基于手性芘四羧酸的聚集诱导电致化学发光效应的酪氨酸对映体传感器及其识别方法

1.本发明属于电致化学发光技术领域，具体涉及一种基于芘四羧酸的手性材料聚集诱导电化学发光效应的酪氨酸对映体识别方法。


背景技术：

2.手性是自然界的重要特征之一，在生物学、医学和生物技术的分子水平上发挥着重要作用。氨基酸(aas)是自然界中最重要和最主要的手性化合物，可作为各种代谢疾病的重要生物标志物。酪氨酸(l-tyr)是一种重要的生酮糖原氨基酸，是各种生物活性分子(如肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺)的重要前体，所有这些都起到调节情绪的作用。重要的是，l-tyr在体内的积累或代谢与多种疾病相关，这些疾病可能破坏细胞内稳态，并有助于疾病的发病机制，如亨廷顿病、胃食管恶性肿瘤和肝癌。酪氨酸浓度的精确监测对于健康评估非常重要。因此，氨基酸对映体的手性识别在生命科学中具有重要意义。目前，色谱法、核磁共振、荧光光谱、毛细管电泳、电化学等多种分析技术已应用于手性识别氨基酸对映体中，电化学手性传感具有成本低、反应快、灵敏度高、操作简单、易于再生等优点。基于ecl的手性识别传感研究较少，主要原因是缺乏同时具有高对映体识别能力和良好电化学响应的手性识别体。因此本文合成了一种全新的ecl发光体，即结构稳定的芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇组装体，用于酪氨酸对映体识别。


技术实现要素：

3.本发明旨在提供一种基于手性芘四羧酸的聚集诱导电致化学发光效应的酪氨酸对映体识别方法，以3,4,9,10-芘四羧酸为主体材料，s-3-氨基-1-丁醇为手性配体，通过酰胺化反应实现手性转移，在十二烷基三甲基溴化铵，氯仿和环己烷的作用下，通过分子间π-π堆叠相互作用使单体在胶束内聚集，限制了分子内运动，从而触发聚集诱导电化学发光效应，得到芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇组装体，过硫酸钾作为共反应试剂，当体系中存在酪氨酸对映体时，呈现出不同强度的电致化学发光信号，据此构建了基于芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇组装体电致化学发光新体系的传感方法，对酪氨酸对映体具有简单、灵敏、选择性好、稳定高的优点。
4.本发明提供了如下的技术方案：
5.一种基于手性芘四羧酸的聚集诱导电致化学发光效应的酪氨酸对映体识别方法，包括以下步骤：
6.s1:将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptcda)加入至naoh溶液中，水浴搅拌，直至溶液变为黄绿色，加入hcl至完全沉淀，用超纯水离心，洗涤，干燥产物即为3,4,9,10-芘四羧酸；
7.s2:将3,4,9,10-芘四羧酸(ptca)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl),n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中进行搅拌；
8.s3:在搅拌的条件下将s-3-氨基-1-丁醇(s-3ab)与上述溶液混合；
9.s4:离心所得固体经洗涤和干燥，获得芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇(ptca-s-3ab)；
10.s5:在搅拌条件下将芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇，氯仿，环己烷，十二烷基三甲基溴化铵(dtab)混合，在60-90℃的条件下搅拌，反应1-3h，离心所得固体经洗涤，得到芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇组装体(ag-ptca-s-3ab)。
11.进一步，所述步骤s1中naoh的浓度为0.5-2.0m，hcl的浓度为0.5-2.0m；优选的naoh的浓度为0.5m；hcl的浓度为1m；
12.进一步，所述步骤s2中，3,4,9,10-芘四羧酸和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐摩尔比为1：(5-8)，1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(2-5)；优选的，苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptca)与1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的摩尔比为3:18:45。
13.进一步，s-3-氨基-1-丁醇溶于n,n-二甲基甲酰胺中，在20-50℃的条件下搅拌，反应6-15h；ptca与s-3-氨基-1-丁醇(s-3ab)的摩尔比为1:3～4；
14.优选的，所述步骤s3中，s-3ab的浓度为12mm，加入edc
·
hcl和nhs之后搅拌时间为15min。
15.进一步，步骤s4干燥时间为4-8h。优选的，所述步骤s4中，离心转速为12000rpm，干燥时间为6h。
16.进一步，步骤s5中，在60-90℃的条件下搅拌，反应1-3h，优选的，所述步骤s5中，反应时间为1h，反应温度为70℃。
17.对酪氨酸对映体的识别应用如下：
18.将所述芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇组装体分散于去离子水中，与一定体积的四正辛基溴化铵(toab)混合，移取混合液滴涂于玻碳电极的表面，室温下晾干，制得ag-ptca-s-3ab/gce；移取的混合液的浓度为0.1-2mg/ml，质量为0.5-10μg。
19.由ag-ptca-s-3ab/gce作为工作电极、铂丝为对电极、ag/agcl电极为参比电极构成三电极系统，以ag-ptca-s-3ab/gce为工作电极，ag/agcl电极电极为参比电极，铂片电极为对电极，磷酸缓冲盐溶液(pbs)为电解液，过硫酸钾为共反应试剂，通过电致化学发光仪测得ag-ptca-s-3ab/gce在分别含l/d-酪氨酸的pbs电解液中电致化学发光强度。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.(1)本发明所提供的基于手性芘四羧酸的聚集诱导电致化学发光效应的酪氨酸对映体识别方法，通过表面活性剂诱导自组装，实现手性材料聚集诱导电致化学发光效应，具备更好的电致化学发光性能和更好的识别效果；
22.(2)本发明所提供的基于芘四羧酸的手性材料聚集诱导电致化学发光效应的酪氨酸对映体识别方法，以芘四羧酸-s-3-氨基-1-丁醇组装体修饰的玻碳电极为工作电极，能够实现酪氨酸对映体的选择性识别，结果可靠，重现性好，稳定性高，灵敏度高且操作方法简单。
23.(3)本发明所提供的基于芘四羧酸的手性材料聚集诱导电致化学发光效应的酪氨酸对映体识别方法，能够实现对酪氨酸的特异性识别。
附图说明
24.图1为实施例1中ptca、ptca-s-3ab、ag-ptca-s-3ab的扫描电镜图；
25.图2为实施例1中ptca、ptca-s-3ab、ag-ptca-s-3ab的红外光谱图；
26.图3为实施例1中不同材料的ecl性能对比图；
27.图4为对比例1中ptca-s-3ab对酪氨酸对映体识别ecl图；
28.图5为实施例1中ag-ptca-s-3ab对酪氨酸对映体识别ecl图；
29.图6为实施例1中ag-ptca-s-3ab对识别不同氨基酸的柱状图。
具体实施方式
30.下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
31.实施例
32.将0.1g苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptcda，分子量392.32)加入至10ml 0.5m naoh溶液中，80℃水浴搅拌1h，直至溶液变为黄绿色，然后逐滴加入1.0m hcl至混合溶液中到完全沉淀，保持ph微酸性，用超纯水离心洗涤，去除多余试剂，在60℃下干燥，制备的产物即为ptca。称取12.8mg的3，4，9，10-芘四羧酸(ptca，分子量428.34)，34mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl，分子量191.7)和51mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，分子量115.09)溶于10ml的dmf中，搅拌15min，来活化ptca上的羧基，加入10mg的s-3-氨基-1-丁醇(s-3ab，分子量89.13)，继续搅拌过夜，发生酰胺化反应，用乙醇和超纯水反复离心，洗涤，60℃下干燥，得到ptca-s-3ab，将0.5mgptca-s-3ab超声分散于2ml超纯水中，加入20mg十二烷基三甲基溴化铵(dtab)，800μl氯仿和200μl环己烷，室温下搅拌30s，补加2ml超纯水，在水浴搅拌70℃的条件下，蒸发有机相1h，冷却至室温后，用超纯水离心洗涤，得到的固体即为ptca-s-3ab组装体(ag-ptca-s-3ab)，所得固体重新分散于超纯水中。
33.将0.5mg ag-ptca-s-3ab分散于0.5ml超纯水中，超声分散5min，加入等体积的浓度为10mm的四正辛基溴化铵(toab)混合均匀，取8μl分散的混合溶液滴涂在gce表面，在红外光灯下干燥，最终制备的改性电极标记为ag-ptca-s-3ab/gce。以ag-ptca-s-3ab/gce为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂片电极为对电极，ph为7的pbs为电解液，18mm的过硫酸钾为共反应试剂，通过电致化学发光仪对ag-ptca-s-3ab/gce进行电致化学发光(ecl)的强度测试。
34.将s-3-氨基-1-丁醇替换为(r)-3-氨基-1-丁醇，以相同方法合成了ag-ptca-r-3ab，最终制备的改性电极标记为ag-ptca-s-3ab/gce，该电极对酪氨酸对映体没有较好的识别效果。
35.对比例
36.称取12.8mg的3，4，9，10-芘四羧酸(ptca，分子量428.34)，34mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl，分子量191.7)和51mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，分子量115.09)溶于10ml的dmf中，搅拌15min，来活化ptca上的羧基，加入10mg的s-3-氨基-1-丁醇(s-3ab，分子量89.13),继续搅拌过夜，利用ptca上的羧基与s-3ab上的氨基发生酰胺化反应，用乙醇和超纯水反复离心，洗涤，60℃下干燥，得到ptca-s-3ab。
37.将0.5mg ptca-s-3ab分散于0.5ml超纯水中，超声分散5min，加入等体积的toab混合均匀，取8μl分散的混合溶液滴涂在gce表面，在红外光灯下干燥，最终制备的改性电极标记为ptca-s-3ab/gce。以ptca-s-3ab/gce为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂片电极
为对电极，ph为7的pbs为电解液，18mm的过硫酸钾为共反应试剂，通过电致化学发光仪对ptca-s-3ab/gce进行电致化学发光(ecl)的强度测试。
38.实验数据分析
39.如图1，其中a为ptca的扫描电镜图；b、c为不同标尺的ptca-s-3ab的扫描电镜图；d、e为不同标尺的ag-ptca-s-3ab的扫描电镜图。由图a可以看出，ptca呈现无规则的块状结构，ptca-s-3ab的形貌呈现规则的棒状结构，分布均匀，ag-ptca-s-3ab的形貌相较于ptca-s-3ab，表面变得光滑，从图c与图e可以看出，单体ptca-s-3ab聚集，形成ag-ptca-s-3ab，拥有更好的ecl性能。
40.如图2为不同样品的红外光谱图，ptca在3440cm-1
出现的吸收峰为-oh的伸缩振动峰，在1770cm-1
处的吸收峰为c＝o的伸缩振动。ptca-s-3ab在1080cm-1
处的吸收峰为c-n的特征吸收峰，1639cm-1
处为n-h的弯曲振动峰，3446cm-1
为酰胺键中n-h键的伸缩振动峰，表明了ptca与s-3ab之间形成了酰胺键，ag-ptca-3ab分别在1076cm-1
，1647cm-1
，1772cm-1
，3446cm-1
出现了吸收峰，相较于ptca-s-3ab发生了轻微的偏移，是由于在组装过程中，发生了材料的聚集，使得红外吸收峰发生了轻微的偏移。
41.如图3为不同材料的ecl性能对比图，可以看出裸电极和ptca没有明显的ecl行为，当酰胺化后形成ptca-s-3ab，ecl性能有轻微的提升，发生组装后的ag-ptca-3ab性能明显变强，是由于发生了聚集诱导发光，导致了ecl信号的显著变化，可以看出最终的复合材料拥有优异的发光性能。
42.如图4为对比例中ptca-3ab在含有酪氨酸对映体pbs溶液中的ecl对比图，可以发现当溶液中存在d-tyr时，ecl由593a.u.下降到393a.u.，溶液中有l-tyr存在时，ecl信号下降到309a.u.，表明ptca-s-3ab更倾向于结合l-tyr。
43.如图5为实施例1中ag-ptca-3ab在含有酪氨酸对映体pbs溶液中的ecl对比图，可以看出当溶液中存在d-tyr时，ecl强度发生轻微的降低，ecl由3247a.u.下降到2322a.u.，而当溶液中存在l-tyr时，ecl强度发生了明显的下降，ecl信号下降至1231a.u这是因为材料更倾向于结合l-tyr，造成了l-tyr在电极表面富集，由于氨基酸电子传输能力较差，因此ecl信号降低。
44.如图6为实施例1中ag-ptca-3ab对不同氨基酸的识别能力的考察，可以看出，色氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的ecld/ecl
l
接近于1，说明材料ag-ptca-3ab对于这三种氨基酸对映体几乎没有识别能力，而对酪氨酸对映体的ecld/ecl
l
为1.89，说明材料对酪氨酸对映体有特异性识别的能力，可以用于特异性识别酪氨酸对映体。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。