含dmg-peg5k。在某些实施方案中，所述peg修饰的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质含量的约0.1％至约1％。在某些实施方案中，所述peg修饰的脂质占脂质纳米颗粒中的总脂质含量的约0.1％、约0.2％约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％或约3.0％。
[0433]
在某些实施方案中，所述脂质用可切割的peg脂质修饰。具有可切割键的peg衍生物的例子包括用肽键(kulkarni等人.(2014).mmp-9 responsive peg cleavable nanovesicles for efficient delivery of chemotherapeutics to pancreatic cancer.mol pharmaceutics 11:2390-9；lin等人.(2015).drug/dye-loaded,multifunctional peg-chitosan-iron oxide nanocomposites for methotraxate synergistically self-targeted cancer therapy and dual model imaging.acs appl mater interfaces 7:11908-20.)、二硫键(yan等人(2014).a method to accelerate the gelation of disulfide-crosslinked hydrogels.chin j polym sci 33:118-27；wu和yan(2015).copper nanopowder catalyzed cross-coupling of diaryl disulfides with aryl iodides in peg-400.synlett 26:537-42)、乙烯基醚键、腙键(kelly等人.(2016).polymeric prodrug combination to exploit the therapeutic potential of antimicrobial peptides against cancer cells.org biomol chem 14:9278-86.)和酯键(xu等人.(2008).esterase-catalyzed depegylation of ph-sensitive vesicles modified with cleavable peg-lipid derivatives.j control release 130:238-45)修饰的那些。也参见,fang等人,(2017)cleaveable pegylation:a strategy for overcoming the“peg dilemma”in efficient drug delivery.drug delivery 24:2,22-32。
[0434]
在某些实施方案中，所述peg脂质是活化的peg脂质。示例性的活化的peg脂质包括peg-nh2、peg-mal、peg-nhs和peg-ald。这样的官能化的peg脂质可用于将靶向部分缀合至
脂质纳米颗粒以将颗粒引导至特定靶细胞或组织(例如，通过抗原结合分子、肽、聚糖等的附着)。
[0435]
在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是dotap。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是dlin-mc3-dma(mc3)。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是ss-ec。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是ss-lc。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是ss-oc。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是ss-op。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是l-319。
[0436]
在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述一种或多种辅助脂质包含胆固醇。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述一种或多种辅助脂质包含dlpe。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述一种或多种辅助脂质包含dspc。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述一种或多种辅助脂质包含dope。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和一种或多种辅助脂质，其中所述一种或多种辅助脂质包含dopc。
[0437]
在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和至少两种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是dotap，且所述至少两种辅助脂质包含胆固醇和dlpe。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和至少两种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是mc3，且所述至少两种辅助脂质包含胆固醇和dspc。在某些实施方案中，所述至少两种辅助脂质包含胆固醇和dope。在某些实施方案中，所述至少两种辅助脂质包含胆固醇和dspc。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和至少三种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是dotap，且所述至少三种辅助脂质包含胆固醇、dlpe和dspe。在某些实施方案中，所述lnp包含一种阳离子脂质和至少三种辅助脂质，其中所述阳离子脂质是mc3，且所述至少三种辅助脂质包含胆固醇、dspc和dmg。在某些实施方案中，所述至少三种辅助脂质包含胆固醇、dope和dspe。在某些实施方案中，所述至少三种辅助脂质包含胆固醇、dspc和dmg。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇和dlpe。在某些实施方案中，所述lnp包含mc3、胆固醇和dspc。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇和dope。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇、dlpe和dspe。在某些实施方案中，所述lnp包含mc3、胆固醇、dspc和dmg。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇、dlpe和dspe-peg。在某些实施方案中，所述lnp包含mc3、胆固醇、dspc和dmg-peg。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇、dope和dspe。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇、dope和dspe-peg。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇和dpg-peg(例如，dpg-peg2k)。
[0438]
在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇(chol)和dlpe，其中dotap:chol:dlpe(作为总脂质含量的百分比)的比率是约50:35:15。在某些实施方案中，所述lnp包含
dotap、胆固醇(chol)和dlpe，其中dotap:chol:dope(作为总脂质含量的百分比)的比率是约50:35:15。在某些实施方案中，所述lnp包含dotap、胆固醇(chol)、dlpe、dspe-peg，其中dotp:chol:dlpe(作为总脂质含量的百分比)的比率是约50:35:15且其中所述颗粒包含约0.2％ dspe-peg。在某些实施方案中，所述lnp包含mc3、胆固醇(chol)、dspc和dmg-peg，其中mc3:chol:dspc:dmg-peg(作为总脂质含量的百分比)的比率是约49:38.5:11:1.5。
[0439]
在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k)，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝40％-60％，b＝10％-25％，c＝20％-30％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝45％-50％，b＝20％-25％，c＝25％-30％，且d＝0％-1％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约49:22:28.5:0.5。
[0440]
在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝40％-60％，b＝10％-30％，c＝20％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝40％-60％，b＝10％-30％，c＝25％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝45％-55％，b＝10％-20％，c＝30％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝45％-50％，b＝10％-15％，c＝35％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是49:11:38.5:1.5。
[0441]
在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝45％-65％，b＝5％-20％，c＝20％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝50％-60％，b＝5％-15％，c＝30％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝55％-60％，b＝5％-15％，c＝30％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约a:b:c:d，其中a＝55％-60％，b＝5％-10％，c＝30％-35％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％。在某些实施方案中，所述lnp包含ss-oc、dspc、胆固醇(chol)和dpg-peg2k，
其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是58:7:33.5:1.5。
[0442]
在某些实施方案中，所述纳米颗粒涂有糖胺聚糖(gag)以调节或促进靶细胞对纳米颗粒的摄取。gag可以是肝素/硫酸肝素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素、硫酸角蛋白或透明质酸(ha)。在一个特定实施方案中，所述纳米颗粒的表面涂有ha并靶向颗粒以供肿瘤细胞摄取。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒涂有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸盐三-肽(rgd肽)(参见ruoslahti,advanced materials,24,2012,3747-3756；和bellis等人,biomaterials,32(18),2011,4205-4210)。
[0443]
在某些实施方案中，所述lnp具有约50nm至约500nm的平均大小。例如，在某些实施方案中，所述lnp具有约50nm至约200nm、约100nm至约200nm、约150nm至约200nm、约50nm至约150nm、约100nm至约150nm、约150nm至约500nm、约200nm至约500nm、约300nm至约500nm、约350nm至约500nm、约400nm至约500nm、约425nm至约500nm、约450nm至约500nm、或约475nm至约500nm的平均大小。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约50nm至约120nm的平均大小。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或约120nm的平均大小。在某些实施方案中，所述多个lnp具有约100nm的平均大小。
[0444]
在某些实施方案中，所述lnp具有中性电荷(例如，约0mv至1mv之间的平均ζ电位)。在某些实施方案中，所述lnp具有约40mv至约-40mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约40mv至约0mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约35mv至约0mv、约30mv至约0mv、约25mv至约0mv、约20mv至约0mv、约15mv至约0mv、约10mv至约0mv、或约5mv至约0mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约20mv至约-40mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约20mv至约-20mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约10mv至约-20mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约10mv至约-10mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约10mv、约9mv、约8mv、约7mv、约6mv、约5mv、约4mv、约3mv、约2mv、约1mv、约0mv、约-1mv、约-2mv、约-3mv、约-4mv、约-5mv、约-6mv、约-7mv、约-8mv、约-9mv、约-9mv或约-10mv的平均ζ电位。
[0445]
在某些实施方案中，所述lnp具有约0mv至-20mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有小于约-20mv的平均ζ电位。例如，在某些实施方案中，所述lnp具有小于约小于约-30mv、小于约35mv或小于约-40mv的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约-50mv至约-20mv、约-40mv至约-20mv、或约-30mv至约-20mv之间的平均ζ电位。在某些实施方案中，所述lnp具有约0mv、约-1mv、约-2mv、约-3mv、约-4mv、约-5mv、约-6mv、约-7mv、约-8mv、约-9mv、约-10mv、约-11mv、约-12mv、约-13mv、约-14mv、约-15mv、约-16mv、约-17mv、约-18mv、约-19mv、约-20mv、约-21mv、约-22mv、约-23mv、约-24mv、约-25mv、约-26mv、约-27mv、约-28mv、约-29mv、约-30mv、约-31mv、约-32mv、约-33mv、约-34mv、约-35mv、约-36mv、约-37mv、约-38mv、约-39mv或约-40mv的平均ζ电位。
[0446]
在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子且包含约3:1(l:n)的脂质(l)与核酸(n)之比。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子且包含约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1的l:n比率。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子且包含约7:1的脂质(l)与核酸(n)之比。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子且包含约4.5:1、约4.6:1、约4.7:1、约4.8:1、约4.9:1、约5:1、约5.1:1、约5.2:1、约5.3:1、约5.4:1或
约5.5:1的l:n比率。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子且包含约6.5:1、6.6:1、6.7:1、6.8:1、6.9:1、7:1、7.1:1、7.2:1、7.3:1、7.4:1和7.5:1的l:n比率。
[0447]
在某些实施方案中，所述lnp包含选自在表14中列出的制剂之一的脂质制剂。
[0448]
表14.示例性的含有脂质纳米颗粒的复制子
[0449]
[0450]
[0451]
[0452]
[0453]
[0454]
[0455]
[0456][0457]
治疗组合物和使用方法
[0458]
本公开内容的一个方面涉及包含本文所述的重组rna复制子或包含本文所述的重组rna复制子的颗粒的治疗组合物，以及用于治疗癌症的方法。本文所述的组合物可以以适合所需递送途径的任何方式配制。通常，制剂包括所有生理上可接受的组合物，包括其衍生物或前药、溶剂化物、立体异构体、外消旋体或互变异构体、以及任何药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0459]
在某些实施方案中，包含重组rna复制子(和任选地rna病毒基因组)的lnp在施用给受试者时能够产生溶瘤病毒，其中编码的溶瘤病毒能够减小远离施用部位的肿瘤的大小。例如，lnp的静脉内施用可能导致肿瘤组织中的复制子复制和肿瘤大小的减小。在某些实施方案中，本公开内容的lnp能够定位至远离lnp施用部位的肿瘤或癌性组织。这样的效果使得本公开内容的lnp包封的复制子能够用于治疗不易接近并因此不适合肿瘤内递送治疗的肿瘤。
[0460]
短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、
变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
[0461]
本文中使用的“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括、但不限于已经被美国食品和药品管理局批准为可接受用于用在人类或家养动物中的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括、但不限于：糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡类、动物和植物脂肪、石蜡、有机硅、皂粘土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等张盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和在药物制剂中采用的任意其它相容的物质。
[0462]“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，和与以下酸形成的盐：无机酸诸如、例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，和有机酸诸如、但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡萄庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、羟乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱诸如、例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括、但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，被取代的胺，包括天然存在的被取代的胺、环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、地阿诺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基还原葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
[0463]
本公开内容提供了杀死癌细胞或靶细胞的方法，包含在足以将所述组合物细胞内递送至癌细胞的条件下，将所述细胞暴露于本文所述的rna多核苷酸或颗粒或其组合物。本文中使用的“杀死癌细胞”表示癌细胞借助于细胞凋亡或坏死的死亡。通过本领域已知的方法，包括、但不限于肿瘤大小测量、细胞计数和流式细胞计量术(用于检测细胞死亡标志物诸如膜联蛋白v和碘化丙啶的掺入)，可以确定癌细胞的杀死。
[0464]
本公开内容进一步提供了在有此需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，其中将有效量的本文所述的治疗组合物施用给所述受试者。施用途径自然会随着所治疗的疾病的位置和性质而变化，并且可以包括例如真皮内、透皮、真皮下、胃肠外、鼻、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服施用。本文所述的包封的多核苷酸组合物可用于治疗转移性癌症，其中全身施用可能是将所述组合物递送至多
个器官和/或细胞类型所必需的。因此，在某些实施方案中，全身施用本文所述的组合物。
[0465]
本公开内容进一步提供了针对疾病免疫受试者的方法，其中将有效量的本文所述的治疗组合物施用给所述受试者。施用途径自然会随着免疫接种剂的位置和性质而变化，并且可以包括例如真皮内、透皮、真皮下、胃肠外、鼻、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服施用。
[0466]
本公开内容进一步提供了用于用作药物的本公开内容的颗粒、本公开内容的载体、本公开内容的重组rna复制子或其组合物。在某些实施方案中，所述药物是用于杀死癌细胞。在某些实施方案中，所述药物是用于治疗癌症。在某些实施方案中，所述药物是用于针对疾病免疫接种。
[0467]
在本文中互换使用的“有效量”或“有效剂量”表示导致疾病或病症的症状的改善或补救的本文所述组合物的量和/或剂量。所述改善是疾病或病症、或者疾病或病症的症状的任何改善或补救。所述改善是可观察的或可测量的改善，或者可以是受试者的健康状况的总体感觉的改善。因此，本领域技术人员认识到，治疗可以改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。受试者的改善可能包括、但不限于减少的肿瘤负荷、减少的肿瘤细胞增殖、增加的肿瘤细胞死亡、免疫途径的活化、增加的达到肿瘤进展的时间、减少的癌症疼痛、增加的存活或生活质量的改善。因此，基于药剂的性质，诸如质量/体积、细胞数目/体积、颗粒数目/体积、(药剂的质量)/(受试者的质量)、细胞数目/(受试者的质量)或颗粒数目/(受试者的质量)，可以以多种方式表示特定药剂的有效量。特定药剂的有效量也可以表示为半数最大有效浓度(ec
50
)，其表示导致特定生理学应答的幅度为参比水平和最大应答水平之间的一半的药剂浓度。
[0468]
在某些实施方案中，有效剂量的施用可以通过施用单剂量的本文所述的组合物来实现。本文中使用的“剂量”表示一次递送的组合物的量。在某些实施方案中，将重组rna分子的剂量测量为50％组织培养物感染剂量(tcid
50
)。在某些实施方案中，所述tcid
50
是至少约103至109tcid
50
/ml，例如，至少约103tcid
50
/ml、约104tcid
50
/ml、约105tcid
50
/ml、约106tcid
50
/ml、约107tcid
50
/ml、约108tcid50/ml或约109tcid50/ml。在某些实施方案中，可以通过给定体积中的颗粒数目(例如，颗粒/ml)来测量剂量。在某些实施方案中，通过在每个颗粒中存在的本文所述的rna多核苷酸的基因组拷贝数(例如，颗粒数目/ml，其中每个颗粒包含所述多核苷酸的至少一个基因组拷贝)，可以进一步细化剂量。在某些实施方案中，有效剂量的递送可能需要施用多剂量的本文所述的组合物。因此，有效剂量的施用可能需要施用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多剂本文所述的组合物。
[0469]
在其中施用多剂本文所述组合物的实施方案中，每一剂不需要由相同的操作者和/或在相同的地理位置施用。此外，可以根据预定的时间表进行定量施用。例如，预定的定量施用计划可以包含每天、每隔一天、每周、每两周、每月、每两个月、每年、每半年等施用一剂本文所述的组合物。对于给定的患者，可以在必要时调整预定的定量施用计划(例如，可以增加或减少施用的组合物的量，和/或可以增加或减少剂量的频率，和/或可以增加或减少要施用的剂量总数)。
[0470]
定义
[0471]
在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括在列举的范围内的任意整数的值，且当适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之
一)，除非另外指出。应当理解，本文中使用的术语“一个”和“一种”表示所列举的组分中的“一个/种或多个/种”，除非另外指出。备选方案(例如，“或”)的应用应当被理解为是指备选方案中的任一个、两个或它们的任意组合。本文中使用的术语“包括”和“包含”同义地使用。本文中使用的“多个”可以表示一个或多个组分(例如，一个或多个mirna靶序列)。
[0472]
如在本技术中使用的，术语“约”和“大约”等同地使用。在本技术中使用的任何数字，不论有没有约/大约，都意在覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”表示在所述参考值的任一个方向(大于或更小)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(这样的数字会超过可能值的100％的情况除外)。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”表示在所述参考值的任一个方向(大于或更小)落入10％内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(这样的数字会超过可能值的100％的情况除外)。
[0473]“减少”或“降低”表示与参考值相比，特定值减少或降低至少5％，例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。特定值的减少或降低也可以表示为该值与参考值相比的倍数变化，例如，与参考值相比，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多的减少。
[0474]“增加”表示与参考值相比，特定值增加至少5％，例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。特定值的增加也可以表示为该值与参考值相比的倍数变化，例如，与参考值的水平相比，至少1倍、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多的增加。
[0475]
术语“序列同一性”表示在两个多核苷酸或多肽序列之间相同且在相同相对位置的碱基或氨基酸的百分比。因此，一个多核苷酸或多肽序列与另一多核苷酸或多肽序列相比具有一定百分比的序列同一性。对于序列对比，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其进行对比。术语“参考序列”表示与测试序列进行对比的分子。术语“突变”表示核酸或氨基酸的置换、删除或添加。术语“保守突变”表示多肽中单个氨基酸或少量氨基酸的置换，其中新氨基酸具有与被置换的氨基酸相似的化学和物理性质(电荷、亲水性等)。
[0476]“互补”表示通过碱基堆积和特异性氢键合在两个包含天然或非天然存在的(例如，如上所述修饰的)碱基(核苷酸)或其类似物的序列之间配对的能力。例如，如果在核酸的一个位置的碱基能够与靶标的相应位置的碱基形成氢键，则认为在该位置的碱基相互互补。核酸可以包含通用碱基或惰性脱碱基间隔物，它们对氢键合没有正或负贡献。碱基配对可能包括规范的沃森-克里克碱基配对和非-沃森-克里克碱基配对(例如，wobble碱基配对和hoogsteen碱基配对)。应当理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(a)与胸苷型碱基(t)或尿嘧啶型碱基(u)互补，胞嘧啶型碱基(c)与鸟苷型碱基(g)互补，并且通用碱基诸如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可以与任何a、c、u或t杂交并被认为是互补的。nichols等人,nature,1994；369:492-493和loakes等人,nucleic acids res.,1994；22:4039-4043。肌苷(i)在本领域中也已经被认为是通用碱基并且被认为与任何a、c、u或t互补。参见watkins和santalucia,nucl.acids research,2005；33(19):6258-6267。
[0477]“表达盒”或“表达构建体”表示可操作地连接至启动子的多核苷酸序列。
[0478]“可操作地连接”表示并列连接，其中如此描述的组件处于允许它们以它们的预期方式起作用的关系。例如，如果启动子影响多核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸序列；如果切割多肽允许有效负载分子在某些合乎需要的条件下分离(例如，与多肽的其余部分)，则所述切割多肽可操作地连接至所述有效负载分子。
[0479]
术语”受试者”包括动物，诸如哺乳动物。在某些实施方案中，所述哺乳动物是灵长类动物。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人。在某些实施方案中，受试者是家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；或驯化的动物诸如狗和猫。在某些实施方案中(例如，特别是在研究环境中)，受试者是啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物、或猪诸如近交猪等。术语”受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。在某些实施方案中，本公开内容的方法用于治疗人受试者。本公开内容的方法还可以用于治疗非人灵长类动物(例如，猴、狒狒和黑猩猩)、小鼠、大鼠、牛、马、猫、狗、猪、兔、山羊、鹿、绵羊、雪貂、沙鼠、豚鼠、仓鼠、蝙蝠、禽类和爬行动物。
[0480]
本文中使用的“预防”或“防止”可以指完全预防疾病的症状、延迟疾病的症状的发作、或减轻随后发展的疾病症状的严重程度。
[0481]
本文中的“癌症”表示或描述哺乳动物中的生理状况，其通常以失调的细胞生长为特征。癌症的例子包括、但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤、成骨性肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、平滑肌肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤和软骨肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、滑膜瘤、许旺细胞瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。这样的癌症的更具体的例子包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、小细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)(例如，肾细胞癌)、神经内分泌癌、前列腺癌(例如，阉割抗性的神经内分泌前列腺癌)、外阴癌、甲状腺癌、b-细胞慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)、边缘区淋巴瘤(mzl)、梅克尔细胞癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤、尤因瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔曼瘤、睾丸肿瘤、肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤(例如，恶性神经胶质瘤)、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，waldenstrom氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常疾病、重链病、神经内分泌肿瘤、许旺细胞瘤和其它癌、以及头颈癌。在某些实施方案中，所述癌症是神经内分泌癌。此外，使用本文中公开的公开内容也可以治疗良性的(即，非癌性的)过度增殖性疾病、障碍和病症，包括良性前列腺肥大(bph)、脑膜瘤、许旺细胞瘤、神经纤维瘤病、瘢痕疙瘩、肌瘤和子宫肌瘤等。
[0482]“施用”在本文中表示将药剂或组合物引入受试者。
[0483]
本文中使用的“治疗”表示将药剂或组合物递送至受试者以影响生理结果。在某些实施方案中，治疗表示治疗哺乳动物(例如人)的疾病，包括(a)抑制疾病，即阻止疾病发展
或预防疾病进展；(b)缓解疾病，即造成疾病状态的消退；和(c)治愈疾病。
[0484]
细胞的“群体”表示大于1的任何细胞数量，但优选地是至少1x103个细胞、至少1x104个细胞、至少1x105个细胞、至少1x106个细胞、至少1x107个细胞、至少1x108个细胞、至少1x109个细胞、至少1x10
10
个细胞或更多细胞。细胞群体可以表示体外群体(例如，培养中的细胞群体)或体内群体(例如，存在于特定组织中的细胞群体)。
[0485]“效应子功能”表示与针对靶细胞或靶抗原的免疫应答的产生、维持和/或增强相关的免疫细胞的功能。
[0486]
术语“微rna”、“mirna”和“mir”在本文中可互换地使用并表示长度为约21-25个核苷酸的小的非编码内源性rna，其通过指导其靶信使rna(mrna)的降解或翻译抑制来调节基因表达。
[0487]
本文中使用的术语“组合物”表示本文所述的重组rna分子或颗粒包封的重组rna分子的制剂，其能够施用或递送至受试者或细胞。
[0488]
术语“具有复制能力的病毒基因组”表示编码病毒复制和感染性病毒颗粒的产生所必需的所有病毒基因的病毒基因组。
[0489]
术语“溶瘤病毒”表示已经被修饰成或天然地优先感染癌细胞的病毒。
[0490]
术语“载体”在本文中用于表示能够转移或运输另一个核酸分子的核酸分子。
[0491]
术语“复制子”表示能够指导自身拷贝产生的核酸。本文中使用的术语“复制子”包括rna以及dna。通常，病毒复制子至少含有病毒的基因组的一部分。病毒复制子可以含有不完整病毒基因组，但仍能够指导自身拷贝的产生。
[0492]
术语“上游”当参考核酸使用时表示相对于参考核苷酸序列朝向5'定位的核苷酸序列，并且当参考多肽使用时表示相对于参考氨基酸序列朝向n-端定位氨基酸序列。术语“下游”当参考核酸使用时表示相对于参考核苷酸序列朝向3'定位的核苷酸序列，并且当参考多肽使用时表示相对于参考氨基酸序列朝向c-端定位氨基酸序列。
[0493]
术语“顺式作用复制元件”表示rna病毒或复制子的rna基因组的一部分，其必须以顺式存在，也就是说，作为复制的必要条件作为每条病毒链的一部分存在。在某些实施方案中，所述顺式作用复制元件由病毒rna的一个或多个区段组成。
[0494]
本文中使用的与氨基酸或核酸位置相关的术语“与
……
对应”或“对应于”表示当将第一多肽/多核苷酸序列和参考多肽/多核苷酸序列比对时，与参考多肽/多核苷酸序列中的给定氨基酸/核酸对齐的第一多肽/多核苷酸序列中的位置。本领域技术人员使用为此目的设计的软件执行比对，例如，clustal omega 1.2.4版，用该版本的默认参数。
[0495]
分子和细胞生物化学的一般方法可以参见标准教科书诸如molecular cloning:a laboratory manual,第3版(sambrook等人,harbor laboratory press 2001)；short protocols in molecular biology,第4版(ausubel等人.编,john wiley&sons 1999)；protein methods(bollag等人,john wiley&sons 1996)；nonviral vectors for gene therapy(wagner等人.编,academic press 1999)；viral vectors(kaplift和loewy编,academic press 1995)；immunology methods manual(i.lefkovits编，academic press 1997)；和cell and tissue culture:laboratory procedures in biotechnology(doyle和griffiths,john wiley&sons 1998)，其公开内容通过引用并入本文。
[0496]
其它编号的实施方案
[0497]
本公开内容的其它编号的实施方案提供如下：
[0498]
实施方案1.一种重组rna复制子，其包含：
[0499]
小核糖核酸病毒基因组，其中所述小核糖核酸病毒基因组包含在一个或多个蛋白编码区中的缺失或截短；和
[0500]
异源多核苷酸。
[0501]
实施方案2.实施方案1的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒基因组包含在一个或多个vp编码区中的缺失或截短。
[0502]
实施方案3.实施方案1或2的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒基因组包含在vp1、vp3和vp2编码区中的每一个中的缺失或截短。
[0503]
实施方案4.实施方案1-3中的任一个的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒基因组包含vp1和vp3编码区的缺失以及vp2编码区的截短。
[0504]
实施方案5.实施方案1-4中的任一个的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。
[0505]
实施方案6.实施方案1-5中的任一个的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp、至少2500bp或至少3000bp。
[0506]
实施方案7.实施方案6的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含至少2000bp。
[0507]
实施方案8.实施方案1-7中的任一个的重组rna复制子，其中所述缺失的位点或所述截短的位点包含所述异源多核苷酸
[0508]
实施方案9.实施方案1-7中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸插入在2a编码区和2b编码区之间。
[0509]
实施方案10.实施方案1-7中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸插入在3d编码区和3’非翻译区(utr)之间。
[0510]
实施方案11.实施方案1-10中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸包含至少1000bp、至少2000bp或至少3000bp。
[0511]
实施方案12.实施方案1-11中的任一个的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒是塞内卡谷病毒(svv)。
[0512]
实施方案13.实施方案12的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含根据seq id no:1的编号在核苷酸1261和3477(包括端点)之间的一个或多个核苷酸。
[0513]
实施方案14.实施方案12的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含根据seq id no:1的编号的核苷酸1261至3477(包括端点)。
[0514]
实施方案15.实施方案12或13的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp或至少2000bp。
[0515]
实施方案16.实施方案15的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含至少2000bp。
[0516]
实施方案17.实施方案12至16中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含5’前导蛋白编码序列。
[0517]
实施方案18.实施方案12至17中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含vp4编码区。
[0518]
实施方案19.实施方案12至18中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含vp2编码区或其截短体。
[0519]
实施方案20.实施方案19的重组rna复制子，其中所述svv基因组从5’至3’方向包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体。
[0520]
实施方案21.实施方案20的重组rna复制子，其中包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区和vp2编码区或其截短体的svv基因组的部分与seq id no:1的核苷酸1至1260具有至少90％序列同一性。
[0521]
实施方案22.实施方案20或21的重组rna复制子，其中所述svv基因组从5’至3’方向包含5’前导蛋白编码序列、vp4编码区、vp2编码区或其截短体和异源多核苷酸。
[0522]
实施方案23.实施方案1-22中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含顺式作用复制元件(cre)。
[0523]
实施方案24.实施方案23的重组rna复制子，其中所述cre包含10-200bp。
[0524]
实施方案25.实施方案23或24的重组rna复制子，其中所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1000至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。
[0525]
实施方案26.实施方案23或24的重组rna复制子，其中所述cre包含在与根据seq id no:1的核苷酸1117至核苷酸1260对应的区域内的一个或多个核苷酸。
[0526]
实施方案27.实施方案23-26中的任一个的重组rna复制子，其中所述cre包含与seq id no:149具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。
[0527]
实施方案28.实施方案12-27中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组进一步包含2a编码区。
[0528]
实施方案29.实施方案28的重组rna复制子，其中所述2a编码区位于vp2编码区或其截短体和异源多核苷酸之间。
[0529]
实施方案30.实施方案12-29中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区中的一个或多个。
[0530]
实施方案31.实施方案12-29中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。
[0531]
实施方案32.实施方案31的重组rna复制子，其中所述svv基因组从5’至3’包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区。
[0532]
实施方案33.实施方案32的重组rna复制子，其中包含2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、3cpro编码区和3d(rdrp)编码区的svv基因组的部分与根据seq id no:1的核苷酸3505至7310具有至少90％序列同一性。
[0533]
实施方案34.实施方案30-33中的任一个的重组rna复制子，其中所述svv基因组从5’至3’包含异源多核苷酸和2b编码区。
[0534]
实施方案35.实施方案1至11中的任一个的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒是柯萨奇病毒。
[0535]
实施方案36.实施方案35的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含在根据seq id no:3的编号的核苷酸717至3332(包括端点)之间的一个或多个核苷酸。
[0536]
实施方案37.实施方案35的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含根据seq id no:3的编号的核苷酸717至3332(包括端点)。
[0537]
实施方案38.实施方案35或36的重组rna复制子，其中所述缺失或所述截短包含至少500bp、至少1000bp、至少1500bp、至少2000bp或至少2600bp。
[0538]
实施方案39.实施方案35至38中的任一个的重组rna复制子，其中所述柯萨奇病毒基因组包含5’utr。
[0539]
实施方案40.实施方案35至39中的任一个的重组rna复制子，其中包含5’utr的柯萨奇病毒基因组的部分与seq id no:4具有至少90％序列同一性。
[0540]
实施方案41.实施方案35至40中的任一个的重组rna复制子，其中所述柯萨奇病毒基因组包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr中的一个或多个。
[0541]
实施方案42.实施方案35至40中的任一个的重组rna复制子，其中所述柯萨奇病毒基因组包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。
[0542]
实施方案43.实施方案42的重组rna复制子，其中所述柯萨奇病毒基因组从5’至3’方向包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr。
[0543]
实施方案44.实施方案42的重组rna复制子，其中包含2a编码区、2b编码区、2c编码区、3a编码区、3b编码区、vpg编码区、3c编码区、3d pol编码区和3’utr的柯萨奇病毒基因组的部分与seq id no:3中的核苷酸3492至7435具有至少90％序列同一性。
[0544]
实施方案45.实施方案41至44中的任一个的重组rna复制子，其中所述柯萨奇病毒基因组从5’至3’包含5’utr、异源多核苷酸和2a编码区。
[0545]
实施方案46.实施方案1至11中的任一个的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒是脑心肌炎病毒(emcv)。
[0546]
实施方案47.实施方案9和11-46中的任一个的重组rna复制子，其中所述重组rna复制子包含插入在异源多核苷酸和2b编码区之间的内部核糖体进入位点(ires)。
[0547]
实施方案48.实施方案1至47中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸编码一个或多个有效负载分子。
[0548]
实施方案49.实施方案1至47中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸编码两个或更多个有效负载分子。
[0549]
实施方案50.实施方案49的重组rna复制子，其中所述两个或更多个有效负载分子通过一个或多个切割多肽可操作地连接。
[0550]
实施方案51.实施方案50的重组rna复制子，其中所述切割多肽包含2a家族自切割肽、3c切割位点、弗林蛋白酶位点、igsf1多肽或hiv蛋白酶位点。
[0551]
实施方案52.实施方案51的重组rna复制子，其中所述切割多肽包含igsf1多肽，且其中所述igsf1多肽包含与seq id no:75具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0552]
实施方案53.实施方案51的重组rna复制子，其中所述切割多肽包含hiv蛋白酶位点。
[0553]
实施方案54.实施方案51的重组rna复制子，其中所述切割多肽包含2a家族自切割
肽。
[0554]
实施方案55.实施方案50至54中的任一个的重组rna复制子，其中所述切割多肽包含弗林蛋白酶位点。
[0555]
实施方案56.实施方案50至55中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸编码包含两个或更多个有效负载分子和切割多肽的多肽，所述多肽从n-端至c-端包含：n
’‑
有效负载分子1-切割多肽-有效负载分子2-c’。
[0556]
实施方案57.实施方案53的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸进一步包含编码hiv蛋白酶的编码区，且其中所述异源多核苷酸包含编码多肽的编码区，所述多肽从n-端至c-端包含：n
’‑
有效负载分子1-hiv蛋白酶位点-hiv蛋白酶-hiv蛋白酶位点-有效负载分子2-c’。
[0557]
实施方案58.实施方案57的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸进一步包含编码第三有效负载分子的编码区，且其中所述异源多核苷酸包含编码多肽的编码区，所述多肽从n-端至c-端包含：
[0558]n’‑
有效负载分子1-hiv蛋白酶位点-hiv蛋白酶-hiv蛋白酶位点-有效负载分子2-hiv蛋白酶位点-有效负载分子3-c’。
[0559]
实施方案59.实施方案56至58中的任一个的重组rna复制子，进一步包含在所编码的多肽的c-端处的切割多肽。
[0560]
实施方案60.实施方案48至59中的任一个的重组rna复制子，其中所述有效负载分子选自荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子、抗原、能够结合细胞表面受体的抗原结合分子和细胞表面受体的配体。
[0561]
实施方案61.实施方案48至59中的任一个的重组rna复制子，其中所述有效负载分子选自：
[0562]
a)一种或多种细胞因子，包含ifnγ、gm-csf、il-2、il-12、il-15、il-18、il-23和il-36γ；
[0563]
b)一种或多种趋化因子，包含cxcl10、ccl4、ccl5和ccl21；
[0564]
c)一种或多种抗体，包含抗-pd1-vhh-fc抗体、抗-cd47-vhh-fc抗体和抗-tgfβ-vhh(或scfv)-fc抗体；
[0565]
d)一种或多种双组分多肽，包含结合dll3和效应细胞靶抗原的双组分多肽、结合fap和效应细胞靶抗原的双组分多肽、以及结合epcam和效应细胞靶抗原的双组分多肽；
[0566]
e)一种或多种肿瘤相关抗原，包含存活素、mage家族蛋白和根据表6的所有抗原；
[0567]
f)一种或多种肿瘤新抗原；
[0568]
g)一种或多种结合mhc-肽抗原复合物的双组分多肽；
[0569]
h)一种或多种促融合蛋白，包含单纯疱疹病毒(hsv)ul27/糖蛋白b/gb，hsv ul53/糖蛋白k/gk，呼吸道合胞体病毒(rsv)f蛋白，fastp15，vsv-g，syncitin-1(来自人内源性逆转录病毒-w(herv-w))或syncitin-2(来自hervfrde1)，副粘病毒sv5-f，麻疹病毒-h，麻疹病毒-f，以及来自逆转录病毒或慢病毒诸如长臂猿白血病病毒(galv)、鼠白血病病毒(mlv)、mason-pfizer猴病毒(mpmv)和马传染性贫血病毒(eiav)的糖蛋白，任选地除去了r跨膜肽(r-版本)；
[0570]
i)一种或多种其它有效负载分子，包含il15r、pgdh、ada、ada2、hyal1、hyal2、
chips、mlkl(或仅它的4hb结构域)、gsdmd(或它的l192a突变体、或它的氨基酸1-233片段、或它的具有l192a突变的氨基酸1-233片段)、gsdme(或它的氨基酸1-237片段)、hmgb1(或仅它的box b结构域)、蜂毒肽(例如，α-蜂毒肽)、smac/diablo(或它的氨基酸56-239片段)、蛇laao、蛇解聚素、瘦素、flt3l、trail、gasdermin d或其截短体和gasdermin e或其截短体；
[0571]
j)一种或多种来自病原体的抗原，所述病原体包含登革热病毒、切昆贡亚病毒、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒、sars-cov-2、冠状病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、甲型流感病毒、流感b病毒和兽医病毒；或
[0572]
k)它们的任意组合。
[0573]
实施方案62.实施方案49至59中的任一个的重组rna复制子，其中所述两个或更多个有效负载分子选自荧光蛋白、酶、细胞因子、趋化因子、能够结合细胞表面受体的抗原结合分子和细胞表面受体的配体。
[0574]
实施方案63.实施方案49至59中的任一个的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸编码两个或更多个有效负载分子，其包含：
[0575]
a.il-2和il-36γ；
[0576]
b.cxcl10以及结合fap和cd3的抗原结合分子；
[0577]
c.il-2以及结合dll3和cd3的抗原结合分子；
[0578]
d.il-36γ以及结合dll3和cd3的抗原结合分子；或
[0579]
e.il-2、il-36γ以及结合dll3和cd3的抗原结合分子。
[0580]
实施方案64.实施方案1至63中的任一个的重组rna复制子，进一步包含微rna(mirna)靶序列(mir-ts)盒，其包含一个或多个mirna靶序列。
[0581]
实施方案65.实施方案64的重组rna复制子，其中所述一个或多个mirna包含mir-124、mir-1、mir-143、mir-128、mir-219、mir-219a、mir-122、mir-204、mir-217、mir-137和mir-126。
[0582]
实施方案66.一种重组dna分子，其从5’至3’包含启动子序列、5’连接切割序列、编码实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子的多核苷酸序列和3’连接切割序列。
[0583]
实施方案67.实施方案66的重组dna分子，其中所述启动子序列是t7启动子序列。
[0584]
实施方案68.实施方案66或67的重组dna分子，其中所述5’连接切割序列是核酶序列且所述3’连接切割序列是核酶序列。
[0585]
实施方案69.实施方案68的重组dna分子，其中所述5’核酶序列是锤头核酶序列且其中所述3’核酶序列是丁型肝炎病毒核酶序列。
[0586]
实施方案70.实施方案66或67的重组dna分子，其中所述5’连接切割序列是核酶序列且所述3’连接切割序列是限制性酶识别序列。
[0587]
实施方案71.实施方案70的重组dna分子，其中所述5’核酶序列是锤头核酶序列、手枪核酶序列或经修饰的手枪核酶序列。
[0588]
实施方案72.实施方案70或71的重组dna分子，其中3’限制性酶识别序列是iis型限制性酶识别序列。
[0589]
实施方案73.实施方案72的重组dna分子，其中所述iis型识别序列是sapi识别序列。
[0590]
实施方案74.实施方案66或67的重组dna分子，其中所述5’连接切割序列是rna酶h
引物结合序列且所述3’连接切割序列是限制性酶识别序列。
[0591]
实施方案75.一种生产实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子的方法，包含体外转录实施方案66-74中的任一个的dna分子和纯化得到的重组rna复制子。
[0592]
实施方案76.一种组合物，其包含有效量的实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子和适用于施用给哺乳动物受试者的载体。
[0593]
实施方案77.一种载体，其包含实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子。
[0594]
实施方案78.实施方案77的载体，其中所述载体是病毒载体。
[0595]
实施方案79.实施方案77的载体，其中所述载体是非病毒载体。
[0596]
实施方案80.一种颗粒，其包含实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子。
[0597]
实施方案81.实施方案80的颗粒，其中所述颗粒选自纳米颗粒、外泌体、脂质体和脂质体复合物。
[0598]
实施方案82.实施方案81的颗粒，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒(lnp)，其包含阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和磷脂-聚合物缀合物。
[0599]
实施方案83.实施方案82的颗粒，其中所述阳离子脂质选自dlindma、dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma(mc3)、ss-lc(以前名称:ss-18/4pe-13)、ss-ec(以前名称:ss-33/4pe-15)、ss-oc、ss-op、9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((z)-壬-2-烯-1-基)酯(l-319)或n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)。
[0600]
实施方案84.实施方案82或83的颗粒，其中所述辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)；和胆固醇。
[0601]
实施方案85.实施方案82的颗粒，其中所述阳离子脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)，且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)。
[0602]
实施方案86.实施方案82-85中的任一个的颗粒，其中所述peg-脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg)；1,2-二棕榈酰基-消旋-甘油甲氧基聚乙二醇(dpg-peg)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dsg-peg)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dsg-peg)；1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dmg-peg)；和1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯(dmg-peg),或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg-胺)。
[0603]
实施方案87.实施方案82-86中的任一个的颗粒，其中所述peg-脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-5000](dspe-peg5k)；1,2-二棕榈酰基-消旋-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(dpg-peg2k)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-5000(dsg-peg5k)；1,2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-2000(dsg-peg2k)；1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-5000(dmg-peg5k)；和1,2-二肉豆蔻酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯-2000(dmg-peg2k)。
[0604]
实施方案88.实施方案82的颗粒，其中所述阳离子脂质包含ss-oc，其中所述一种或多种辅助脂质包含胆固醇(chol)和dspc，且其中所述磷脂-聚合物缀合
物包含dpg-peg2000。
[0605]
实施方案89.实施方案88的颗粒，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是a:b:c:d，其中：
[0606]
a.a＝40％-60％，b＝10％-25％，c＝20％-30％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0607]
b.a＝45％-50％，b＝20％-25％，c＝25％-30％，且d＝0％-1％并且其中a b c d＝100％
[0608]
c.a＝40％-60％，b＝10％-30％，c＝20％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0609]
d.a＝40％-60％，b＝10％-30％，c＝25％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0610]
e.a＝45％-55％，b＝10％-20％，c＝30％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％；
[0611]
f.a＝45％-50％，b＝10％-15％，c＝35％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％；
[0612]
g.a＝45％-65％，b＝5％-20％，c＝20％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0613]
h.a＝50％-60％，b＝5％-15％，c＝30％-45％，且d＝0％-3％并且其中a b c d＝100％；
[0614]
i.a＝55％-60％，b＝5％-15％，c＝30％-40％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％；
[0615]
j.a＝55％-60％，b＝5％-10％，c＝30％-35％，且d＝1％-2％并且其中a b c d＝100％。
[0616]
实施方案90.实施方案88的颗粒，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是：
[0617]
a.约49:22:28.5:0.5；
[0618]
b.约49:11:38.5:1.5；或
[0619]
c.约58:7:33.5:1.5。
[0620]
实施方案91.实施方案88的颗粒，其中ss-oc:dspc:chol:dpg-peg2k(作为总脂质含量的百分比)的比率是约49:22:28.5:0.5。
[0621]
实施方案92.实施方案82的颗粒，其中所述阳离子脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)，且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dlpe)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)。
[0622]
实施方案93.实施方案82或92的颗粒，进一步包含peg-脂质，其中所述peg-脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(dspe-peg)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)](dspe-peg-胺)。
[0623]
实施方案94.实施方案80-93中的任一个的颗粒，进一步包含编码溶瘤病毒的第二重组rna分子。
[0624]
实施方案95.实施方案94的颗粒，其中所述溶瘤病毒是小核糖核酸病毒。
[0625]
实施方案96.实施方案95的颗粒，其中所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。
[0626]
实施方案97.实施方案95的颗粒，其中所述小核糖核酸病毒是塞内卡谷病毒(svv)。
[0627]
实施方案98.实施方案95的颗粒，其中所述小核糖核酸病毒是柯萨奇病毒。
[0628]
实施方案99.实施方案95的颗粒，其中所述小核糖核酸病毒是脑心肌炎病毒(emcv)。
[0629]
实施方案100.一种治疗组合物，其包含多个根据实施方案82-99中的任一个的脂质纳米颗粒。
[0630]
实施方案101.实施方案100的治疗组合物，其中所述多个lnp具有约50nm至约120nm的平均大小。
[0631]
实施方案102.实施方案100的治疗组合物，其中所述多个lnp具有约100nm的平均大小。
[0632]
实施方案103.实施方案100-102中的任一个的治疗组合物，其中所述多个lnp具有约20mv至约-20mv、约10mv至约-10mv、约5mv至约-5mv、或约20mv至约-40mv、-50mv至约-20mv、约-40mv至约-20mv、或约-30mv至约-20mv之间的平均ζ电位。
[0633]
实施方案104.实施方案103的治疗组合物，其中所述多个lnp具有约-30mv、约-31mv、约-32mv、约-33mv、约-34mv、约-35mv、约-36mv、约-37mv、约-38mv、约-39mv或约-40mv的平均ζ电位。
[0634]
实施方案105.一种杀死癌细胞的方法，其包含将所述癌细胞暴露于实施方案80-97中的任一个的颗粒、实施方案77-79中的任一个的载体、实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子、或其组合物。
[0635]
实施方案106.实施方案105的方法，其中在体内、在体外或离体执行所述方法。
[0636]
实施方案107.一种治疗受试者中的癌症的方法，其包含给遭受癌症的受试者施用有效量的实施方案80-97中的任一个的颗粒、实施方案77-79中的任一个的载体、实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子、或其组合物。
[0637]
实施方案108.实施方案107的方法，其中将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物静脉内地、鼻内地、作为吸入剂施用，或直接注射进肿瘤中。
[0638]
实施方案109.实施方案107或108的方法，其中将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物重复施用给所述受试者。
[0639]
实施方案110.实施方案107-109中的任一个的方法，其中所述受试者是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、马、非人灵长类动物或人。
[0640]
实施方案111.实施方案107-110中的任一个的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌(例如，阉割抗性的神经内分泌前列腺癌)、肝癌、胃癌、头颈癌、甲状腺癌、恶性神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、b-细胞慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)、肉瘤、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤、膀胱癌、边缘区淋巴瘤(mzl)、梅克尔细胞癌和肾细胞癌。
[0641]
实施方案112.实施方案111的方法，其中：
[0642]
a.所述肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌；
[0643]
b.所述肝癌是肝细胞癌(hcc)；和/或
[0644]
c.所述前列腺癌是治疗引发的神经内分泌前列腺癌。
[0645]
实施方案113.实施方案111的方法，其中所述癌症是神经内分泌癌。
[0646]
实施方案114.一种针对疾病免疫受试者的方法，其包含给所述受试者施用有效量的实施方案80-97中的任一个的颗粒、实施方案77-79中的任一个的载体、实施方案1-65中的任一个的重组rna复制子、或其组合物。
[0647]
实施方案115.实施方案114的方法，其中将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物静脉内地、肌肉内地、真皮内地、鼻内地或作为吸入剂施用。
[0648]
实施方案116.实施方案114或115的方法，其中将所述颗粒、所述重组rna复制子或其组合物重复施用给所述受试者。
[0649]
实施方案117.实施方案114至116中的任一个的方法，其中所述疾病是传染性疾病。
[0650]
实施方案118.实施方案117的方法，其中所述传染性疾病由病原体之一造成，所述病原体包含登革热病毒、切昆贡亚病毒、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒、sars-cov-2、冠状病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、黄病毒科病毒、甲型流感病毒、流感b病毒和兽医病毒。
[0651]
实施方案119.一种重组rna复制子，其包含小核糖核酸病毒基因组和异源多核苷酸。
[0652]
实施方案120.实施方案119的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸插入在2a编码区和2b编码区之间。
[0653]
实施方案121.实施方案119的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸插入在5’utr和2a编码区之间。
[0654]
实施方案122.实施方案119的重组rna复制子，其中所述异源多核苷酸插入在3d编码区和3’utr之间。
[0655]
实施方案123.实施方案119-122中的任一个的重组rna复制子，其中所述小核糖核酸病毒选自塞内卡病毒、心病毒和肠道病毒。
[0656]
实施例
[0657]
给出以下实施例是为了说明本公开内容的各种实施方案的目的，并不意味着以任何方式限制本公开内容。本发明的实施例，连同本文所述的方法一起，目前是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不旨在限制本公开内容的范围。本领域技术人员将想到被包括在由权利要求的范围限定的本公开内容的精神内的其中的变化和其它用途。
[0658]
实施例1：异源多核苷酸的插入会减少svv病毒复制
[0659]
进行实验以评估塞内卡谷病毒(svv)的病毒复制能力，所述病毒在病毒基因组中插入了不同长度的异源多核苷酸(表15)。简而言之，在第1天用0.015pmol的编码重组svv病毒基因组的质粒转染nci-h1299细胞。在第4天收获细胞并过滤上清液以收集病毒。在第5天，用收集的病毒感染nci-h446细胞并进行ctg测定以估计病毒复制率。结果显示在图2和表15中。异源多核苷酸的插入造成病毒复制率的降低。
[0660]
表15.包含异源多核苷酸的svv的病毒复制
[0661]
构建体有效负载大小(bp)ic50bv-svv-wtn/a8.03e-09bv-svv-mcherry7021.09e-06bv-svv-nluc5132.36e-05bv-svv-mcxcl102948.55e-05bv-svv-m_scil1216294.43e-01bv-svv-mfap-cd3-bite15181.80e 00bv-svv-mgmcsf4231.90e 00
[0662]
实施例2：在vp2区域内的svv顺式作用复制元件(cre)的鉴定
[0663]
进行实验以评估在编码一种或多种vp蛋白的病毒基因组区域内的缺失/截短是否影响svv病毒复制。根据表16和图3a产生包含mcherry报道基因以及编码vp蛋白的区域中的缺失和/或截短的svv衍生出的重组rna复制子。通过体外t7转录产生相应的重组rna复制子。用所得的rna转染nci-h1299细胞，并在转染以后24小时评价mcherry表达。结果表明，1599bp-3478bp之间的缺失对svv病毒复制具有最小影响，而1116bp-1599bp之间的核苷酸缺失(在vp2编码区内)大大降低了svv病毒复制(图3b)。因此，顺式作用复制元件(或顺式作用复制元件的至少一部分)存在于svv病毒基因组的1116bp-1599bp之间。
[0664]
表16.在vp编码区中具有缺失的svv复制子
[0665][0666]
实施例3：以最小效力损失将trunc5复制子用svvwt转衣壳化
[0667]
进行实验以评估trunc5复制子在被野生型svv转衣壳化以后是否可以保持效力并确定对野生型svv的适合性成本。简而言之，将trunc5复制子和/或野生型svv病毒基因组用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将nci-h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用0.5或1ug的每种或两种得到的rna分子共转染。在转染以后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后24小时观察mcherry的表达(图4a)。在与svvwt共转染以后检测到mcherry的表达，但在仅用复制子转染以后未检测到，表明trunc5被转衣壳化。使用在nci-h446细胞中进行的ic50测定，对比了来自svvwt转染相对于svvwt和trunc5-svv复制子共转染的过滤上清液的病毒滴度(图4b)。svvwt与trunc5的共转
染导致病毒滴度的最小降低。
[0668]
实施例4：trunc10维持cre并使有效负载容量最大化
[0669]
进行进一步实验以缩小cre的位置并分析在svv vp编码区内可耐受的缺失的长度。根据表17和图5a产生包含mcherry报道基因以及编码vp蛋白的区域中的缺失和/或截短的svv衍生出的重组rna复制子。根据在实施例2中描述的方案进行实验。图5b显示了通过体外t7 rna合成产生的rna分子，且图5c显示了各种复制子的mcherry信号。结果表明，1260bp-3478bp之间的缺失(trunc10复制子)对svv病毒复制具有最小影响。
[0670]
表17.在vp编码区中具有缺失的svv复制子
[0671][0672][0673]
实施例5：具有单个有效负载的svv复制子具有复制和转衣壳化能力
[0674]
构建复制子用于能力的体外和体内试验(图6a-6b)。如在图6b中所示，将各种有效负载(mcherry、纳米萤光素酶或egfp)插入复制子中，并根据实施例2-4中的方案试验所得复制子。结果表明，所有这些复制子都具有复制和转衣壳化能力。
[0675]
实施例6：具有鼠il-2有效负载的svv-trunc10复制子
[0676]
进行实验以试验通过svv-trunc10复制子对鼠il-2有效负载蛋白的表达。图7a显示了携带编码鼠il-2有效负载的转基因的svv-复制子trunc10的构建。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用mil-2 elisa(r&d)检测鼠il-2的表达(图7b)。此外，将病毒rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图7c)。结果表明，svv-trunc10-mil-2复制子在转染和转衣壳化以后表达和分泌mil-2，并能够合成正链和负链病毒rna。
[0677]
实施例7：具有单链mil-12有效负载的svv-trunc10复制子
[0678]
进行实验以试验通过svv-trunc10复制子对单链mil-12(scmil-12)有效负载蛋白的表达。图8a描绘了携带编码单链mil-12(scmil-12)的转基因的svv-复制子trunc10的构建，具有和没有信号序列。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol(qiagen)中。将100ul
过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图8b)，这表明所述复制子能够合成正链和负链病毒rna，且有效负载分泌与正或负病毒rna合成无关。用mil-2 elisa(r&d)检测鼠il-12的表达(图8c)，这表明trunc10-scmil-12复制子在转染和转衣壳化以后表达和分泌mil-12。信号序列的缺失减少了il-12分泌。总之，结果表明，trunc10-scmil-12和trunc10-scmil-12δss复制子能够合成正链和负链病毒rna，但是完整信号序列促进在转染和转衣壳化以后mil-12的表达和分泌。
[0679]
实施例8：svv-trunc10-hil-36γ复制子
[0680]
进行实验以试验通过svv-trunc10复制子对人il-36γ有效负载蛋白的表达。图9a描绘了携带编码人il-36γ的转基因的svv-复制子trunc10的构建，具有天然信号序列或具有il2信号序列。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用hil-36γelisa(r&d)检测hil-36γ的表达。两种复制子在转染和转衣壳化以后表达和分泌hil-36γ，并且il-2信号序列的添加没有改善表达或分泌(图9b)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析。结果(图9c)表明，两种复制子能够合成正链和负链病毒rna。总之，结果证实，svv-trunc10-hil-36γ和svv-trunc10-il2ss-hil-36γ-18s复制子在转染和转衣壳化以后表达和分泌hil-36γ，并能够合成正链和负链病毒rna。
[0681]
实施例9：在双顺反子复制子中的第二ires没有改善复制子功能
[0682]
图10a描绘了在单个有效负载下游掺入第二脑心肌炎病毒(emcv)ires的双顺反子复制子的构建。试验了第二ires对复制子功能改善的影响。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，用qiazol(qiagen)收集rna。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图10b)。结果表明，复制子的负链合成因第二ecmv ires的添加而受损，并且在hdll3-bite或mil-2有效负载下游的第二ires掺入没有改善病毒rna合成。
[0683]
实施例10：多个弗林蛋白酶t2a位点对于双顺反子双重有效负载复制子中的有效负载表达是无效的
[0684]
图11a描绘了在多个有效负载下游掺入第二脑心肌炎病毒(emcv)ires的双顺反子双重有效负载复制子的构建，其中在第一有效负载和第二有效负载(egfp)之间被弗林蛋白酶-t2a位点隔开。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，观察细胞的gfp表达，并将来自复制子和svvmcherry的共转染的上清液收集和通过0.45um过滤器过滤。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后24小时检查细胞的mcherry和gfp表达(图11b)。在trunc10-hdll3-bite-gfp-eires或trunc10-mil2-gfp-eires的转染以后或转衣壳化以后，检测到gfp的最小表达，表明双顺反子复制子具有
第二有效负载的受损表达。
[0685]
实施例11：在复制子的3’末端掺入第二有效负载的双有效负载复制子对复制无效
[0686]
图12a描绘了在复制子的3’末端在rdrp和3’utr之间掺入第二有效负载的双重有效负载复制子的构建。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用hil-36γelisa(r&d)检测hil-36γ的表达。复制子在转染以后分泌小于2pg/ml的hil-36，并且hil-36分泌在转衣壳化以后不是可检测的(图12b)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析，这表明复制子是正链和负链病毒rna合成有缺陷的(图12c)。结果证实，在3’末端处的有效负载插入导致转染以后非常低的il-36γ表达，抑制转衣壳化，并减少正链和负链合成。
[0687]
实施例12：使用trunc10复制子表达1dlt176-mtt10-dll3-vhh-cd3
[0688]
构建了用于表达his-标记的1dlt176-mtt10-dll3-vhh-cd3 lite的单个有效负载复制子。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用抗-his蛋白质印迹检测his-标记的1dlt176-mtt10-dll3-vhh-cd3 lite的表达。与lite表达相关的特定条带用箭头指示并在转染的和转衣壳化的样品的上清液中检测到(图13a)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图13b)。结果提示，trunc10-1dlt176-mtt10-dll3-vhh-cd3复制子能够表达lite有效负载，且能够合成正链和负链病毒rna。
[0689]
实施例13：使用trunc10复制子表达rdll3-αcd3-h/l-bite和t10-rdll3-αcd3-l/h-bite
[0690]
构建了用于表达his-标记的rdll3-αcd3-bite的单个有效负载复制子。h/l的方向是重链然后轻链，而l/h.a则相反。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用抗-his蛋白质印迹检测his-标记的rdll3-αcd3-bite的表达(图14a)。与lite表达相关的特定条带用箭头指示并在转染的和转衣壳化的样品的上清液中检测到。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图14b)。结果证实，两种表达trunc10-rdll3-αcd3 bite的复制子能够表达bite有效负载，能够转衣壳化，且能够合成正链和负链病毒rna。重链和轻链的取向没有影响复制子功能。
[0691]
实施例14：使用trunc10复制子表达多个有效负载的替代切割肽
[0692]
构建了在his-标记的mfap和cxcl10之间包含替代切割肽(3c、或弗林蛋白酶-3c、
或弗林蛋白酶t2a)的trunc10复制子，以试验这些替代切割肽中的任一种是否能够从单个复制子有效表达多个有效负载(图15a和seq id no:40、42、44)。将复制子模板(seq id no:39、41、43)和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用cxcl10特异性的elisa(r&d)分析cxcl10的表达。在转染或转衣壳化以后没有检测到cxcl10的表达(图15b)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图15c)，这表明所有这些复制子都是正链和负链病毒rna合成有缺陷的。因此，与原始弗林蛋白酶t2a位点相比，3c、ft2a和弗林蛋白酶3c切割位点没有促进双重有效负载表达或负或正链合成。
[0693]
构建了在his-标记的mfap和cxcl10之间包含替代切割肽(t2a、p2a、f2a或e2a)的trunc10复制子，以试验这些替代切割肽中的任一种是否能够从单个复制子有效表达多个有效负载(图16a和seq id no:48、50、52、54)。将复制子模板(seq id no:47、49、51、53)和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用cxcl10特异性的elisa(r&d)检查cxcl10的表达(图16b)，这表明与弗林蛋白酶-t2a复制子相比，t2a、p2a、f2a和e2a复制子增强了cxcl10的表达，但是在转衣壳化以后没有检测到cxcl10表达。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图16c)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna，这与弗林蛋白酶-t2a复制子相比得到改善。
[0694]
实施例15：具有n末端弗林蛋白酶位点的igsf1内部结构域接头允许从单个orf分泌2个多肽
[0695]
试验具有n末端弗林蛋白酶位点的igsf1内部结构域接头作为用于从单个复制子表达多个有效负载的切割多肽。将宿主igsf1介导的加工接头设计成能够从相同开放读码框(orf)表达和分泌2个有效负载。人igsf1蛋白含有一个跨膜结构域和一个串联的信号序列/信号肽酶位点以促进第二个分泌型有效负载的分泌。在igsf1接头的n端上，包括2x弗林蛋白酶切割位点用于两种肽的er加工并确保n端有效负载的释放。在该实施例中，n-端有效负载分子是鼠il-12，且c-端有效负载分子是在orf内的il-36γamma(图17a和seq id no:60)。将orf插入trunc10复制子中进行试验。
[0696]
将复制子模板(seq id no:59)和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1ug复制子rna或1ug复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用hil-36γ和mil-2 elisa(r&d)检测人il-36γ和鼠il-2的表达。在转染和转衣壳化(te)以后检测到两个有效负载的表达(图17b-17c)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测
定进行分析(图17d)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna并与单个有效负载gfp复制子相当地复制。总之，结果证实了使用igsf1介导的加工在il2和il36之间切割的成功策略，这使得能够从单个复制子表达两个有效负载。il36和il2都在转染和转衣壳化以后表达。正链和负链rna合成与t10-egfp复制子相当。
[0697]
实施例16：hiv-蛋白酶介导的蛋白酶解增强两个有效负载的有效负载表达
[0698]
图18a描绘了相同开放读码框中两个分泌型有效负载的hiv-1蛋白酶介导的加工的示意图。两个有效负载被hiv-1蛋白酶的连接二聚体或单体和侧接hiv蛋白酶切割(pr)位点隔开。在该实施例中，n-端有效负载分子是鼠il-12且c-端有效负载分子是在orf内的il-36γ。将orf插入trunc10复制子中进行试验(seq id no:56、58)。将复制子模板(seq id no:55、57)和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1μg复制子rna或1ug复制子rna 1μg svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图18b)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna并且与单个有效负载gfp复制子相当地复制。用hil-36γ和mil-2 elisa(r&d)检测人il-36γ和鼠il-2的表达。在转染和转衣壳化以后检测到两个有效负载的表达(图18c)。总之，这些结果证实，hiv-蛋白酶的单个拷贝能够从单个复制子有效表达两个有效负载，并且il-36γ和il2在转染和转衣壳化以后成功表达。正链和负链rna合成与trunc10-egfp复制子相当。总之，这些结果证实，hiv-蛋白酶能够实现来自单个orf的双重有效负载。
[0699]
图19a描绘一种双重有效负载复制子t10-bite-hil-36γ，其包含单体hiv-1蛋白酶以及在his-标记的hdll3-bite和人il-36γ之间的侧接蛋白酶切割位点，其被试验来自单个基于trunc10的复制子的两个有效负载的表达。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1μg复制子rna或1μg复制子rna 1μg svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并穿过0.45μm过滤器过滤，并将rna收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100ul过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用hil-36γelisa(r&d)检查人il-36γ的表达。在转染和转衣壳化以后检测到hil-36γ的表达(图19b)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图19c)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna。总之，这些结果证实，hiv-蛋白酶的单个拷贝能够在转染和转衣壳化以后从双重有效负载复制子表达hil-36。与t10-egfp复制子相比，正链和负链rna合成减少。
[0700]
实施例17：来自单个复制子的三重有效负载的hiv-蛋白酶介导的表达
[0701]
图20a描绘一种三重有效负载复制子t10-bite-il3g6-il2，其包含单体hiv-1蛋白酶以及在his-标记的hdll3-bite、人il-36γ和鼠il-2之间的侧接蛋白酶切割位点，其被试验来自单个复制子trunc10(t10)的三个有效负载的表达。将复制子和svv-mcherry模板用noti限制性酶线性化，并用hiscribe t7 rna合成试剂盒(neb)进行体外转录(ivt)。将h1299细胞使用lipofectamine rnaimax(invitrogen)用1μg复制子rna或1μg复制子rna 1ug svvmcherry转染。在转染后48小时，将上清液收集并通过0.45um过滤器过滤，并将rna
收集在qiazol试剂(qiagen)中。将100μl过滤的上清液转移到新鲜的h1299细胞单层上，并在感染后48小时收集上清液。用hil-36γ或mil-2特异性的elisa(r&d)检查人il-36γ和鼠il-2的表达。在转染和转衣壳化以后没有检测到hil-36的表达，且在转染和转衣壳化以后检测到mil-2的低表达(图20b)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图20c)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna，但是与单个有效负载复制子相比，该能力降低。
[0702]
图21a描绘了三重有效负载复制子t10-mil2-bite-hil-36γ的一种替代设计，其将il-2编码区置于其它两个有效负载编码区之前，并使用单体hiv-1蛋白酶以及在鼠il-2、his-标记的hdll3-bite和人il-36γ之间的侧接蛋白酶切割位点。按照与上述相同的方案，对该构建体试验了来自单个复制子的三个有效负载的表达。在转染以后检测到hil-36的表达，但在转衣壳化(te)以后其表达水平降低。在裂解物中在转染和转衣壳化以后检测到mil-2的低表达，但它不分泌到上清液中(图21b)。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图21c)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna。
[0703]
图22a描绘了三重有效负载复制子t10-mil2-hil-36γ-bite的另一种设计，其将hdll3-bite放置为最后的有效负载，并且包含单体hiv-1蛋白酶以及在鼠il-2、人il-36γ和his-标记的hdll3-bite之间的侧接蛋白酶切割位点。按照与上述相同的方案，对该构建体试验了来自单个复制子的三个有效负载的表达。将rna分离并用正链和负链特异性的taqman测定进行分析(图22b)，这表明所有复制子能够合成正链和负链病毒rna。在转染以后检测到hil-36和mil-2的表达，但在转衣壳化以后未检测到，并且在裂解物中检测到相对于上清液更高的mil-2表达(图22c)。总之，结果表明，从三重有效负载复制子t10-mil2-hil36-bite bite，可以在转染以后在上清液和裂解物中检测到低水平的hil-36和mil-2表达，但在转衣壳化以后未检测到，并且正链和负链合成略低于t10-egfp。
[0704]
实施例18：使用svv衍生出的rna复制子的有效负载表达的体内研究
[0705]
在动物模型中试验了使用svv衍生出的复制子的有效负载表达。
[0706]
将nci-h69细胞(8x106个细胞/0.1ml在无血清pbs和的1:1混合物中)皮下地植入无胸腺裸雌性小鼠的右胁腹。当中位肿瘤大小达到大约150mm3(120-180mm3范围)时，将小鼠分组为每个治疗组3只小鼠的组。在一个治疗组中，将小鼠经由肿瘤内施用用脂质纳米颗粒(lnp)的混合物治疗，所述脂质纳米颗粒包封野生型svv rna病毒基因组(svv-wt)或svv-trunc10-hil-36γrna复制子(如在实施例8中所述)。在对照组中，将小鼠经由肿瘤内施用用lnp的混合物治疗，所述lnp包封野生型svv rna病毒基因组和svv-阴性对照rna(svv-neg)。在定量施用后48小时、72小时和6天以后收集肿瘤样品，粉碎样品组织，并制备肿瘤裂解物。通过elisa确定il-36γ表达水平。结果显示在图23a中。在定量施用后48和72小时在肿瘤样品中检测到人il-36γ的表达。
[0707]
在另一组实验中，将nci-h446细胞(5x106个细胞/0.1ml在无血清pbs和1:1混合物中)皮下地植入无胸腺裸雌性小鼠的右胁腹。当中位肿瘤大小达到大约150mm3(120-180mm3范围)时，将小鼠分组为每个治疗组3只小鼠的组。在一个治疗组中，将小鼠经由肿瘤内施用用脂质纳米颗粒(lnp)的混合物治疗，所述脂质纳米颗粒包封野生型svv rna病毒基因组(svv-wt)和编码人il-36γ(r-il36g)的svv-复制子rna。在对照组中，将小鼠经由肿瘤内施用用lnp的混合物治疗，所述lnp包封野生型svv rna病毒基因组和
svv-阴性对照rna(svv-neg)。在定量施用后48小时、72小时和7天以后收集肿瘤样品，粉碎样品组织，并制备肿瘤裂解物。通过elisa确定il-36γ表达水平。结果显示在图23b中。在定量施用后48和72小时在肿瘤样品中检测到人il-36γ的表达。
[0708]
实施例19：柯萨奇病毒a21复制子的构建和来自它的有效负载表达
[0709]
如在图24中所示，通过除去vp结构蛋白(vp1、vp2、vp3)并用侧翼为2a蛋白酶位点的荧光蛋白mcherry orf替换它们，产生cva21-复制子(seq id no:62)。使用根据seq id no:61的dna载体模板，可以产生复制子。
[0710]
试验了包含mcherry有效负载的cva21-复制子的有效负载表达。将六孔板中的1x10^5个nci-h1299细胞使用rnaimax试剂用500ng单独gfp mrna(转染对照)、与cva21-wt rna等摩尔比(对照2)或与cva21-复制子rna等摩尔比转染(图25a)。转染对照显示h1299细胞的最大转染效率。对照2显示，gfp信号被cva21-mrna转染部分抑制。cva21-复制子显示出自始至终与转染对照匹配的mcherry信号，表明非常有效的转染和高表达。因此，cva21复制子rna能够在nci-h1299细胞中表达有效负载蛋白。
[0711]
接下来，进行实验以确定cva21 mcherry复制子是否可以在有wt cva21病毒存在下转衣壳化。将六孔板中的1x10^5个nci-h1299细胞使用rnaimax试剂用500ng单独cva21-复制子rna(阴性对照)或用500ng cva21-wt rna转染。在转染以后48小时，将上清液收集，离心，通过45μm过滤，并然后将100μl用于感染新的12孔板孔的(1x10^5个细胞)h1299细胞。在用复制子:wt病毒上清液感染的孔中观察到强感染和mcherry信号，表明mcherry复制子被wt-rna产生的衣壳成功衣壳化，而缺乏cva21-wt的阴性对照没有显示mcherry信号(图25b)。总之，这些结果证实，在有野生型cva21病毒存在下，携带有效负载的cva21复制子可以成功地转衣壳化。
[0712]
实施例20：包含svv衍生出的重组rna复制子和编码svv病毒基因组的rna分子的脂质纳米颗粒用于肺癌治疗的体内效力
[0713]
构建了各种塞内卡谷病毒(svv)衍生出的重组rna复制子。这些重组rna复制子包含编码一种或多种免疫调节蛋白(例如，抗-dll3双特异性的t-细胞接合剂(bite))的异源多核苷酸。这些重组rna复制子中的一些进一步包含一种或多种细胞因子(例如，il-2、il-12、il-36γ)和/或一种或多种趋化因子(例如，ccl21、ccl4)的编码区。所述svv衍生出的rna复制子中的一些包含根据下述表18的一个或多个有效负载分子的编码区：
[0714]
表18.svv衍生出的复制子的有效负载分子
[0715]
[0716][0717]
对于每种svv衍生出的复制子，制备了包含svv衍生出的rna复制子和编码svv病毒基因组的rna分子的脂质纳米颗粒。进行动物实验以评价这些脂质纳米颗粒在体内抑制肺肿瘤生长的效力，将其与包含编码svv病毒基因组的rna分子、但没有rna复制子的脂质纳米颗粒的效力进行对比。
[0718]
简而言之，在第1、2和3天给8-周龄nsg小鼠注射人pbmc。在第10天，将h1299-dll3细胞(5x106个细胞/0.1ml在无血清pbs和的1:1混合物中)皮下地植入pbmc-人源化的小鼠的右胁腹。当中位肿瘤大小是大约150mm3(120-180mm3范围)时，将小鼠分组为每个治疗组8-10只小鼠的组。用含有编码svv病毒基因组的rna分子和特定svv衍生出的rna复制子的lnp治疗小鼠(通过静脉内和/或肿瘤内施用)。在对照组中，用含有编码svv病毒基因组的rna分子的lnp治疗小鼠。每周测量肿瘤体积2次以评估每个治疗组的效力。
[0719]
实施例21：包含cva21衍生出的重组rna复制子和编码cva21病毒基因组的rna分子的脂质纳米颗粒用于黑色素瘤治疗的体内效力
[0720]
构建了各种柯萨奇病毒a21(cva21)衍生出的重组rna复制子。这些重组rna复制子包含编码一种或多种免疫调节蛋白(例如，抗-dll3双特异性的t-细胞接合剂(bite))的异源多核苷酸。这些重组rna复制子中的一些进一步包含一种或多种细胞因子(例如，il-2、il-12、il-36γ)和/或一种或多种趋化因子(例如，ccl21、ccl4)的编码区。cva21衍生出的rna复制子中的一些包含根据下述表19的一个或多个有效负载分子的编码区：
[0721]
表19.cva21衍生出的复制子的有效负载分子
[0722][0723]
对于每种cva21衍生出的复制子，制备了包含cva21衍生出的rna复制子和编码cva21病毒基因组的rna分子的脂质纳米颗粒。进行动物实验以评价这些脂质纳米颗粒在体内抑制黑色素瘤肿瘤生长的效力，将其与包含编码cva21病毒基因组的rna分子、但没有rna复制子的脂质纳米颗粒的效力进行对比。
[0724]
简而言之，在第1、2和3天给8-周龄nsg小鼠注射人pbmc。在第10天，将sk-mel-28-epcam细胞(5x106个细胞/0.1ml在无血清pbs和的1:1混合物中)皮下地植入pbmc-人源化的小鼠的右胁腹。当中位肿瘤大小是大约150mm3(120-180mm3范围)时，将小鼠分组为每个治疗组8-10只小鼠的组。用含有编码cva21病毒基因组的rna分子和特定cva21衍生出的rna复制子的lnp治疗小鼠(通过静脉内和/或肿瘤内施用)。在对照组中，用含有编码cva21病毒基因组的rna分子的lnp治疗小鼠。每周测量肿瘤体积2次以评估每个治疗组的效力。
[0725]
通过引用并入
[0726]
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请通过引用整体并入用于所有目的。但是，本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及没有且不应视作承认或以任何形式暗示：它们在世界上的任何国家构成有效的现有技术或形成普通一般知识的一部分。
[0727]
尽管本文已经显示和描述了本公开内容的优选实施方案；本领域技术人员将显而易见，这样的实施方案仅作为示例提供。在不背离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开内容时可以采用对本文描述的本
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