脱氮副球菌硝酸盐诱导型启动子的制作方法

1.本发明涉及脱氮副球菌硝酸盐诱导型启动子，属于合成生物学领域。


背景技术：

2.近几十年来人们逐渐重视环境保护，国家加大力度对污染水体进行防治，但多年来河流、湖泊等污染未能得到有效地遏制，水体污染负荷不断增加，富营养化问题仍然严重，饮用水安全依然受到威胁。由于氮污染物来源广泛、污染途径及过程复杂、传统的脱氮技术处理效果不高、新的脱氮技术难以实现规模化应用等原因，由此可见氮污染是难以控制，而且解决氮污染也是相当困难的。生物脱氮是目前污水脱氮处理中最常用也是最有效的方法，而选取具有脱氮功能的菌株是生物脱氮的基础。
3.反硝化作用是由微生物推动的全球氮循环的重要分支之一，目前对反硝化过程的控制主要通过调节no3‑
、o2和ph值等远端途径，而如果能从分子水平上认识微生物反硝化过程，可以为调控反硝化途径提供新的思路和方法。好氧反硝化菌因为能够同时利用硝酸盐和氧气作为电子供体受体而受到广泛的关注。随着对脱氮微生物的深入了解，研究人员发现有些脱氮菌中存在异养硝化和好氧反硝化的偶联过程，此类菌被称为异养硝化
‑
好氧反硝化菌(heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacteria,hn
‑
ad)。hn
‑
ad菌的发现为单级脱氮工艺提供了基础，突破了硝化菌与反硝化菌共培养脱氮的传统脱氮工艺。脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)具有硝化与好氧反硝化一体的功能，因此成为脱氮的模式菌种。
4.目前已有试验证实，在好氧条件下脱氮副球菌通过反硝化作用对硝酸盐有很好的处理效果。例如kucera等人利用膜反应器中的脱氮副球菌去除水中的硝酸盐，结果表明经过10h的试验后，硝酸盐的去除率高达95％，同时没有亚硝酸盐的积累。同时也有研究证明，脱氮副球菌在有氧和无氧条件下都可以进行反硝化作用。另外，研究者还提出脱氮副球菌不仅能够进行好氧反硝化作用，还能够将氨氮转化为亚硝态氮，具有异养硝化功能。脱氮副球菌的硝化和好氧反硝化作用为利用其治理生活用水的氮素污染提供了理论依据。然而，在p.denitrificans中缺少高效的遗传转化系统，大大限制了基因工程在p.denitrificans中降解氨氮的应用。因此，很有必要建立一套高效的遗传转化系统。其中载体是遗传转化体系的核心部分，而启动子是载体能否高效表达的关键元件。因此，利用p.denitrificans好氧反硝化的优势，充分挖掘脱氮副球菌硝酸盐诱导型启动子，有助于建立适用于p.denitrificans高效率的遗传转化系统，提高p.denitrificans降解氨氮的效率。


技术实现要素：

5.本发明提供了硝酸盐诱导型启动子，具有如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6或seq id no.7所示的核苷酸序列，能够在受到硝酸盐刺激时，启动在脱氮副球菌中的基因的转录，并大幅度地提高基因转录水平。
6.在一种实施方式中，所述硝酸盐的浓度为1mg/l～2g/l，或10mg/l～2g/l，或
ht plate reader(winooski,vt,usa)用于检测样品荧光强度。大肠杆菌jm109用于分子克隆，大肠杆菌s17
‑
1λpir作为辅助菌株用于脱氮副球菌dytn
‑
1接合转移，脱氮副球菌dytn
‑
1用于蛋白表达。
25.实施例1基因重组载体的构建
26.1.采用引物f:ccatggtgcgtataggtgaagaactg和r:aagcttagaactggcatgcatctttg从含有sfgfp的载体pjkr
‑
h
‑
cdar(购自addgene)中克隆含有ncoi和hindiii酶切位点的sfgfp基因，用限制性内切酶ncoi和hindiii对目的基因sfgfp和质粒pind4(获取自军事医学科学院，公开于论文《山梨糖脱氢酶在脱氮副球菌中的表达》中)分别进行双酶切，构建pind4‑
sfgfp重组表达载体。sfgfp基因片段和pind4酶切反应体系：10
×
quickcut buffer 5μl，限制性内切酶ncoi和hindiii各1μl，sfgfp或pind4总量为1μg，用dd h2o补足总体积50μl，放入37℃金属浴酶切1h，80℃灭活15min，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
27.2.基因片段纯化回收：实验步骤参照生工sangon biotech dna纯化回收试剂盒使用说明书。
28.3.dna连接：测定酶切纯化回收后目的基因sfgfp和质粒pind4的浓度，将其按摩尔比4:1进行混合，加入1μlt4连接酶，2.5μl10
×
t4 dna ligase buffer，用dd h2o补足总体积至25μl，在16℃下连接20h。
29.4.转化：将从
‑
80℃冰箱拿出的感受态细胞e.coli jm109在冰上融化10min，向其中加入25μl连接产物，混匀后冰浴15min，之后放入42℃恒温水浴锅中热击90s，迅速放回冰水浴中2min，再向其中加入1000μl的lb培养基(无抗)，充分混匀后在37℃，220r/min下复苏1h，最后取100μl复苏后的菌液涂布于含50μg/ml的卡那霉素抗生素的lb固体培养基上，37℃培养12h，待平板上长出单菌落，挑取单菌落进行菌落pcr验证筛选阳性转化子，得到载体pind4‑
sfgfp。
30.5.通过kegg(https://www.kegg.jp/)数据库中搜索paracoccus denitrificans的全基因组序列，搜索p.den
‑
0893、p.den
‑
4237、p.den
‑
nir、p.den
‑
1845、p.den
‑
3636、p.den
‑
2411和p.den
‑
1746基因，分析确定p
0893
、p
4237
、p
nir
、p
1845
、p
3636
、p
2411
和p
1746
启动子序列，使其包含核心区、5'
‑
非编码区(utr)和rbs区域，可直接连接到目标基因的cds区域上游用于基因表达，核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7所示。采用上海生工细菌基因组试剂盒提取脱氮副球菌dytn
‑
1的基因组dna。引物由金唯智生物科技有限公司合成，引物的信息见表1。
31.表1 paracoccus denitrifican启动子引物序列信息
[0032][0033]
6.以质粒pind4‑
sfgfp为模板，采用引物f:atggtgcgtataggtgaagaactg和r:gcgcaacgcaattaatgtaagttag制备线性化载体pind4‑
sfgfp，pcr扩增的体系50μl，其中2
×
primestar max dna聚合酶25μl，引物f/r(10μmol/l)各1μl，dna模板1μl，22μldd h2o。扩增程序见表2。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，按照dna纯化回收试剂盒说明书切胶回收目的片段。
[0034]
表2 pcr扩增程序
[0035][0036][0037]
7.dna连接：测定纯化回收后启动子片段和线性载体的浓度，将其按摩尔比3:1进行混合，加入5μl abclonal连接酶，用dd h2o补足总体积至10μl，在50℃下连接15mim。
[0038]
8.转化：将从
‑
80℃冰箱拿出的感受态细胞e.coli jm109在冰上融化10min，向其中加入15μl连接产物，混匀后冰浴15min，之后放入42℃恒温水浴锅中热击90s，迅速放回冰水浴中2min，再向其中加入1000μl的lb培养基(无抗)，充分混匀后在37℃，220r/min下复苏1h，最后取100μl复苏后的菌液涂布于含50μg/ml的卡那霉素抗生素的lb固体培养基上，37℃培养12h，待平板上长出单菌落，挑取单菌落进行菌落pcr验证筛选阳性转化子，得到载体pind4‑
pp.den
‑
sfgfp。
[0039]
实施例2脱氮副球菌接合转化
[0040]
(1)将实施例1构建好的重组质粒，使用热击法分别转化至大肠杆菌s17
‑
1λpir感受态细胞，在50μg/ml的卡那霉素抗性lb培养基上培养24h，挑取单菌落，进行菌落验证并将阳性克隆子转移至lb培养基在200rpm，37℃培养12h时间提取质粒进行测序验证。
[0041]
(2)将步骤(1)构建的含有重组质粒的大肠杆菌s17
‑
1λpir作为供体菌株，脱氮副球菌dytn
‑
1作为受体菌株，分别接种在2支盛5ml lb培养基的试管中，37℃过夜培养，分别获得菌体数量为108cfu/ml的菌液。然后将两者按照3：10的比例转移至同一试管中使试管内供、受体菌混匀并将供、受体菌混合培养物置37℃保温30min。供、受体菌混合培养物保温30min后，将这支试管剧烈振荡使供体菌和受体菌之间的性菌毛断开，从而中止基因的遣传转移。吸取0.1ml菌液涂布于相应的抗性平板培养两天，挑取单菌落进行pcr验证，并将阳性克隆子转移至lb培养基在200rpm，37℃培养12h时间提取质粒进行测序验证得到阳性克隆子。
[0042]
实施例3脱氮副球菌硝酸盐诱导型启动子调控gfp表达
[0043]
将含重组载体的脱氮副球菌菌株在m9培养基中，于30℃，200rpm中震荡培养。
[0044]
m9培养基:甘油4g/l，kno
3 2.0g/l，nacl 0.5g/l，kh2po
4 3.0g/l，na2hpo
4 6.78g/l，cacl
2 0.115g/l，mgso
4 0.24g/l。以替换培养基中的kno
3 2.0g/l为1.0g/l蛋白胨为对照。
[0045]
将实施例2步骤(2)得到的阳性菌落经过夜活化后，以2％的接种量接种至含2ml m9培养基的孔板中培养。另外，对菌株分别在添加和不添加硝酸盐诱导的情况下进行培养，培养48h后取样收集上清液，用pbs缓冲液适当稀释以确保od
600
在0.2
‑
0.8的范围内，使用biotek ht平板阅读器(vt，winooski，usa)在室温37℃下，在485
±
20nm的激发波长和528/20nm的发射波长下测量荧光。最后，通过将od
600
和荧光相除来对荧光进行归一化。
[0046]
结果显示，通过接合方式在脱氮副球菌中成功筛选到7个受硝酸盐诱导的不同表达强度启动子，启动子p
0893
、p
4237
、p
nir
、p
1845
、p
3636
、p
2411
和p
1746
在有硝酸盐诱导的情况下单位od的荧光响应值分别是无硝酸盐存在时的6、6.5、10.2、12.6、23.4和27倍，说明启动子受硝酸盐影响较大，在硝酸盐诱导下有优良的表达效率(图2)。
[0047]
实施例4不同硝酸盐浓度下脱氮副球菌硝酸盐诱导型启动子的表达
[0048]
具体实施方式同实施例3，区别在于，将m9培养基中的硝酸盐浓度分别调整为1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2000mg/l，结果显示，单位od的启动子p
1845
在100mg/l时的荧光强度即可达610，p
0893
在100mg/l时的荧光强度即超过200，且在250mg/l～2000mg/l的硝酸盐浓度范围内具有良好的线性关系，有助于实现蛋白表达量的精准调控。
[0049]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。