同时测定有机磷酸酯及其转化产物含量的方法与流程

1.本发明涉及一种磷酸酯衍生物的检测方法，尤其涉及一种同时测定有机磷酸酯及其转化产物含量的方法。


背景技术：

2.opes（organophosphate esters，有机磷酸酯）是一类人工合成的磷酸衍生物，其主要作为阻燃剂和增塑剂广泛应用于电子元器件、塑料、家具和食品包装材料等产品中。由于多溴二苯醚和六溴环十二烷等传统溴代阻燃剂被列入《斯德哥尔摩公约》中而相继禁用，opes在全球阻燃剂市场中的需求量不断增加。据报道，opes类阻燃剂的全球消费量已由2001年的18.6万吨增加到2018年的100万吨。我国2020年opes类阻燃剂的产量已达到29.4万吨。opes作为一类工业添加型助剂，其与产品材料之间没有牢固的化学键合作用，很容易通过挥发、磨损和渗漏等方式进入环境中。值得警惕的是一些opes已被证明具有致癌性、发育和神经毒性及内分泌干扰等毒性。
3.opes的辛醇-水分配系数通常较低（log kow《 5），因而具有较高的亲水性。目前，opes已被发现广泛存在于不同类型水体中，包括污水处理厂的进、出水，地表水、地下水及降水等。opes容易在环境中发生光降解转化，也容易在生物体中发生代谢转化。opes转化产物的辛醇-水分配系数比对应的母体opes低，导致其亲水性和流动性进一步增加。这将使得opes转化产物在水环境中的赋存更加丰富，并且更难以通过饮用水处理程序去除，可能对水生生态系统的健康和饮用水的安全产生额外影响。然而，目前仅有少量研究对饮用水中的opes进行了报道，而忽视了opes转化产物的检测分析和赋存。此外，opes以磷酸基团为核心，以卤代烷基、非卤代烷基或芳香基为侧链。根据侧链基团不同，opes理化性质差异极大，其同类物中包含强极性到弱极性再到非极性、易溶于水到难溶于水、易挥发到难挥发等一系列单体，这也对opes的检测分析带来了巨大挑战。如何研发一种同时对饮用水中opes及其转化产物进行检测的方法已成为研究人员亟需解决的难题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种同时测定opes及转化产物含量的方法，以期至少部分地解决上述技术问题。
5.为了实现上述目的，本发明提出了一种同时测定有机磷酸酯及转化产物含量的方法，包括如下步骤：利用固相萃取小柱对水样中所含的有机磷酸酯及其转化产物进行提取和富集；用溶剂将有机磷酸酯及其转化产物从固相萃取小柱上洗脱下来；通过高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对洗脱后处理得到的样品进行测定，以选择反应离子扫描模式srm作为数据采集方式，同时得到所述有机磷酸酯及其转化产物的含量数值。
6.基于上述方案可知，本发明的检测方法相对于现有技术至少具备如下有益效果之
一：本发明的方法提供了一种采用固相萃取提取结合高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用方法同时快速测定多种opes及转化产物含量的方法；该方法的特点是利用高效液相色谱提高了分析速率、缩短了分析时间，并利用三重四级杆质谱极高灵敏度和抗干扰性，有效降低背景干扰，同时结合固相萃取技术同时提取、富集和净化目标物，简化了样品前处理的繁琐步骤，降低了方法检出限；本发明的方法具有如下优越的技术指标：经过优化最终确定的多种opes的标准曲线相关系数（r2）在0.9951-0.9992之间，方法检出限和定量限分别为0.11-8.75 ng/l和0.38-29.18 ng/l；多种opes转化产物的标准曲线相关系数（r2）在0.9950-0.9990之间，方法检出限和定量限分别为0.56-28.54 ng/l和1.85-95.14 ng/l；本发明的方法通过建立并优化高效液相色谱条件和串联质谱参数，能同时测定三大类（氯代烷基型、非氯代烷基型、芳香基型）共15种opes及9种转化产物，且检测方法具有很好的选择性和灵敏度，可实现水中痕量opes及转化产物的快速识别和精准定量，弥补了目前该领域技术的不足。
附图说明
7.图1为15种opes及9种同位素内标的色谱分离图；图2为9种opes转化产物及7种同位素内标的色谱分离图。
具体实施方式
8.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
9.气相色谱（gas chromatography，gc）和液相色谱（liquid chromatography，lc）串联质谱法是当前检测opes的常用技术。气相色谱法主要适用于分析易挥发、弱极性的opes组分，其中气相色谱-氮磷检测器（gc-npd）和气相色谱-质谱联用（gc-ms；gc-ms/ms）是两种常用的检测技术，但这些技术存在色谱峰拖尾、稳定性不好等缺陷。而且，气相方法不适用于一些沸点较高不易挥发的opes（如tehp）的检测分析，因此普适性较低。与气相方法相比，液相方法更适用于分析难挥发、热不稳定、极性强的opes组分，并且液相色谱与质谱联用技术可以直接检测水样中的opes，不需要进行相转移。
10.然而，目前针对饮用水中opes及转化产物的lc-ms/ms检测方法仍存在很多不足，包括：a、检测的目标opes数量有限，一般在10种以内，且不包含opes转化产物；b、opes及其转化产物的理化性质变化范围很大，包含从强极性到弱极性再到非极性等一系列同类物，因此难以通过单一的前处理方法提取和富集足够多的opes及转化产物；c、opes转化产物的极性强，而反相色谱通常使用基于非极性填料的c18柱，因此很难对其进行色谱保留，从而对应用lc-ms/ms检测opes转化产物带来困难。
11.经过潜心研究和试验，本发明的发明人提出了一种同时测定多种有机磷酸酯（opes）及其转化产物含量的方法，其使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱建立并优化了
三大类（氯代烷基、非氯代烷基和芳香基）共15种opes（tcep、tcipp、tdcipp、tep、tprp、tnbp、tibp、tboep、tehp、tphp、ehdpp、cdpp、tmtp、totp和tptp）和9种opes转化产物（bcipp、bdcipp、dep、bboep、dnbp、mnbp、behp、dphp和dotp）的分析检测方法，以9种同位素标记的标准品（tcep-d12、tcipp-d18、tdcipp-d15、tep-d15、tprp-d21、tnbp-d27、tphp-d15、tptp-d21和tehp-d15）和7种同位素标记的标准品（bdcipp-d10、bcipp-d12、dphp-d10、behp-d34、bboep-d8、dnbp-d18和mnbp-d9）分别作为opes及其转化产物的定量内标，通过对液相和一、二级质谱参数的优化以获取对于目标化合物优秀的选择性和灵敏度，并利用二级质谱在化合物定量上的优势，实现快速识别、精准定量水中的痕量opes及其转化产物。
12.具体地，本发明公开了一种同时测定有机磷酸酯（opes）及其转化产物含量的方法，包括如下步骤：（1）固相萃取小柱提取：利用固相萃取小柱对水样中所含的opes及其转化产物进行提取和富集；（2）溶剂洗脱：用溶剂将目标物从固相萃取小柱上洗脱下来，所用溶剂例如为甲醇等极性溶剂；（3）浓缩：将洗脱液浓缩并定容，转移至进样小瓶中保存；（4）上机检测：通过高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪对样品进行测定，以选择反应离子扫描模式srm作为数据采集方式。
13.其中，上述步骤（1）中的水样可以是饮用水，也可以是回收中水、生活或工业废水等，还可以是其它需要测量微量磷酸酯含量的水样，其中的饮用水包含自来水、纯净水和矿泉水等所有可供人类饮用的水。
14.其中，上述步骤（1）中的固相萃取小柱例如可以选用亲水亲脂的固体吸附柱，如优选沃特世的oasis hlb，上样流速保持约为5ml/min，上样后干燥30min以上。现有技术中，hlb固相萃取柱主要用于样品前处理，萃取其中的半挥发或难挥发性化合物，或去除样品中对分离分析造成干扰的杂质。其可以提高分析物的回收率，更有效地将分析物与干扰组分离，缩短样品预处理过程，操作方便，省时省力。hlb固相萃取柱填料是一种可通用于酸性、中性和碱性化合物的吸附剂，符合理化性质变化很大的opes同类物的提取和富集要求，少量研究已将其应用于opes的提取和富集。但目前的文献资料未发现将其应用于opes转化产物的提取和富集，而本发明人经过反复试验，发现hlb固相萃取柱可以一次性同时提取和富集15种opes和9种opes转化产物，极大地提高了前处理效率，避免了多次试验的累积误差。
15.其中，所述高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪在测定opes时，例如采用waters sunfire c18 反相色谱柱（内径 4.6 mm
×
150 mm长，颗粒厚度3.5 μm）进行色谱分离，温度恒定在40℃。waters sunfire c18 液相色谱柱的优点是在甲酸体系下对碱性化合物的峰型优异，特别适合opes类有机碱化合物的分离。
16.进一步优选地，以添加0.1%甲酸（v/v）的甲醇和水的二元流动相进行梯度洗脱；进一步优选地，以esi为离子源，电离模式为正离子模式。
17.其中，所述高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪在测定opes转化产物时采用thermo acclaim mixed-mode hilic-1液相色谱柱（内径2.1 mm
×
150 mm长，颗粒厚度3.0 μm）进行色谱分离，柱温设定为35℃。
18.优点：acclaim mixed-mode hilic-1色谱柱具有混合模式的固定相，表面为疏水
性烷基链，未端是二醇基团。疏水性基团提高反相保留，末端的二醇基团则促进亲水相互作用，这种结合提高可调选择性，使得acclaim mixed-mode hilic-1能分离c18色谱柱所不能分离的混合物，特别是其可保留高极性化合物，如opes转化产物。
19.进一步优选地，以添加10 mm乙酸铵的超纯水和甲醇（v/v= 2/3）作为流动相进行梯度洗脱。
20.进一步优选地，以esi为离子源，电离模式为负离子模式。
21.下面结合实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的范围不限于此。显然，下文中描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例；基于本发明的下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有实施例，都属于本发明的保护范围。
22.下述实施例中使用的具体方法为一种同时快速测定水中多种opes及转化产物含量的方法，其步骤包括：固相萃取小柱提取：利用固相萃取小柱对水样中opes及转化产物进行提取和富集；洗脱：用甲醇将目标物从固相萃取小柱上洗脱下来；浓缩：对洗脱液进行浓缩并定容，转移至进样小瓶中保存；上机检测：通过高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对样品进行测定。
23.所述固相萃取小柱为oasis hlb（6 ml，150 mg），使用前用乙腈和甲醇各5 ml对小柱进行清洗和活化处理，再使用5 ml超纯水对小柱进行平衡。
24.所述洗脱过程，用两次甲醇溶液进行洗脱，一次5 ml。
25.所述高效液相色谱-质谱条件为：高效液相色谱仪：dionex公司ultimate 3000 hplc；opes色谱分离条件为：色谱柱为waters sunfire c18柱（4.6 mm
×
150 mm, 3.5 μm），柱温为40 ℃，流动相（a：超纯水，b：甲醇，均添加0.1%（v/v）的甲酸），流速设定为1 ml/min，流动相梯度设定如下：0-2分钟10% b，5.5分钟上升为65% b，9.5分钟上升为80% b，11.5分钟100% b，保持3.5分钟，16分钟下降至10%b，保持2.5分钟。进样体积为10 μl。
26.opes转化产物色谱分离条件为：色谱柱为acclaim
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mixed-mode hilic-1柱（2.1 mm
×
150 mm, 3.0 μm），柱温35 ℃，流动相（a：乙腈，b：超纯水/甲醇（v/v=2/3）并添加10 mm的乙酸铵），流速设定为0.35 ml/min，流动相梯度设定如下：0-3分钟3% b，5分钟上升为15% b，保持6分钟，11.2分钟下降至3% b并保持至15分钟。进样体积为20 μl。
27.质谱仪：thermo公司tsq quantiva三重四级杆质谱；离子源：esi；碰撞气和雾化气分别选择高纯氩和高纯氮；数据采集方式：srm。
28.opes测定的质谱参数：电离模式：正离子模式；喷雾电压：3.5kv；离子传输管和喷雾锥温度设定为350℃；鞘气：40；辅助气：25。
29.opes转化产物测定的质谱参数：电离模式：负离子模式；喷雾电压：2.5kv；离子传输管温度为330℃；喷雾锥温度为
350℃；鞘气：30；辅助气：20。
30.表1opes及转化产物的lc-ms/ms参数
化合物全称缩写保留时间（min）母离子子离子（定量/定性）碰撞能量（v）透镜电压（v）磷酸三乙酯tep8.13183.199.0/127.018.4/10.336.7磷酸三丙酯tprp10.95225.299.0/141.117.5/10.340.1磷酸三异丁酯tibp12.76267.299.0/155.116.4/10.339.1磷酸三丁酯tnbp12.82267.299.0/155.118.3/10.346.1磷酸三（丁氧基乙基）酯tboep12.96399.3299.1/199.110.3/14.561.6磷酸三（2-乙基己基）酯tehp15.99435.499.0/211.117.3/10.354.0磷酸三苯酯tphp12.44327.2152.1/215.137.0/26.091.3磷酸甲苯二苯酯cdpp12.76341.2152.1/229.034.1/26.191.6磷酸三间甲苯酯tmtp13.21369.2169.1/243.044.5/27.7104.9磷酸三邻甲苯酯totp13.21369.2169.1/243.044.9/25.894.8磷酸三对甲苯酯tptp13.21369.2169.1/243.042.0/27.696.0磷酸-2-乙基己基二苯酯ehdpp13.39363.3251.0/153.010.3/29.240.6磷酸三（2-氯乙基）酯tcep8.78285.199.0/222.921.8/10.365.3磷酸三（2-氯丙基）酯tcipp11.05327.199.0/175.021.8/10.346.1磷酸三（1，3-二氯-2-丙基）酯tdcipp12.46431.099.0/208.924.3/14.771.0磷酸三乙酯-d15tep-d158.05198.3102.0/134.019.9/10.342.4磷酸三丙酯-d21tprp-d2110.81246.3102.0/150.119.3/10.345.6磷酸三丁酯-d27tnbp-d2712.77294.4102.0/166.119.7/10.349.5磷酸三（2-乙基己基）酯-d51tehp-d5116.10486.8102.0/230.120.0/10.357.4磷酸三苯酯-d15tphp-d1512.38342.2160.1/223.139.7/27.670.8磷酸三对甲苯酯-d21tptp-d2113.16390.3174.1/251.148.6/30.578.0磷酸三（2-氯乙基）酯-d12tcep-d128.74297.1102.0/130.023.7/16.861.9磷酸三（2-氯丙基）酯-d18tcipp-d1810.96345.2102.0/183.022.7/12.850.5磷酸三（1，3-二氯-2-丙基）酯-d15tdcipp-d1512.43446.1102.0/215.925.7/16.165.6磷酸二乙酯dep9.01153.179.0/125.0-25.2/-10.3-44.1磷酸二丁酯dnbp8.55209.279.0/153.0-29.1/-15.7-61.9磷酸一丁酯mnbp9.01153.279.1/97.0-17.2/-15.3-39.6磷酸二（2-丁氧基-乙基）酯bboep8.49297.279.1/197.1-30.9/-20.1-83.9磷酸二（2-乙基己基）酯behp8.10321.379.1/209.1-33.4/-21.9-93.0磷酸二（2-氯丙基）酯bcipp1.62249.135.2/249.1-10.3/-10.3-32.0磷酸二（1，3-二氯-2丙基）酯bdcipp1.49318.935.2/318.9-10.3/-10.3-39.4磷酸二苯酯dphp1.62249.293.1/155.0-30.7/-23.3-81.4磷酸二邻甲苯酯dotp1.70277.1107.1/169.0-31.7/-25.7-88.3磷酸二丁酯-d18dnbp-d188.59227.379.0/163.1-30.4/-17.7-69.0磷酸一丁酯-d9mnbp-d98.58162.279.1/98.0-18.8/-16.7-39.1磷酸二（2-丁氧基-乙基）酯-d8bboep-d88.53305.279.1/230.2-31.6/-22.2-86.9磷酸二（2-乙基己基）酯-d34behp-d348.12355.779.1/227.2-36.9/-25.4-104.9磷酸二（2-氯丙基）酯-d12bcipp-d121.63261.235.2/261.1-10.3/-10.3-39.0磷酸二（1，3-二氯-2丙基）酯-d10bdcipp-d101.49329.035.2/328.9-10.8/-10.3-42.0磷酸二苯酯-d10dphp-d101.63259.298.2/179.1-32.0/-23.3-86.4
下面结合具体实施例对本发明进行说明。所使用的高效液相色谱-质谱条件与上述技术方案一致。
31.实验准备及标准样品的制备1、标准曲线样品配制：（1）opes：将15种opes标准品（tcep、tcipp、tdcipp、tep、tprp、tnbp、tibp、tboep、tehp、tphp、ehdpp、cdpp、tmtp、totp和tptp）和9种同位素标准品（tcep-d12、tcipp-d18、tdcipp-d15、tep-d15、tprp-d21、tnbp-d27、tphp-d15、tptp-d21和tehp-d15）分别用甲醇配制成浓度为1mg/l的混合标样储备液，利用该储备液配制0.1-500ng/l的混合标准使用
液，其中同位素内标的浓度为10 ng/l。
32.（2）opes转化产物：将9种opes转化产物标准品（bcipp、bdcipp、dep、bboep、dnbp、mnbp、behp、dphp和dotp）和7种同位素标准品（bdcipp-d10、bcipp-d12、dphp-d10、behp-d34、bboep-d8、dnbp-d18和mnbp-d9）分别用乙腈配制成浓度为1 mg/l的混合标样储备液，利用该储备液配制0.1-500 ng/l的混合标准使用液，其中同位素内标的浓度为10 ng/l。
33.2、标准曲线的绘制：利用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，按发明内容中所述仪器条件对各浓度梯度混合标准品使用液质进行检测，以目标物和对应同位素内标的选择离子对色谱峰面积比为纵坐标，对应目标物浓度为横坐标绘制内标标准曲线。结果表明：15种opes的标准曲线相关系数（r2）在0.9951-0.9992之间，仪器检出限和定量限分别为0.11-8.75 ng/l和0.38-29.18 ng/l；9种opes转化产物的标准曲线相关系数（r2）在0.9950-0.9990之间，仪器检出限和定量限分别为0.56-28.54 ng/l和1.85-95.14 ng/l。
34.实施例1取6份1l纯净水，向其中3份加入100 μl浓度为0.1 mg/l的opes混合标准品（tcep、tcipp、tdcipp、tep、tprp、tnbp、tibp、tboep、tehp、tphp、ehdpp、cdpp、tmtp、totp和tptp）和100 μl浓度为0.1 mg/l的同位素混合标准品（tcep-d12、tcipp-d18、tdcipp-d15、tep-d15、tprp-d21、tnbp-d27、tphp-d15、tptp-d21和tehp-d15）。另外3份纯净水样品中仅加入100 μl浓度为0.1 mg/l的opes同位素混合标准品。
35.样品处理：用预先活化和平衡好的oasis hlb小柱进行固相萃取，上样速率保持约为5 ml/min，上样后将spe小柱干燥30 min以上；干燥后按发明内容中的方法洗脱，两次洗脱液收集在同一收集瓶中，利用高纯氮气以适合流速将洗脱液吹至近干，以甲醇定容至1ml，转移至进样小瓶中并保存在-20℃冰箱中待测。
36.仪器测定与定性定量：根据保留时间和特征离子对，确定15种opes和9种同位素内标的色谱峰（见图1），以及9种opes转化产物和7种同位素内标的色谱峰（见图2）；根据目标物和对应内标的峰面积比值，利用内标法计算样品浓度。纯净水中15种opes的回收率均在70%-103%之间（除tdcipp 60.8%，cdpp 61.1%，tphp 68.6%），9种opes转化产物的回收率均在81.8%-116%之间。
37.实施例2取6份1l自来水，向其中3份加入100μl浓度为0.1 mg/l的opes混合标准品（tcep、tcipp、tdcipp、tep、tprp、tnbp、tibp、tboep、tehp、tphp、ehdpp、cdpp、tmtp、totp和tptp）和100μl浓度为0.1 mg/l的opes同位素混合标准品（tcep-d12、tcipp-d18、tdcipp-d15、tep-d15、tprp-d21、tnbp-d27、tphp-d15、tptp-d21和tehp-d15）。另外3份自来水样品中仅加入100 μl浓度为0.1 mg/l的opes同位素混合标准品。
38.如实施例2进行样品处理和仪器分析。自来水中15种opes的回收率均在70.0%-98.8%之间（除tphp 64.3%，cdpp 60.2%，tibp 65.2%和ehdpp 63.5%），9种opes转化产物的回收率均在80.8%-107%之间。
39.通过上述实施例可知，本发明的方法可以一次同时测定15种opes和9种opes转化产物，且检出限和检测精度均远高于现有技术中的检测方法，目前文献还未发现记载有可以同时检测opes转化产物的方案。
40.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详
细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。