一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法。


背景技术：

2.莱氏绿僵菌是绿僵菌属的一种虫生真菌且是一种世界性广泛分布的昆虫病原真菌，在田间自然条件下能感染鳞翅目夜蛾科和其他科的40多种昆虫，引起种群内大规模的传染疾病，极具研究价值及应用前景。对生防类虫生真菌侵染机制的探究，挖掘提高虫生真菌毒力的手段，将极大推动绿色农业生产的发展。莱氏绿僵菌主要通过产生附着胞、芽管等特殊结构侵入害虫体壁，之后在昆虫体内快速生长、繁殖，破坏害虫生理机能最终导致害虫死亡。
3.目前，虫生真菌应用较多、研究较为广泛的有球孢白僵菌、蝗绿僵菌、金龟子绿僵菌等。这些虫生真菌的宿主广泛，包括鳞翅目、鞘翅目，直翅目等多种昆虫。关于这些虫生真菌附着胞诱导的方法也有了比较多的报道。常用诱导介质有两种：一、昆虫后翅。以昆虫如蝗虫的后翅为基质进行接种，并通过显微镜观察附着胞的形成；二、ye（yeast extract）培养基。通过测定不同浓度ye培养基下附着胞的形成情况，从而确定最佳诱导培养基浓度；除了上述的两种方法外，也有通过玻璃纸、树脂等方式诱导。
4.在以蝗虫后翅作为基底进行附着胞的诱导时，往往在宿主为直翅目或是鞘翅目昆虫的虫生真菌中效果较好。而宿主为鳞翅目特别是鳞翅目幼虫的虫生真菌（莱氏绿僵菌）中，目前未见到蝗虫后翅附着胞诱导成功的报道。同样，以ye培养基液体诱导的方式，除效果较差易形成菌丝团外，浓度的探索也较为繁复。而采用玻璃纸、树脂等都或多或少存在着物种特异性，效果差等缺点。因此，关于其附着胞的诱导手段，仍待进一步探究。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，将为挖掘附着胞形成相关基因、解析虫生真菌侵染机制、创制高毒力莱氏绿僵菌菌株提供理论技术手段，能够提高择选高毒力莱氏绿僵菌菌株的效率，从而实现高效病虫防治。
6.本发明通过下述技术方案实现：一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，包括如下步骤：s1：水琼脂的制备：称取琼脂粉1.8g放入250ml容量瓶中，并加入150ml纯水，混合均匀后于121℃下灭菌，获得水琼脂，待灭菌完成后倒入平板培养皿后冷却待用；s2：定性滤纸的准备：将定性滤纸进行高温灭菌，并于超净台中平均分剪为4等分，将滤纸片平铺于s1步骤中的平板培养皿中；s3：盖玻片的处理：将方形盖玻片高温灭菌，并小心将盖玻片置于s2步骤中滤纸的表面；s4：孢子悬浮液的制备：以初代莱氏绿僵菌菌株转接培养7~10天至大量产孢，并以0.05%吐温80作为溶剂，配置1x106个/ml浓度分生孢子悬浮液待用；
s5：滴加涂覆：吸取s4步骤中分生孢子悬浮液50μl，滴加于s3步骤中平板培养皿内的盖玻片上表面，并涂抹分布整个玻片，获得附着胞的诱导体系；s6：培养：将s5步骤中诱导体系的培养皿小心封口，并置于25℃光照培养箱中进行培养5天后，在显微镜下观察附着胞的形成状况，分析诱导结果。
7.进一步，所述s1和s2步骤中，所述平板培养皿和定型滤纸的规格大小均为90mm。
8.进一步，所述s1步骤中，所述灭菌时间为15min，所用水琼脂浓度为1.0~1.2％；进一步，所述s3步骤中，所述方形盖玻片的规格大小为2 cm x 2 cm 。
9.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，通过以水琼脂为基底、定性滤纸为中间层保水介质、盖玻片为疏水表面载体，将分生孢子滴加于玻片上进而诱导附着胞的形成，本发明诱导方法简单易操作，诱导附着胞形成的效果佳，从而能够实现莱氏绿僵菌附着胞侵染结构形成关键基因的快速筛选，也助于创制出毒力优异的莱氏绿僵菌，所以，本发明为莱氏绿僵菌生物农药的进一步产业化应用提供了重要的实验基础。
附图说明
10.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例和实验例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例和实验例的限定。在附图中：图1为本发明莱氏绿僵菌菌落图；图2为本发明被莱氏绿僵菌侵染鳞翅目幼虫图；图3为本发明附着胞诱导体系构建过程图；图4为本发明诱导方法与现有技术诱导方法效果比较图。
具体实施方式
11.下面结合实施例和附图对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
12.实施例1一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，包括如下步骤：s1：水琼脂的制备：称取琼脂粉1.8g放入250ml容量瓶中，并加入150ml纯水，混合均匀后于121℃下灭菌15min，获得水琼脂，水琼脂浓度为1.0~1.2％，待灭菌完成后倒入90mm平板培养皿后冷却待用；s2：定性滤纸的准备：将90mm定性滤纸进行高温灭菌，并于超净台中平均分剪为4等分，将滤纸片平铺于s1步骤中的90mm平板培养皿中；s3：盖玻片的处理：将2 cm x 2 cm方形盖玻片高温灭菌，并小心将盖玻片置于s2步骤中滤纸的表面；s4：孢子悬浮液的制备：以初代莱氏绿僵菌菌株转接培养7~10天至大量产孢，并以0.05%吐温80作为溶剂，配置1x106个/ml浓度分生孢子悬浮液待用；s5：滴加涂覆：吸取s4步骤中分生孢子悬浮液50μl，滴加于s3步骤中平板培养皿内的盖玻片上表面，并涂抹分布整个玻片，获得附着胞的诱导体系；
s6：培养：将s5步骤中诱导体系的培养皿小心封口，并置于25℃光照培养箱中进行培养5天后，在显微镜下观察附着胞的形成状况，分析诱导结果。
13.本发明莱氏绿僵菌菌落图如图1所示；本发明附着胞诱导体系构建包括了步骤s1-s3，整个构建过程如图3所示；用本发明中所用莱氏绿僵菌侵染鳞翅目幼虫，如图2所示。本发明还选取了现有技术的两种诱导附着胞形成的方式进行对比，分别为玻璃纸作为介质诱导附着胞和ye培养基作为介质诱导附着胞，两种方法为现有的方法，本发明对其具体方法不做赘述，将现有诱导方法和本发明诱导方法进行对比，诱导5天后，如图4所示，可以看出，本发明诱导方法效果良好，优于现有的诱导方法，此外，本发明方法简单，因此有着突出的优势。
14.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：水琼脂的制备：称取琼脂粉1.8g放入250ml容量瓶中，并加入150ml纯水，混合均匀后于121℃下灭菌，获得水琼脂，待灭菌完成后倒入平板培养皿后冷却待用；s2：定性滤纸的准备：将定性滤纸进行高温灭菌，并于超净台中平均分剪为4等分，将滤纸片平铺于s1步骤中的平板培养皿中；s3：盖玻片的处理：将方形盖玻片高温灭菌，并小心将盖玻片置于s2步骤中滤纸的表面；s4：孢子悬浮液的制备：以初代莱氏绿僵菌菌株转接培养7~10天至大量产孢，并以0.05%吐温80作为溶剂，配置1x106个/ml浓度分生孢子悬浮液待用；s5：滴加涂覆：吸取s4步骤中分生孢子悬浮液50μl，滴加于s3步骤中平板培养皿内的盖玻片上表面，并涂抹分布整个玻片，获得附着胞的诱导体系；s6：培养：将s5步骤中诱导体系的培养皿小心封口，并置于25℃光照培养箱中进行培养5天后，在显微镜下观察附着胞的形成状况，分析诱导结果。2.根据权利要求1所述的一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，其特征在于，所述s1和s2步骤中，所述平板培养皿和定型滤纸的规格大小均为90mm。3.根据权利要求1所述的一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，其特征在于，所述s1步骤中，所述灭菌时间为15min，所用水琼脂浓度为1.0~1.2％；根据权利要求1所述的一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，其特征在于，所述s3步骤中，所述方形盖玻片的规格大小为2 cm x 2 cm 。

技术总结
本发明公开了一种莱氏绿僵菌附着胞的简易诱导方法，包括如下步骤：S1：称取琼脂粉并加入150mL纯水，混合均匀后于121℃下灭菌；S2：将定性滤纸进行高温灭菌，并于超净台中平均分剪为4等分，将滤纸片平铺于S1步骤中的平板培养皿中；S3：将方形盖玻片高温灭菌，并小心将盖玻片置于S2步骤中滤纸的表面；S4：以初代莱氏绿僵菌菌株转接培养7~10天至大量产孢，并以0.05%吐温80作为溶剂，配置1x106/mL浓度分生孢子悬浮液待用；S5：吸取S4步骤中分生孢子悬浮液50μL，滴加于S3步骤中的盖玻片上表面，并涂抹分布整个玻片，获得制备好的培养皿；S6：将S5步骤中培养皿小心封口，培养后在显微镜下观察附着胞的形成状况。本发明为创制高毒力莱氏绿僵菌菌株提供理论技术手段。绿僵菌菌株提供理论技术手段。绿僵菌菌株提供理论技术手段。


技术研发人员：林云龙 范利琴 李鑫鑫 董星雨 盛文婷 孙佳 王佳慧 马怡婷 赵琳琳
受保护的技术使用者：周口师范学院
技术研发日：2022.11.22
技术公布日：2022/12/30