改进的用于生产类异戊二烯的方法与流程

改进的用于生产类异戊二烯的方法
1.发明描述
2.本发明属于生物催化、生物转化和发酵领域，并且涉及一种用于生产异戊烯二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸和/或由其衍生的类异戊二烯(isoprenoid)的方法。
3.引言
4.类异戊二烯呈现出令人难以置信的多样化类别的天然产物，其广泛应用于调味剂和芳香剂、化妆品、农业、营养以及药物结构单元(chandran，s.s.，j.t.kealey和c.d.reeves，microbial production of isoprenoids.process biochemistry，2011.46(9)：p.1703-1710)。通过关键中间体异戊烯二磷酸(ipp)及其异构体二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)进行类异戊二烯的生物合成。在自然界中，这些中间体通过甲羟戊酸或1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸途径组装，所述途径都是初级代谢的分支。这两种途径对于生产生物体都是能量密集的，并且它们都受到高度复杂的调控。最终，这限制了理论上可实现的碳产率，并因此限制了通过这种途径的类异戊二烯的最小生产成本。在这点上，绕过甲羟戊酸和1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸途径的ipp或dmapp的替代途径提供了实现显著降低类异戊二烯生产成本的巨大潜力。最近，stephanopoulos的研究小组(chatzivasileiou，a.o.等，two-step pathway for isoprenoid synthesis.proc natl acad sci u s a，2019.116(2)：p.506-511；ward，v.c.a.，a.o.chatzivasileiou和g.stephanopoulos，cell free biosynthesis of isoprenoids from isopentenol.biotechnol bioeng，2019.116(12)：p.3269-3281)、gonzalez(clomburg，j.m.等，the isoprenoid alcohol pathway,a synthetic route for isoprenoid biosynthesis.proc natl acad sci u s a，2019.116(26)：p.12810-12815)和williams(lund，s.，r.hall，和g.j.williams，an artificial pathway for isoprenoid biosynthesis decoupled from native hemiterpene metabolism.acs synth biol，2019.8(2)：p.232-238)提出了此类替代途径。他们设想了一条人工途径，其从容易获得的化学合成的isoprenol或prenol开始，并通过两个随后的磷酸化反应构建ipp和dmapp。在第一步中，酶激酶1从isoprenol合成异戊烯磷酸(ip)或从prenol合成二甲基烯丙基二磷酸(dmap)。这两种产物是激酶2的底物，激酶2转移第二个磷酸部分以产生ipp或dmapp。在人工途径内，有效的激酶1以及有效的激酶2的鉴定构成了相当大的挑战，因为激酶1的反应性在自然界中没有被描述，并且激酶2通常具有低效率。我们鉴定了能够从isoprenol/prenol高产率生产ip/dmap的有效激酶1催化剂的酶，以及能够从ip/dmap高产率生产ipp/dmapp的有效激酶2催化剂的酶。此外，我们可以从这些中间体开始高效地生产类异戊二烯。
5.发明详述
6.本发明的第一实施方案包含分离的激酶1，其能够在包含水、激酶1和isoprenol和/或prenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg2 )的水性介质中催化从isoprenol(3-甲基-3-丁烯-1-醇)和/或prenol(3,3-二甲基烯丙醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇)到异戊烯磷酸(异戊烯单磷酸、3-甲基丁-3-烯基二氢磷酸)或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸(3-甲基丁-2-烯基二氢磷酸)或其盐的反应，其中在温育后，至少10％，优选地至少15％、更优选地至少20％、甚至更优选地至少25％、甚至更优选地至少30％、甚至更优选地
至少35％、甚至更优选地至少40％、甚至更优选地至少45％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少55％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少65％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少75％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
7.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
8.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
9.在优选的实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
10.在本发明的一个实施方案中，分离的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
11.在本发明的另一个实施方案中，分离的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y，非33g或s，非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
12.在一个实施方案中，分离的激酶1包含选自以下的序列：
13.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子和
14.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
15.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
16.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
17.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、
136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
18.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应，和
19.其中在温育后至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少35％、甚至更优选至少40％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少55％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少65％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
20.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
21.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
22.在优选的实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
23.在本发明的一个实施方案中，如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
24.在本发明的再一个实施方案中，如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y，非33g或s，非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
25.本发明的再一个实施方案是分离的激酶1，其包含选自以下的序列：
26.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子；和
27.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
28.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核
酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
29.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
30.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
31.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应。
32.本发明的再一个实施方案是生产异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐的方法，所述方法包括以下步骤：
33.i.提供水性介质，其包含水、一种或多种激酶1和prenol和/或isoprenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg
2
)，和
34.ii.温育水性介质，和
35.iii.任选地从反应混合物分离异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙磷酸或其盐，
36.其中一种或多种激酶1能够催化在包含水、激酶1和prenol和/或isoprenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg
2
)的水性介质中从prenol和/或isoprenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应，其中在温育后，至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少35％、甚至更优选至少40％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少55％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少65％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
37.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
38.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
39.在优选实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
40.水性介质可以是溶液或悬浮液或溶液和悬浮液，其中包含在所述水性介质中的任
何物质可以完全或部分溶解和/或部分或完全悬浮。
41.在本发明方法的一个实施方案中，激酶1包含选自以下的序列：
42.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子；和
43.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
44.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段；和
45.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段；和
46.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
47.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应，并且其中在温育后至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少35％、甚至更优选至少40％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少55％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少65％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少75％，甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
48.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
49.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
50.在优选的实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐。
51.在本发明的一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶
1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
52.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
53.本发明的另一个实施方案是生产异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐的方法，所述方法包括以下步骤：
54.i.提供水性介质，其包含水、一种或多种激酶1和isoprenol和/或prenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg
2
)，和
55.ii.温育水性介质，和
56.iii.任选从反应混合物分离异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸或其盐，
57.其中一种或多种激酶1包含选自以下的序列：
58.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
59.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
60.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
61.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
62.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
63.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应。
64.在本发明的一个实施方案中，如b.，c.，d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
65.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
66.水性介质可以是溶液或悬浮液或溶液和悬浮液，其中包含在所述水性介质中的任何物质可以完全或部分溶解和/或部分或完全悬浮。
lacticum)、根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(agrobacterium radiobacter)、粪产碱菌(alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(arthrobacter citreus)、肿胀节杆菌(arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(arthrobacter paraffineus)、arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌(arthrobacter oxydans)、天牛短小杆菌(aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(azotobacter indicus)、产氨短杆菌(brevibacterium ammoniagenes)、叉枝短杆菌(brevibacterium divaricatum)、乳发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、球形短杆菌(brevibacterium globosum)、褐色短杆菌(brevibacterium fuscum)、酮谷氨酸短杆菌(brevibacterium ketoglutamicum)、brevibacterium helcolum、brevibacterium pusillum、需土短杆菌(brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(brevibacterium roseum)、brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(brevibacterium linens)、brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(erwinia chrysanthemi)、奇异黄杆菌(flavobacterium peregrinum)、flavobacterium fucatum、橙色黄杆菌(flavobacterium aurantinum)、莱菌黄杆菌(flavobacterium rhenanum)、缝黄杆菌(flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(flavobacterium breve)、脑膜炎黄杆菌(flavobacterium meningosepticum)、微球菌属种ccm825、摩氏变形菌(morganella morganii)、不透明诺卡氏菌(nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(nocardia rugosa)、planococcus eucinatus、雷氏变形菌(proteus rettgeri)、谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵状假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种atcc 15592、红球菌属物种atcc 19070、脲芽孢八叠球菌(sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、麦氏弧菌(vibrio metschnikovii)、乳酪弧菌(vibrio tyrogenes)、马杜拉诺卡氏菌(actinomadura madurae)、actinomyces violaceochromogenes、kitasatosporia parulosa、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、streptomyces flavelus、浅灰链霉菌(streptomyces griseolus)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(aeromonas salmonicida)、短小芽孢
杆菌(bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、解硫胺素芽孢杆菌(bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(microbacterium ammoniaphilum)、粘质沙雷菌(serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、肖特苗勒氏沙门氏菌(salmonella schottmulleri)或柑橘黄单胞菌(xanthomonas citri)、集胞藻属(synechocystis sp.)、细长集球藻(synechococcus elongatus)、细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)、铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)、念珠藻属(nostoc sp.)、普通念珠藻(n.commune)、球形念珠藻(n.sphaericum)、点形念珠藻(nostoc punctiforme)、钝顶念珠藻(spirulina platensis)、巨大鞘丝藻(lyngbya majuscula)、赖氏鞘丝藻(l.lagerheimii)、纤细席藻(phormidium tenue)、鱼腥藻属(anabaena sp.)、瘦鞘丝藻属(leptolyngbya sp.)。
83.可用于本发明的真核微生物包括但不限于酵母属(saccharomyces spec)，如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，汉逊酵母属(hansenula spec)，如多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)，裂殖酵母属(schizosaccharomyces spec)，如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属(kluyveromyces spec)，如乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)和马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属(yarrowia spec)，如解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、毕赤酵母属(pichia spec)，如甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、树干毕赤酵母(pichia stipites)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，接合酵母属(zygosaccharomyces spec)，如鲁氏接合酵母(zygosaccharomyces rouxii)和拜氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)，假丝酵母属(candida spec)，如博伊丁假丝酵母(candida boidinii)、产朊假丝酵母(candida utilis)、弗里思假丝酵母(candida freyschussii)、光滑假丝酵母(candida glabrata)和candida sonorensis，许旺酵母属(schwanniomyces spec)，如西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)，阿氏酵母属(arxula spec)，如解腺嘌呤阿氏酵母(arxula adeninivorans)，ogataea spec，如ogataea minuta，克雷伯氏菌属(klebsiella spec)，如肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia)，曲霉属(aspergillus spec)，如黑曲霉(aspergillus niger)或嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)。
84.本发明优选的微生物包括玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、气球菌属(aerococcus sp.)、曲霉属(aspergillus sp.)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、clostridium algidicarnis、高效棒状杆菌(corynebacterium efficiens)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、沃氏产卤菌(haloferax volcanii)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus jannaschii)、热自养甲烷热杆菌(methanothermobacter thermautotrophicus)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、固氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵形假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、嗜酸假单胞菌(pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、筑波拟酵母
(pseudozyma tsukubaensis)、真养罗氏菌(ralstonia eutropha)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、浑浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、鲍氏志贺氏菌(shigella boydii)、草木樨中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、黄链霉菌(streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(streptomyces griseolus)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、嗜酸热原体(thermoplasma acidophilum)、需钠弧菌(vibrio natrigens)或解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
85.特别优选的微生物是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、混浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
86.本发明的再一个实施方案是组合物，其包含水、激酶1、异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg2)，其中激酶1包含选自以下的序列：
87.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
88.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
89.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
90.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
91.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
92.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应。
93.在本发明的一个实施方案中，如b.，c.，d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
94.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
95.本发明的再一个实施方案是生产异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的方法，该方法包括以下步骤：
96.i.提供水性介质，其包含水、一种或多种激酶1、一种或多种激酶2和prenol和/或isoprenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg2)，和
97.ii.温育水性介质，和
98.iii.任选地从反应混合物分离异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐，
99.其中一种或多种激酶1能够催化在包含水、激酶1和prenol和/或isoprenol的水性介质中从prenol和/或isoprenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应，和
100.其中一种或多种激酶2能够催化在包含水、激酶2和异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸和任选的核苷酸三磷酸酯(优选atp)和二价阳离子(优选mg2 )的水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应，其中在温育后至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少35％、甚至更优选至少40％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少55％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少65％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。
101.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
102.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
103.在优选实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。
104.水性介质可以是溶液或悬浮液或溶液和悬浮液，其中包含在所述水性介质中的任何物质可以完全或部分溶解和/或部分或完全悬浮。
105.在本发明用于生产异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的方法的一个实施方案中，激酶1包含选自以下的序列：
106.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
107.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
108.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
109.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
110.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
111.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应，其中在温育后至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少35％、甚至更优选至少40％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少55％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少65％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。
112.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
113.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
114.在优选实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。
115.在本发明的一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
116.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/
或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
117.在用于生产异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的本发明的另一种方法中，激酶2包含选自以下的序列：
118.f.seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子，和
119.g.与seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
120.h.由seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
121.i.由与seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
122.j.由与在严格条件下互补于seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
123.其中如g.、h.、i.和j中限定的氨基酸分子催化水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应，其中在温育后至少10％、优选至少15％、更优选至少20％、甚至更优选至少25％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少35％、甚至更优选至少40％、甚至更优选至少45％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少55％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少65％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少96％、97％、98％、99％或100％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。
124.水性介质的温育时间可以是至少0.5h、至少1h、至少1.5h、至少2h、至少2.5h、至少5h、至少10h或至少12h。
125.在一个实施方案中，温育在10℃至50℃，优选在15℃至40℃，更优选在20℃至40
℃，甚至更优选在24℃至37℃，最优选在36℃至38℃下进行。
126.在优选的实施方案中，在37℃下温育10小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少20％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育7小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在甚至更优选的实施方案中，在37℃下温育18h后，至少40％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。在最优选的实施方案中，在37℃下温育5小时后，至少25％的isoprenol和/或prenol转化为异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸。
127.本发明的另一个实施方案是生产异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的方法，其包括以下步骤：
128.i.提供水性介质，其包含水、一种或多种激酶1、一种或多种激酶2和isoprenol和/或prenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg2)，和
129.ii.温育水性介质，和
130.iii.任选从反应混合物中分离异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐，
131.其中所述一种或多种激酶1选自
132.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
133.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
134.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
135.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
136.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
137.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应。
138.在本发明的一个实施方案中，如b.，c.，d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
139.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或
201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
140.在用于生产异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的本发明的另一种方法中，激酶2包含选自以下的序列：
141.f.seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子，和
142.g.与seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
143.h.由seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
144.i.由与seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
145.j.由与在严格条件下互补于seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
146.其中如g.、h.、i.和j.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应。
147.在优选的实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:37具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
148.激酶2包含与seq id no:85具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列
同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
149.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:1具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
150.激酶2包含与seq id no:486具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
151.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:291具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
152.激酶2包含与seq id no:103具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
153.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:46具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
154.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
155.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:49具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
156.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
157.水性介质可以是溶液或悬浮液或溶液和悬浮液，其中包含在所述水性介质中的任何物质可以完全或部分溶解和/或部分或完全悬浮。
158.本发明的另一个实施方案是包含激酶1和激酶2的重组构建体，其中激酶1包含编码选自以下的氨基酸分子的序列：
159.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
160.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
161.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
162.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
163.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
164.其中如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应。
165.在本发明的一个实施方案中，如b.，c.，d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
166.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
167.在包含激酶1和激酶2的重组构建体的一个实施方案中，激酶2包含编码选自以下的氨基酸分子的序列：
168.f.seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子，和
169.g.与seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
170.h.由seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
171.i.由与seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
172.j.由与在严格条件下互补于seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
173.其中如g.、h.、i.和j.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应。
174.在优选的实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:37具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
175.激酶2包含与seq id no:85具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
176.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:1具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
177.激酶2包含与seq id no:486具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列
同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
178.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:291具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
179.激酶2包含与seq id no:103具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
180.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:46具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
181.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
182.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:49具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
183.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
184.在包含激酶1和激酶2的重组构建体的另一个实施方案中，激酶1和激酶2各自与异源调控元件(例如启动子、终止子、增强子或任何其他异源元件)功能性地连接。
185.本发明的另一个实施方案是包含重组构建体的重组载体，所述重组构建体包含激酶1和激酶2，其中激酶1和激酶2各自与异源例如启动子、终止子、增强子或任何其他异源元件功能性地连接。
186.在特别优选的实施方案中，所述载体包含seq id no:109、110或491的序列。
187.本发明的另一个实施方案是重组微生物，其包含含有激酶1和激酶2的重组构建体，其中激酶1和激酶2各自与异源调控元件功能性地连接，或包含含有所述重组构建体的
重组载体。
188.包含含有激酶1和激酶2(其中激酶1和激酶2各自与异源调控元件功能性地连接)的重组构建体或包含含有所述重组构建体的重组载体的重组微生物优选选自包含以下的列表：氧化葡糖杆菌(gluconobacter oxydans)、浅井氏葡糖杆菌(gluconobacter asaii)、德尔马瓦无色杆菌(achromobacter delmarvae)、粘无色杆菌(achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(achromobacter lacticum)、根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(agrobacterium radiobacter)、粪产碱菌(alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(arthrobacter citreus)、肿胀节杆菌(arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(arthrobacter paraffineus)、arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌(arthrobacter oxydans)、天牛短小杆菌(aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(azotobacter indicus)、产氨短杆菌(brevibacterium ammoniagenes)、叉枝短杆菌(brevibacterium divaricatum)、乳发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、球形短杆菌(brevibacterium globosum)、褐色短杆菌(brevibacterium fuscum)、酮谷氨酸短杆菌(brevibacterium ketoglutamicum)、brevibacterium helcolum、brevibacterium pusillum、需土短杆菌(brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(brevibacterium roseum)、brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(brevibacterium linens)、brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(erwinia chrysanthemi)、奇异黄杆菌(flavobacterium peregrinum)、flavobacterium fucatum、橙色黄杆菌(flavobacterium aurantinum)、莱菌黄杆菌(flavobacterium rhenanum)、缝黄杆菌(flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(flavobacterium breve)、脑膜炎黄杆菌(flavobacterium meningosepticum)、微球菌属种ccm825、摩氏变形菌(morganella morganii)、不透明诺卡氏菌(nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(nocardia rugosa)、planococcus eucinatus、雷氏变形菌(proteus rettgeri)、谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵状假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种atcc 15592、红球菌属物种atcc 19070、脲芽孢八叠球菌(sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、麦氏弧菌(vibrio metschnikovii)、乳酪弧菌(vibrio tyrogenes)、马杜拉诺卡氏菌(actinomadura madurae)、actinomyces violaceochromogenes、kitasatosporia parulosa、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、streptomyces flavelus、浅灰
链霉菌(streptomyces griseolus)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(aeromonas salmonicida)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、解硫胺素芽孢杆菌(bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(microbacterium ammoniaphilum)、粘质沙雷菌(serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、肖特苗勒氏沙门氏菌(salmonella schottmulleri)或柑橘黄单胞菌(xanthomonas citri)、集胞藻属(synechocystissp.)、细长集球藻(synechococcus elongatus)、细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)、铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)、念珠藻属(nostoc sp.)、普通念珠藻(n.commune)、球形念珠藻(n.sphaericum)、点形念珠藻(nostoc punctiforme)、钝顶念珠藻(spirulina platensis)、巨大鞘丝藻(lyngbya majuscula)、赖氏鞘丝藻(l.lagerheimii)、纤细席藻(phormidium tenue)、鱼腥藻属(anabaena sp.)、瘦鞘丝藻属(leptolyngbya sp.)、酵母属(saccharomyces spec)，如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，汉逊酵母属(hansenula spec)，如多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)，裂殖酵母属(schizosaccharomyces spec)，如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属(kluyveromyces spec)，如乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)和马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属(yarrowia spec)，如解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、毕赤酵母属(pichia spec)，如甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、树干毕赤酵母(pichia stipites)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，接合酵母属(zygosaccharomyces spec)，如鲁氏接合酵母(zygosaccharomyces rouxii)和拜氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)，假丝酵母属(candida spec)，如博伊丁假丝酵母(candida boidinii)、产朊假丝酵母(candida utilis)、弗里思假丝酵母(candida freyschussii)、光滑假丝酵母(candida glabrata)和candida sonorensis，许旺酵母属(schwanniomyces spec)，如西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)，阿氏酵母属(arxula spec)，如解腺嘌呤阿氏酵母(arxula adeninivorans)，ogataea spec，如ogataea minuta，克雷伯氏菌属(klebsiella spec)，如肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia)，曲霉属(aspergillus spec)，如黑曲霉(aspergillus niger)或嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)。
189.更优选，重组微生物是玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、气球菌属(aerococcussp.)、曲霉属(aspergillus sp.)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、clostridium algidicarnis、高效棒状杆菌(corynebacterium efficiens)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、沃氏产卤菌(haloferax volcanii)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus jannaschii)、热自养甲烷热杆菌(methanothermobacter thermautotrophicus)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、巴斯德毕赤酵母
(pichia pastoris)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、固氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵形假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、嗜酸假单胞菌(pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)、真养罗氏菌(ralstonia eutropha)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、浑浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、鲍氏志贺氏菌(shigella boydii)、草木樨中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、黄链霉菌(streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(streptomyces griseolus)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、嗜酸热原体(thermoplasma acidophilum)、需钠弧菌(vibrio natrigens)或解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
190.特别优选的微生物是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、混浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
191.本发明的另一个实施方案是一种组合物，其包含水、一种或多种激酶1、一种或多种激酶2、isoprenol和/或prenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg2)，其中激酶1选自
192.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
193.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
194.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
195.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
196.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
197.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或
prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸的反应。
198.在本发明的一个实施方案中，如b.，c.，d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
199.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
200.在包含水、一种或多种激酶1、一种或多种激酶2、isoprenol和/或prenol和任选的核苷酸三磷酸(优选atp)和二价阳离子(优选mg2)的组合物的另一个实施方案中，激酶2选自以下：
201.f.seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子，和
202.g.与seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
203.h.由seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
204.i.由与seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
205.j.由与在严格条件下互补于seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
206.其中如g.、h.、i.和j.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应。
207.在优选的实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:37具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
208.激酶2包含与seq id no:85具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
209.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:1具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
210.激酶2包含与seq id no:486具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
211.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:291具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
212.激酶2包含与seq id no:103具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
213.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:46具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
214.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列
idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
228.在包含引入的、增加的或增强的一种或多种激酶1、一种或多种激酶2和任选地能够产生一种或多种类异戊二烯(优选橙花叔醇、法呢醇或法呢烯)的一种或多种途径的活性和/或表达的重组微生物的另一个实施方案中，激酶2包含选自以下的序列：
229.f.seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子，和
230.g.与seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
231.h.由seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
232.i.由与seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
233.j.由与在严格条件下互补于seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
234.其中如g.、h.、i.和j.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应。
235.本发明的另一个实施方案是用于发酵生产一种或多种类异戊二烯(优选橙花叔醇、法呢醇或法呢烯)或异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的方法，其包括以下步骤：
236.i.提供重组微生物，其包含引入的、增加的或增强的一种或多种激酶1、一种或多种激酶2和任选地能够产生一种或多种类异戊二烯的一种或多种途径的活性和/或表达，
237.ii.在允许产生所述一种或多种类异戊二烯或其盐或异戊烯焦磷酸和/或二甲基
烯丙基焦磷酸或其盐的条件下，在包含prenol和/或isoprenol的介质中培养所述微生物，并任选地从介质分离所述一种或多种类异戊二烯或其盐或异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐。
238.本发明的另一个实施方案是包含一种或多种重组微生物的组合物，所述重组微生物包含引入的、增加的或增强的一种或多种激酶1、一种或多种激酶2和任选地能够产生一种或多种类异戊二烯的一种或多种途径的活性和/或表达。
239.在一个实施方案中，所述组合物还包含prenol和/或isoprenol、介质和碳源。
240.本发明的再一个实施方案是一种生产重组微生物的方法，所述重组微生物包含引入的、增加的或增强的一种或多种激酶1、一种或多种激酶2和任选地能够产生一种或多种类异戊二烯(优选橙花叔醇、法呢醇或法呢烯)的一种或多种途径的活性和/或表达，所述方法包括以下步骤：
241.(i)在所述微生物中引入、增加或增强编码具有prenol和/或isoprenol磷酸化活性的激酶1酶的激酶1基因的活性和/或表达；和
242.(ii)在所述微生物中引入、增加或增强编码具有异戊烯基磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸磷酸化活性的激酶2酶的激酶2基因的活性和/或表达；和任选地
243.(iii)在所述微生物中进一步引入、增加或增强类异戊二烯产生途径的活性和/或表达。
244.根据如上限定的方法生产的或发酵生产一种或多种类异戊二烯或其盐或异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的方法中使用的重组微生物优选选自氧化葡糖杆菌(gluconobacter oxydans)、浅井氏葡糖杆菌(gluconobacter asaii)、德尔马瓦无色杆菌(achromobacter delmarvae)、粘无色杆菌(achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(achromobacter lacticum)、根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(agrobacterium radiobacter)、粪产碱菌(alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(arthrobacter citreus)、肿胀节杆菌(arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(arthrobacter paraffineus)、arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌(arthrobacter oxydans)、天牛短小杆菌(aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(azotobacter indicus)、产氨短杆菌(brevibacterium ammoniagenes)、叉枝短杆菌(brevibacterium divaricatum)、乳发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、球形短杆菌(brevibacterium globosum)、褐色短杆菌(brevibacterium fuscum)、酮谷氨酸短杆菌(brevibacterium ketoglutamicum)、brevibacterium helcolum、brevibacterium pusillum、需土短杆菌(brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(brevibacterium roseum)、brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(brevibacterium linens)、brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(erwinia chrysanthemi)、奇异黄杆菌(flavobacterium peregrinum)、flavobacterium fucatum、橙
色黄杆菌(flavobacterium aurantinum)、莱菌黄杆菌(flavobacterium rhenanum)、缝黄杆菌(flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(flavobacterium breve)、脑膜炎黄杆菌(flavobacterium meningosepticum)、微球菌属种ccm825、摩氏变形菌(morganella morganii)、不透明诺卡氏菌(nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(nocardia rugosa)、planococcus eucinatus、雷氏变形菌(proteus rettgeri)、谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵状假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种atcc 15592、红球菌属物种atcc 19070、脲芽孢八叠球菌(sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、麦氏弧菌(vibrio metschnikovii)、乳酪弧菌(vibrio tyrogenes)、马杜拉诺卡氏菌(actinomadura madurae)、actinomyces violaceochromogenes、kitasatosporia parulosa、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、streptomyces flavelus、浅灰链霉菌(streptomyces griseolus)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(aeromonas salmonicida)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、解硫胺素芽孢杆菌(bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(microbacterium ammoniaphilum)、粘质沙雷菌(serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、肖特苗勒氏沙门氏菌(salmonella schottmulleri)或柑橘黄单胞菌(xanthomonas citri)、集胞藻属(synechocystissp.)、细长集球藻(synechococcus elongatus)、细长嗜热聚球藻(thermosynechococcus elongatus)、铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)、念珠藻属(nostoc sp.)、普通念珠藻(n.commune)、球形念珠藻(n.sphaericum)、点形念珠藻(nostoc punctiforme)、钝顶念珠藻(spirulina platensis)、巨大鞘丝藻(lyngbya majuscula)、赖氏鞘丝藻(l.lagerheimii)、纤细席藻(phormidium tenue)、鱼腥藻属(anabaena sp.)、瘦鞘丝藻属(leptolyngbya sp.)、酵母属(saccharomyces spec)，如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，汉逊酵母属(hansenula spec)，如多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)，裂殖酵母属(schizosaccharomyces spec)，如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属(kluyveromyces spec)，如乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)和马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属(yarrowia spec)，如解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、毕赤酵母属(pichia spec)，如甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、树干毕赤酵母(pichia stipites)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，接合酵母属(zygosaccharomyces spec)，如鲁氏接合酵母(zygosaccharomyces rouxii)和拜
氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)，假丝酵母属(candida spec)，如博伊丁假丝酵母(candida boidinii)、产朊假丝酵母(candida utilis)、弗里思假丝酵母(candida freyschussii)、光滑假丝酵母(candida glabrata)和candida sonorensis，许旺酵母属(schwanniomyces spec)，如西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)，阿氏酵母属(arxula spec)，如解腺嘌呤阿氏酵母(arxula adeninivorans)，ogataea spec，如ogataea minuta，克雷伯氏菌属(klebsiella spec)，如肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumonia)，曲霉属(aspergillus spec)，如黑曲霉(aspergillus niger)或嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)。
245.更优选，重组微生物是玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、气球菌属(aerococcussp.)、曲霉属(aspergillus sp.)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、clostridium algidicarnis、高效棒状杆菌(corynebacterium efficiens)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、沃氏产卤菌(haloferax volcanii)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus jannaschii)、热自养甲烷热杆菌(methanothermobacter thermautotrophicus)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、固氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵形假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、嗜酸假单胞菌(pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)、真养罗氏菌(ralstonia eutropha)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、浑浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、鲍氏志贺氏菌(shigella boydii)、草木樨中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、黄链霉菌(streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(streptomyces griseolus)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、嗜酸热原体(thermoplasma acidophilum)、需钠弧菌(vibrio natrigens)或解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
246.特别优选的微生物是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、混浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
247.本发明的再一个实施方案是重组表达构建体，其包含
248.i.功能性地连接编码激酶1的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，和
249.ii.功能性地连接编码激酶2的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，
250.其中至少一个功能性地连接激酶1或激酶2的启动子与激酶1或激酶2是异源的，
251.其中激酶1包含编码选自以下的氨基酸分子的序列：
252.a.seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子，和
253.b.与seq id no:43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390或393的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
254.c.由seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
255.d.由与seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
256.e.由与在严格条件下互补于seq id no:44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392或395的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
257.其中如b.、c.、d.和e.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从isoprenol和/或prenol到异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基的反应。
258.在本发明的一个实施方案中，如b.，c.，d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非14a、非122a、非174m和/或非217t。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含14y、k或t、122s或t、174k或v和/或217e或m中的至少3个，优选至少4个。
259.在本发明的另一个实施方案中，如b.、c.、d.和e中限定的氨基酸分子在对应于seq idno:37相应位置的位置处包含非30d、e、s或y、非33g或s、非125s或t和/或非201a、i或s。优选地，本发明的激酶1在对应于seq id no:37相应位置的位置处包含30n、33t、125k和/或201c或d中的至少2个，优选至少3个，优选至少4个。
260.在重组表达构建体的一个实施方案中，所述重组表达构建体包含
261.i.功能性地连接编码激酶1的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，和
262.ii.功能性地连接编码激酶2的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，
263.其中至少一个功能性地连接激酶1或激酶2的启动子与激酶1或激酶2是异源的，激酶2包含编码选自以下的氨基酸分子的序列：
264.f.seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子，和
265.g.与seq id no:76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447或483的氨基酸分子具有至少50％同一性的氨基酸分子，或其功能性片段，和
266.h.由seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
267.i.由与seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485具有至少50％同一性的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，和
268.j.由与在严格条件下互补于seq id no:77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449或485的至少250个碱基的片段杂交的核酸分子编码的氨基酸分子，或其功能性片段，
269.其中如g.、h.、i.和j.中限定的氨基酸分子催化水性介质中从异戊烯磷酸和/或二甲基烯丙基磷酸到异戊烯焦磷酸和/或二甲基烯丙基焦磷酸的反应。
270.在优选的实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:37具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
271.激酶2包含与seq id no:85具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
272.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:1具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
273.激酶2包含与seq id no:486具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列
同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
274.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:291具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
275.激酶2包含与seq id no:103具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
276.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:46具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
277.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
278.在另一个优选实施方案中，激酶1包含与seq.id.no:49具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体，和
279.激酶2包含与seq id no:88具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，或其功能性变体。
280.激酶1和激酶2可以各自在异源启动子的控制下，或者可以排列在与激酶1、激酶2或两者异源的一种启动子的控制下的操纵子中。操纵子可以包含从ipp和/或dmapp产生优选的类异戊二烯所必需的其他基因。
281.与seq id no 1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、
300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、414、417、420、423、426、429、432、435、438、441、444、447、450、453、456、459、462、465、468、471、474、477、480、483或486中的任一个序列具有特定同一性的氨基酸分子包括与seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、414、417、420、423、426、429、432、435、438、441、444、447、450、453、456、459、462、465、468、471、474、477、480、483或486中的任一个序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸分子。
282.与seq id no 2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47、48、50、51、53、54、56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、109、110、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268、271、274、277、280、283、286、289、292、295、298、301、304、307、310、313、316、319、322、325、349、358、361、367、379、388、394、397、412、430、442、445、448、463、478、481、484、487、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266、269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380、383、386、389、392、395、398、401、404、407、410、413、416、419、422、425、428、431、434、437、440、443、446、449、452、455、458、461、464、467、470、473、476、479、482、485或488中的任一个具有特定同一性的核酸分子包括与seq id no:2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47、48、50、51、53、54、56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、109、110、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268、271、274、277、280、283、286、289、292、295、298、301、304、307、310、313、316、319、322、325、
349、358、361、367、379、388、394、397、412、430、442、445、448、463、478、481、484、487、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266、269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380、383、386、389、392、395、398、401、404、407、410、413、416、419、422、425、428、431、434、437、440、443、446、449、452、455、458、461、464、467、470、473、476、479、482、485或488中的任一个具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸分子。
283.本发明的氨基酸分子的功能性片段包含seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、414、417、420、423、426、429、432、435、438、441、444、447、450、453、456、459、462、465、468、471、474、477、480、483或486的任一个序列的至少50个连续氨基酸，优选至少75个连续氨基酸，更优选至少100个连续氨基酸，更优选至少125个连续氨基酸，更优选至少150个连续氨基酸，甚至更优选至少175个连续氨基酸，甚至更优选至少200个连续氨基酸，甚至更优选至少225个连续氨基酸，最优选至少250个连续氨基酸。
284.本发明的再一个实施方案是包含重组表达构建体的重组载体，所述重组表达构建体包含
285.i.功能性地连接编码激酶1的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，和
286.ii.功能性地连接编码激酶2的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，
287.其中至少一个功能性地连接激酶1或激酶2的启动子与激酶1或激酶2是异源的。激酶1和激酶2可以各自在异源启动子的控制下，或者可以在操纵子中排列在与激酶1、激酶2或两者异源的一个启动子的控制下。操纵子可以包含从ipp和/或dmapp产生优选的类异戊二烯所必需的其他基因。
288.本发明的再一个实施方案是重组微生物，其包含a)重组表达构建体，其包含功能性地连接编码激酶1的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，和功能性地连接编码激酶2的核酸分子的在微生物中有功能的启动子，其中至少一个功能性地连接激酶1或激酶2的启动子与激酶1或激酶2是异源的，或b)包含所述重组表达构建体的重组载体。
289.优选地，重组微生物是玫瑰红红球菌(rhodococcus rhodochrous)、气球菌属(aerococcussp.)、曲霉属(aspergillus sp.)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、
clostridium algidicarnis、高效棒状杆菌(corynebacterium efficiens)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、沃氏产卤菌(haloferax volcanii)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus jannaschii)、热自养甲烷热杆菌(methanothermobacter thermautotrophicus)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、产黄假单胞菌(pseudomonas synxantha)、固氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(pseudomonas jluorescens)、卵形假单胞菌(pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、嗜酸假单胞菌(pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、筑波拟酵母(pseudozyma tsukubaensis)、真养罗氏菌(ralstonia eutropha)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、浑浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、鲍氏志贺氏菌(shigella boydii)、草木樨中华根瘤菌(sinorhizobium meliloti)、抗生链霉菌(streptomyces antibioticus)、阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)、可可链霉菌(streptomyces cacaoi)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、黄链霉菌(streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(streptomyces griseolus)、淡紫灰链霉菌(streptomyces lavendulae)、浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(streptomyces virginiae)、绿色产色链霉菌(streptomyces viridochromogenes)、嗜酸热原体(thermoplasma acidophilum)、需钠弧菌(vibrio natrigens)或解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
290.特别优选的微生物是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、浑球红细菌(rhodobacter sphaeroides)、混浊红球菌(rhodococcus opacus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。
291.本发明的另一个实施方案是一种培养或如上限定的重组微生物或使其生长的方法，包括用一种或多种所述重组微生物接种介质，并在包含prenol和/或isoprenol的介质中培养所述重组微生物或使其生长。
292.本发明的另一个实施方案是如上限定的重组微生物或如上限定的组合物用于将prenol和/或isoprenol全细胞生物转化为一种或多种类异戊二烯或其盐或者异戊烯焦磷酸或其盐和/或二甲基烯丙基焦磷酸或其盐的用途。
293.本发明的另一个实施方案是将prenol和/或isoprenol全细胞生物转化为一种或多种类异戊二烯或其盐或者ipp或其盐和/或dmapp或其盐的方法，包括以下步骤：
294.i)在包含prenol和/或isoprenol、适于所述重组微生物生长的介质和碳源的发酵罐中使如上限定的重组微生物生长，和
295.ii)从i)中获得的发酵液收集一种或多种类异戊二烯或其盐或者ipp或其盐和/或dmapp或其盐。
296.本发明的另一个实施方案是将prenol和/或isoprenol全细胞生物转化为一种或
多种类异戊二烯或其盐或者ipp或其盐和/或dmapp或其盐的方法，包括以下步骤：
297.i)使如上定义的重组微生物在发酵罐中生长，所述发酵罐包含适于所述重组微生物生长的介质和碳源，和
298.ii)从发酵罐中收集重组微生物，和
299.iii)通过补充isoprenol/prenol在介质中进行全细胞生物转化，和
300.iv)从iii)中获得的介质收集一种或多种类异戊二烯或其盐或ipp和/或dmapp。
301.定义
302.应当理解，本发明不限于特定的方法或方案。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，其仅由所附权利要求限制。必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代。因此，例如，提及“载体”是指一种或多种载体，并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。术语“约”在本文中用于表示大约、大致、周围或在
……
的区域中。术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将边界扩展到所述数值上下来修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于以20％的变化在所述值上下修饰数值，优选地向上或向下(更高或更低)10％。如本文所用，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。在本说明书和所附权利要求中使用时，词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”和“包括(includes)”旨在指定一个或多个所述特征、整数、部件或步骤的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、部件、步骤或其组的存在或添加。为清楚起见，说明书中使用的某些术语定义和使用如下：
303.反向平行：“反向平行”在本文中是指通过互补碱基残基之间的氢键配对的两个核苷酸序列，其中磷酸二酯键在一个核苷酸序列中以5'-3'方向延伸，并且在另一个核苷酸序列中以3'-5'方向延伸。
304.反义：术语“反义”是指相对于其转录或功能的正常方向反转的核苷酸序列，且因此表达与宿主细胞内表达的靶基因mrna分子互补的rna转录物(例如，它可以通过watson-crick碱基配对与靶基因mrna分子或单链基因组dna杂交)或与靶dna分子(如，例如，存在于宿主细胞中的基因组dna)互补的rna转录物。
305.编码区：如本文所用，提及结构基因使用时，术语“编码区”是指编码由于mrna分子的翻译而在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区在5'侧由编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体“atg”界定，并且在3'侧由指定终止密码子的三个三联体(即taa、tag、tga)之一界定。除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以包括位于rna转录物上存在的序列的5'-和3'-端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mrna转录物上存在的非翻译序列的5'或3')。5'-侧翼区可含有调控序列，如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3'-侧翼区可含有指导转录终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。
306.互补：“互补”或“互补性”是指包含反平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，所述反向平行核苷酸序列能够在反平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键时彼此配对(通过碱基配对规则)。例如，序列5'-agt-3'与序列5'-act-3'互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补性是指其中一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则不匹配。核酸
分子之间的“全部”或“完全”互补性是其中每个核酸碱基在碱基配对规则下与另一个碱基匹配。核酸分子链之间的互补程度对核酸分子链之间杂交的效率和强度具有显著影响。如本文所用的核酸序列的“互补序列”是指其核酸分子显示出与核酸序列的核酸分子的完全互补性的核苷酸序列。
307.供体dna分子：如本文所用，术语“供体dna分子”、“修复dna分子”或“模板dna分子”在本文中均可互换使用，意指具有待引入细胞基因组中的序列的dna分子。它可以在5'和/或3'端侧接与所述细胞基因组的靶区域中的序列同源或相同的序列。它可以包含在相应细胞中不天然存在的序列，如orf、非编码rna或应引入靶区域中的调控元件，或可以包含除了至少一个突变之外与靶区域同源的序列。基因编辑：供体dna分子的序列可以添加到基因组中，或可以替换供体dna序列长度的基因组中的序列。
308.双链rna：“双链rna”分子或“dsrna”分子包含核苷酸序列的有义rna片段和核苷酸序列的反义rna片段，其均包含彼此互补的核苷酸序列，从而允许有义和反义rna片段配对并形成双链rna分子。
309.内源性：“内源性”核苷酸序列是指存在于未转化细胞的基因组中的核苷酸序列。
310.表达：“表达”是指基因产物的生物合成，优选地是指细胞中核苷酸序列(例如内源基因或异源基因)的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mrna和任选地随后mrna翻译成一种或多种多肽。在其他情况下，表达可以仅指携带rna分子的dna的转录。
311.表达构建体：如本文所用的“表达构建体”意指能够指导特定核苷酸序列在细胞中表达的dna序列，其包含在其将被引入的所述细胞中起作用的启动子，所述启动子可操作地连接目的核苷酸序列，所述目的核苷酸序列任选地可操作地连接终止信号。如果需要翻译，其通常还包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区可以编码目的蛋白质，但也可以在有义或反义方向上编码目的功能性rna，例如rnaa、sirna、snorna、snrna、microrna、ta-sirna或任何其他非编码调节rna。包含目的核苷酸序列的表达构建体可以是嵌合的，这意味着其一个或多个组分相对于其一个或多个其他组分是异源的。表达构建体也可以是天然存在但以可用于异源表达的重组形式获得的表达构建体。然而，通常，表达构建体相对于宿主是异源的，即表达构建体的特定dna序列不天然存在于宿主细胞中，并且必须通过转化事件引入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达构建体中核苷酸序列的表达可以在组成型启动子的控制下，或诱导型启动子的控制下，其仅在宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才启动转录。
312.外源：术语“外源”是指通过实验操作引入细胞基因组中的任何核酸分子(例如，基因序列)，并且可以包括在该细胞中发现的序列，只要引入的序列含有一些修饰(例如，点突变、选择性标记基因的存在等)，且因此相对于天然存在的序列是不同的。
313.功能性连接：术语“功能性连接”或“功能性地连接”应理解为意指例如调控元件(例如启动子)与待表达的核酸序列以及(如果合适的话)其他调控元件(如，例如，终止子)的顺序排列，使得每个调控元件可以实现其预期功能以允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。作为同义词，可以使用措辞“可操作的连接”或“可操作地连接”。表达可以根据核酸序列相对于有义或反义rna的排列而产生。为此，不一定需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列(如，例如增强子序列)也可以从更远的位置或实际上从其他dna分子
对靶序列发挥其功能。优选的排列是其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列后，使得两个序列彼此共价连接的那些。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列位于启动子后，使得转录起始与本发明的嵌合rna的所需起始相同。功能连接和表达构建体可以通过所述的常规重组和克隆技术产生(例如，maniatis t，fritsch ef和sambrook j(1989)molecular cloning：a laboratory manual，第2版，cold spring harbor laboratory，cold spring harbor(ny)；silhavy等(1984)experiments with gene fusions，cold spring harbor laboratory，cold spring harbor(ny)；ausubel等(1987)current protocols in molecular biology，greene publishing assoc and wiley interscience)。然而，例如充当具有限制酶的特异性切割位点的接头或充当信号肽的其他序列也可以位于两个序列之间。序列的插入也可导致融合蛋白的表达。优选地，由调控区(例如启动子)和待表达的核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在并例如通过转化插入基因组中。
314.基因：术语“基因”是指可操作地连接到能够以某种方式调控基因产物(例如，多肽或功能性rna)的表达的适当调节序列的区域。基因包括编码区(开放阅读框，orf)之前(上游)和之后(下游)的dna的非翻译调控区(例如，启动子、增强子、阻遏物等)，以及在适用的情况下，各个编码区(即外显子)之间的间插序列(即内含子)。如本文所用的术语“结构基因”旨在意指转录成mrna的dna序列，该mrna然后翻译成特定多肽的特征性氨基酸序列。
315.在本文中使用时，“基因编辑”意指在细胞基因组的特定位置处引入特定突变。可以通过应用更先进的技术的精确编辑来引入基因编辑，例如使用crispr cas系统和供体dna，或与诱变活性相关的crispr cas系统，如脱氨酶(wo15133554、wo17070632)。
316.基因组和基因组dna：术语“基因组”或“基因组dna”是指宿主生物体的可遗传遗传信息。所述基因组dna包含细胞核的dna(也称为染色体dna)，但也包含质体(例如叶绿体)和其他细胞器(例如线粒体)的dna。优选，术语基因组或基因组dna是指细胞核的染色体dna。
317.异源的：关于核酸分子或dna的术语“异源的”是指与第二核酸分子可操作地连接或被操纵以变得与第二核酸分子可操作地连接的核酸分子，所述第二核酸分子例如在自然界中(例如在wt细胞的基因组中)不与之可操作地连接的启动子，或在自然界中在不同地点或位置处(例如在wt细胞的基因组中)与之可操作地连接的启动子。
318.优选，关于核酸分子或dna的术语“异源的”是指与第二核酸分子可操作地连接或被操纵以变得与第二核酸分子可操作地连接的核酸分子，所述第二核酸分子例如在自然界中不与之可操作地连接的启动子或开放阅读框。
319.包含核酸分子和与其连接的一个或多个调控核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是源自实验操作的构建体，其中a)所述核酸分子，或b)所述调控核酸分子，或c)两者(即(a)和(b))不位于其自然(天然)遗传环境中或已通过实验操作修饰，修饰的实例是一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境是指起源生物体中的天然染色体基因座，或是指基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，优选至少部分地保留核酸分子序列的天然遗传环境。环境至少在一侧侧接核酸序列，并且具长度为有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp，非常特别优选至少5,000bp的序列。天然存在的表达构建体-例如启动子与相应基因的天然存在的组合-当其通
过非天然的、合成的“人工”方法(例如诱变)修饰时变成转基因表达构建体。这些方法已有描述(us 5,565,350；wo 00/15815)。例如，认为与启动子(其不是该分子的天然启动子)可操作地连接的编码蛋白质的核酸分子相对于启动子是异源的。优选地，异源dna对于其被引入的细胞不是内源的或不是与其天然相关的，而是已经从另一种细胞获得或已经合成。异源dna还包括内源dna序列，其含有内源dna序列的一些修饰、非天然存在的多个拷贝，或不是天然与其物理连接的另一dna序列天然相关的dna序列。通常，尽管不是必需的，但异源dna编码通常不由表达它的细胞产生的rna或蛋白质。
320.杂交：如本文所定义的术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生，即两种互补核酸都在溶液中。杂交过程也可以在互补核酸之一固定于基质(如磁珠、琼脂糖珠或任何其他树脂)的情况下发生。杂交过程也可以在如下情况下发生：互补核酸之一固定于固体支持物(如硝酸纤维素或尼龙膜)上，或通过例如光刻法固定于例如硅质玻璃支持物(后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)上。为了允许杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以将双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。
321.术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，选择低严格性条件为在限定的离子强度和ph下比特定序列的热解链点(tm)低约30℃。中等严格条件是温度比tm低20℃时，并且高严格条件是温度比tm低10℃时。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，由于遗传密码的简并性，核酸可能在序列上偏离并且仍然编码基本上相同的多肽。因此，有时可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。
[0322]“tm”是在限定的离子强度和ph下的温度，在该温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。tm取决于溶液条件以及探针的碱基组成和长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。从低于tm约16℃至32℃获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体形成；对于高达0.4m的钠浓度，这种效应是可见的(对于较高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低dna-dna和dna-rna双链体的解链温度，每百分比甲酰胺降低0.6至0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许杂交在30至45℃下进行，尽管杂交速率将降低。碱基对错配降低了双链体的杂交速率和热稳定性。平均而言，且对于大探针，每％碱基错配tm降低约1℃。根据杂合体的类型，可以使用以下等式计算tm：
[0323]
dna-dna杂交体(meinkoth和wahl，anal.biochem.，138：267-284,1984)：
[0324]
tm＝81.5℃ 16.6
×
log[na ]a 0.41x％[g/cb]-500x[lc]-1-0.61
×
％甲酰胺
[0325]
dna-rna或rna-rna杂合体：
[0326]
tm＝79.8 18.5(log10[na ]a) 0.58(％g/cb) 11.8(％g/cb)2-820/lc
[0327]
寡-dna或寡-rnad杂交体：
[0328]
对于《20个核苷酸：tm＝2(ln)
[0329]
对于20-35个核苷酸：tm＝22 1.46(ln)
[0330]
a或对于其它一价阳离子，但仅在0.01-0.4m范围内准确。
[0331]
b仅在30％至75％范围内准确。
[0332]
c l＝以碱基对计的双链体长度。
[0333]
d oligo，寡核苷酸；in，引物的有效长度＝2*(g/c的数量) (a/t的数量)。
[0334]
可以使用许多已知技术中的任何一种来控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中添加异源rna、dna和sds，以及用rna酶处理。对于非相关探针，可以通过改变(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)中的一种来进行一系列杂交。本领域技术人员知道可以在杂交期间改变并且将维持或改变严格条件的各种参数。
[0335]
除了杂交条件之外，杂交的特异性通常还取决于杂交后洗涤的功能。为了去除由非特异性杂交产生的背景，用稀盐溶液洗涤样品。这种洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低和洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性下或低于杂交严格性下进行。阳性杂交产生至少是背景信号两倍的信号。通常，用于核酸杂交测定或基因扩增检测程序的合适的严格条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。本领域技术人员知道可以在洗涤期间改变并且将维持或改变严格性条件的各种参数。
[0336]
例如，长于50个核苷酸的dna杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃下在1
×
ssc中或在42℃下在1
×
ssc和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃下在0.3
×
ssc中洗涤。长于50个核苷酸的dna杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在50℃下在4
×
ssc中或在40℃下在6
×
ssc和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃下在2
×
ssc中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。杂交已知序列的核酸时，可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定杂交体长度。1
×
ssc是0.15m nacl和15mm柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外包括5
×
denhardt’s试剂、0.5-1.0％sds、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子dna、0.5％焦磷酸钠。高严格性条件的另一个实例是在65℃下在包含0.1
×
sds和任选的5
×
denhardt’s试剂、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子dna、0.5％焦磷酸钠的0.1
×
ssc中杂交，然后在65℃下在0.3
×
ssc中洗涤。
[0337]
为了确定严格性水平，可以参考sambrook等(2001)molecular cloning：a laboratory manual，第3版，cold spring harbor laboratory press，csh，new york或current protocols in molecular biology，john wiley&sons，n.y.(1989和年度更新)。
[0338]“同一性”：关于两个或更多个核酸或氨基酸分子的比较使用时，“同一性”意指所述分子的序列共享一定程度的序列相似性，所述序列是部分相同的。
[0339]
与亲本酶相比时，酶变体可以通过它们的序列同一性来定义。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了在第一步中确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，在这两个序列之间产生成对序列比对，其中两个序列在其完整长度上比对(即，成对全局比对)。用实施needleman和wunsch算法的程序(j.mol.biol.(1979)48，第443-453页)产生比对，优选通过使用程序“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(emboss))，其具有程序默认参数(空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5和矩阵＝eblosum62)。出于本发明的目的，优选的比对是可以确定最高序列同一性的比对。
[0340]
以下实施例旨在说明两个核苷酸序列，但相同的计算适用于蛋白质序列：
[0341]
seq a：aagatactg长度：9个碱基
[0342]
seq b：gatctga长度：7个碱基
[0343]
因此，较短的序列是序列b。
[0344]
产生显示两个序列在其完整长度上的成对全局比对导致
[0345]
seq a:aagatactg-[0346]
||||||
[0347]
seq b:
‑‑
gat-ctga
[0348]
比对中的“|”符号表示相同的残基(其意指dna的碱基或蛋白质的氨基酸)。相同残基的数目为6。
[0349]
比对中的符号
“‑”
指示空位。通过比对在seq b内引入的空位数为1。在seq b的边界处通过比对引入的空位数为2，并且在seq a的边界处为1。
[0350]
显示比对序列在其整个长度上的比对长度为10。
[0351]
因此，根据本发明产生在其整个长度上显示较短序列的成对比对导致：
[0352]
seq a:gatactg-[0353]
||||||
[0354]
seq b:gat-ctga
[0355]
因此，根据本发明产生在其整个长度上显示序列a的成对比对导致：
[0356]
seq a:aagatactg
[0357]
||||||
[0358]
seq b:
‑‑
gat-ctg
[0359]
因此，根据本发明产生在其整个长度上显示序列b的成对比对导致：
[0360]
seq a:gatactg-[0361]
||||||
[0362]
seq b:gat-ctga
[0363]
显示较短序列在其整个长度上的比对长度为8(存在一个空位，其在较短序列的比对长度中被考虑)。
[0364]
因此，显示seq a在其完整长度上的比对长度将为9(意味着seq a是本发明的序列)。
[0365]
因此，显示seq b在其完整长度上的比对长度将为8(意味着seq b是本发明的序列)。
[0366]
在比对两个序列后，在第二步中，从产生的比对确定同一性值。出于本说明书的目的，同一性百分比通过％-同一性＝(相同残基/在其整个长度上显示本发明相应序列的比对区域的长度)*100来计算。因此，与根据这个实施方案的两个氨基酸序列的比较相关的序列同一性通过将相同残基数除以在其整个长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度来计算。将这个值乘以100以给出“％-同一性”。根据上文提供的实例，％-同一性为：对于作为本发明序列的seq a(6/9)*100＝66.7％；对于seq b是本发明的序列(6/8)*100＝75％。
[0367]
插入缺失是与通过nhej修复dsb相关的生物体基因组中碱基的随机插入或缺失的术语。它被分类为小的遗传变异，测量长度为1至10000个碱基对。如本文所用，它是指在靶位点中或其附近(例如，在上游和/或下游小于1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、25bp、20bp、15bp、10bp或5bp)的碱基的随机插入或缺失。
[0368]
关于将供体dna分子引入靶dna的靶位点的术语“引入(introducing)”、“引入
(introduction)”等意指将供体dna分子的序列任何引入靶区域中，例如通过将供体dna分子或其部分物理整合到靶区域中或将供体dna分子的序列或其部分引入靶区域中，其中供体dna用作聚合酶的模板。
[0369]
内含子：是指基因内的dna区段(间插序列)，其不编码基因产生的蛋白质的一部分，并且在从细胞核输出之前从基因转录的mrna中剪接出来。内含子序列是指内含子的核酸序列。因此，内含子是与编码序列(外显子)一起被转录但在成熟mrna形成期间被去除的dna序列的那些区域。内含子可以位于实际编码区内或前mrna(未剪接的mrna)的5'或3'未翻译前导序列中。切除初级转录物中的内含子，同时精确地连接编码序列以形成成熟mrna。内含子和外显子的连接形成剪接位点。内含子的序列以gu开始并以ag结束。此外，在植物中，已经描述了au-ac内含子的两个实例：来自拟南芥的reca样蛋白基因的第十四内含子和g5基因的第七内含子是at-ac内含子。含有内含子的前mrna具有三个短序列，除了其他序列外，这三个短序列准确剪接内含子必需的。这些序列是5'剪接位点、3'剪接位点和分支点。mrna剪接是去除初级mrna转录物中存在的间插序列(内含子)并结合或连接外显子序列。这也称为顺式剪接，其连接去除间插序列(内含子)的同一rna上的两个外显子。内含子的功能元件包含被剪接体的特定蛋白质组分识别和结合的序列(例如在内含子末端剪接共有序列)。功能元件与剪接体的相互作用导致内含子序列从早熟mrna中去除并重新连接外显子序列。内含子具有三个短序列，这三个短序列对于准确剪接内含子是必需的(尽管不是足够的)。这些序列是5'剪接位点、3'剪接位点和分支点。分支点序列在剪接和剪接位点选择中是重要的。分支点序列通常位于3'剪接位点上游10-60个核苷酸。
[0370]
同基因：遗传上相同的生物体，除了它们可能因异源dna序列的存在或不存在而不同。
[0371]
分离的：如本文所用的术语“分离的”意指材料已通过人工移除并且与其原始的天然环境分开存在，且因此不是自然界的产物。分离的材料或分子(如dna分子或酶)可以以纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境中，如在转基因宿主细胞中。例如，活细胞中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是相同的多核苷酸或多肽从天然系统中的一些或所有共存材料分离后是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分并且将被分离，因为这样的载体或组合物不是其原始环境的一部分。优选地，关于核酸分子使用时，如在“分离的核酸序列”中，术语“分离的”是指从至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离的核酸序列，所述污染物核酸分子通常在其天然来源中与其相关。分离的核酸分子是以与其在自然界中发现的形式或环境不同的形式或环境存在的核酸分子。相反，非分离的核酸分子是以其在自然界中存在的状态发现的核酸分子，如dna和rna。例如，给定的dna序列(例如基因)在邻近基因附近的宿主细胞染色体上发现；rna序列，如编码特定蛋白质的特定mrna序列，作为与编码多种蛋白质的许多其他mrna的混合物存在于细胞中。然而，包含例如seq id no:2的分离的核酸序列包括例如通常含有seq id no:2的细胞中的此类核酸序列，其中核酸序列位于与天然细胞不同的染色体或染色体外位置，或者以其他方式侧接与自然界中发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。将分离的核酸序列用于表达蛋白质时，核酸序列将至少含有一部分有义链或编码链(即，核酸序列可以是单链的)。或者，它可以含有有义链和反义链(即，核酸序列可以是双链的)。
[0372]
最小启动子：启动子元件，特别是tata元件，其在不存在上游激活的情况下是无活性的或具有大大降低的启动子活性。在合适的转录因子存在下，最小启动子起到允许转录的作用。
[0373]
非编码：术语“非编码”是指不编码部分或全部表达的蛋白质的核酸分子序列。非编码序列包括但不限于内含子、增强子、启动子区、3'非翻译区和5'非翻译区。
[0374]
核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”是指天然存在的或合成的或人工的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括单链或双链、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸类似物和聚合物或杂合体，除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”在本文中可与“基因”、“cdna”、“mrna”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换使用。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸酯的化学结构中具有修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代等；和2'-位置糖修饰，包括但不限于其中2'-oh被选自h、or、r、卤素、sh、sr、nh2、nhr、nr2或cn的基团替代的糖修饰的核糖核苷酸。短发夹rna(shrna)还可以包含非天然元件，如非天然碱基，例如离子蛋白和黄嘌呤，非天然糖，例如2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯键，例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯和肽。
[0375]
核酸序列：短语“核酸序列”是指从5'至3'端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体dna、自我复制质粒、dna或rna的感染性聚合物以及发挥主要结构作用的dna或rna。“核酸序列”还指代表核苷酸的缩写、字母、字符或单词的连续列表。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，其是相对短的核酸，通常长度小于100个核苷酸。通常，核酸探针的长度为约50个核苷酸至约10个核苷酸。核酸的“靶区域”是被鉴定为目的的核酸部分。核酸的“编码区”是置于适当的调控序列的控制下时以序列特异性方式转录和翻译以产生特定的多肽或蛋白质的核酸部分。编码区被认为编码此类的多肽或蛋白质。
[0376]
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna)或其模拟物的寡聚物或聚合物，以及具有功能类似的非天然存在部分的寡核苷酸。这种修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，因为具有所需的性质，如，例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。寡核苷酸优选包括通过键(例如磷酸二酯)或取代键彼此共价偶联的两个或更多个核单体。
[0377]
突出：“突出”是在双链寡核苷酸分子的5'-或3'-羟基末端上的相对短的单链核苷酸序列(也称为“延伸”、“突出端”或“粘性端”)。
[0378]
多肽：术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。
[0379]
前体蛋白：蛋白质，其通常靶向细胞器，如叶绿体，并且仍然包含其转运肽。
[0380]
关于在靶区域中引入供体dna分子的“精确”意指与不包含在供体dna分子序列中的靶区域的未改变的dna序列相比，供体dna分子的序列被引入靶区域而没有任何插入缺失、重复或其他突变。
[0381]
初级转录物：如本文所用的术语“初级转录物”是指基因的早熟rna转录物。例如，“初级转录物”仍然包含内含子和/或尚未包含多a尾或帽结构和/或缺少其作为转录物的正
确功能所必需的其他修饰，如，例如修剪或编辑。
[0382]
启动子：术语“启动子”或“启动子序列”是等同物，并且如本文所用，是指与目的核苷酸序列连接时能够控制目的核苷酸序列转录成rna的dna序列。启动子位于5'(即上游)，接近于目的核苷酸序列转录成mrna的转录起始位点，其控制并提供用于通过rna聚合酶和其他转录因子特异性结合以起始转录的位点。所述启动子包含例如邻近转录起始位点的至少10kb，例如5kb或2kb。它还可以包含接近转录起始位点的至少1500bp，优选至少1000bp，更优选至少500bp，甚至更优选至少400bp，至少300bp，至少200bp或至少100bp。在进一步优选的实施方案中，启动子包含邻近转录起始位点的至少50bp，例如至少25bp。启动子不包含外显子和/或内含子区或5'非翻译区。启动子可以例如与相应细胞异源或同源。如果多核苷酸序列源自外来物种，或者如果来自相同物种，则该多核苷酸序列与生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”，或者是从其原始形式修饰的。例如，与异源编码序列可操作地连接的启动子是指来自与衍生启动子的物种不同的物种的编码序列，或者如果来自相同的物种，则是与启动子不天然相关的编码序列(例如，遗传工程化的编码序列或来自不同生态型或品种的等位基因)。合适的启动子可以衍生自其中应当发生表达的宿主细胞的基因或衍生自该宿主细胞的病原体(例如病毒)。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应于诱导剂而增加。提及启动子或衍生自启动子的表达时，术语“组成型”意指启动子能够在细胞中在不存在刺激(例如，热休克、化学品、光等)的情况下在所述细胞的基本上整个寿命期间指导可操作地连接的核酸分子的转录。
[0383]
启动子特异性：提及启动子时，术语“特异性”意指由相应启动子赋予的表达模式。特异性描述了细胞的发育状态，其中启动子在相应启动子的控制下赋予核酸分子的表达。启动子的特异性还可以包括环境条件，在该环境条件下启动子可以被激活或下调，如通过生物或环境胁迫(如寒冷、干旱或感染)诱导或抑制。
[0384]
纯化的：如本文所用，术语“纯化的”是指从其天然环境中取出、分离或分开的分子(核酸或氨基酸序列)。“基本上纯化的”分子至少60％不含，优选至少75％不含，更优选至少90％不含与其天然缔合的其它组分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。
[0385]
重组：关于核酸分子的术语“重组”是指通过重组dna技术产生的核酸分子。重组核酸分子还可以包含这样的分子，其本身不存在于自然界中，而是由人修饰、改变、突变或以其他方式操纵。优选地，“重组核酸分子”是在序列上与天然存在的核酸分子相差至少一个核酸的非天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”还可以包含“重组构建体”，其包含(优选可操作地连接)非天然地以该顺序存在的核酸分子序列。用于产生所述重组核酸分子的优选方法可包括克隆技术、定向或非定向诱变、合成或重组技术。
[0386]
有义：术语“有义”应理解为意指具有与靶序列互补或相同的序列的核酸分子，例如与蛋白质转录因子结合并参与给定基因表达的序列。根据优选的实施方案，核酸分子包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。
[0387]
显著增加或减少：例如酶活性或基因表达的增加或减少，其大于测量技术中固有的误差范围，优选对照细胞中对照酶或表达的活性增加或减少约2倍或更多，更优选增加或减少约5倍或更多，最优选增加或减少约10倍或更多。
[0388]
小核酸分子：“小核酸分子”被理解为由核酸或其衍生物组成的分子，如rna或dna。它们可以是双链或单链的，并且为约15至约30bp，例如15至30bp，更优选约19至约26bp，例
如19至26bp，甚至更优选约20至约25bp，例如20至25bp。在特别优选的实施方案中，寡核苷酸为约21至约24bp，例如21至24bp。在最优选的实施方案中，小核酸分子为约21bp和约24bp，例如21bp和24bp。
[0389]
基本上互补：在其最广泛的意义上，术语“基本上互补”在本文中关于与参考或靶核苷酸序列相关的核苷酸序列使用时，意指核苷酸序列在基本上互补的核苷酸序列与所述参考或靶核苷酸序列的精确互补序列之间具有至少60％、更理想地至少70％、更理想地至少80％或85％、优选地至少90％、更优选地至少93％、还更优选地至少95％或96％、还更优选地至少97％或98％、还更优选地至少至少99％或最优选100％的同一性百分比(后者在本文中等同于术语“相同”)。优选地，在核酸序列的至少19个核苷酸，优选至少50个核苷酸，更优选整个长度的长度上评估与所述参考序列的同一性(如果下面没有另外说明)。基于needleman和wunsch的算法(needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443-453，如上文所定义)，使用wisconsin大学gcg的默认gap分析，gap的seqweb应用进行序列比较。与参考核苷酸序列“基本上互补”的核苷酸序列在低严格条件下，优选中等严格条件下，最优选高严格条件下(如上所定义)与参考核苷酸序列杂交。
[0390]
如本文所用的“靶区域”意指接近例如10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、60个碱基、70个碱基、80个碱基、90个碱基、100个碱基、125个碱基、150个碱基、200个碱基或500个碱基或更多个碱基远离靶位点的区域，或包括其中供体dna分子的序列被引入细胞基因组中的靶位点。
[0391]
如本文所用的“靶位点”意指基因组中使用重组技术诱导双链断裂或一个或一对单链断裂(切口)的位置，所述重组技术如锌指、talen、限制酶、归巢核酸内切酶、rna指导的核酸酶、rna指导的切口酶，如crispr/cas核酸酶或切口酶等。
[0392]
转基因：如本文所用的术语“转基因”是指通过实验操作引入细胞基因组中的任何核酸序列。转基因可以是“内源dna序列”或“异源dna序列”(即“外源dna”)。术语“内源dna序列”是指核苷酸序列，其天然存在于其所引入的细胞中，只要其相对于天然存在的序列不含一些修饰(例如，点突变、存在选择性标记基因等)即可。
[0393]
转基因(的)：提及生物体时，术语转基因(的)意指用重组dna分子转化的，优选稳定转化的，所述重组dna分子优选包含与目的dna序列可操作地连接的合适的启动子。
[0394]
载体：如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体或“整合载体”，其可以整合到宿主细胞的染色体dna中。另一种类型的载体是游离型载体，即能够染色体外复制的核酸分子。能够指导与其可操作地连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。在本说明书中，除非上下文另有明确说明，否则“质粒”和“载体”可互换使用。设计用于在体外或体内产生如本文所述的rna的表达载体可含有由任何rna聚合酶识别的序列，包括线粒体rna聚合酶、rna pol i、rna pol ii和rna pol iii。这些载体可用于在根据本发明的细胞中转录所需rna分子。
[0395]
野生型：关于生物体、多肽或核酸序列，术语“野生型”、“天然的”或“天然来源”意指所述生物体是在至少一种天然存在的未被人改变、突变或以其他方式操纵的生物体中天然存在的或可获得的。
附图说明
[0396]
图1显示了由激酶1催化的反应。(a)从isoprenol合成异戊烯磷酸(ip)和(b)从prenol合成二甲基烯丙基磷酸(dmap)。
[0397]
图2显示了激酶1的筛选结果。通过在atp和mgcl2存在下测量补充有isoprenol的澄清大肠杆菌细胞裂解物中的ip形成来监测酶活性。
[0398]
图3显示了由激酶2催化的反应。(a)从ip合成异戊烯二磷酸(ipp)和(b)从dmap合成二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)。
[0399]
图4显示了激酶2的筛选结果。通过在atp和mgcl2存在下测量补充有ip的澄清大肠杆菌细胞裂解物中的ipp形成来监测酶活性。
[0400]
图5显示了激酶1和2的级联反应。(a)从isoprenol合成ipp和(b)从prenol合成dmapp。
[0401]
图6显示了激酶1(seq id no 43)和激酶2将isoprenol转化为ipp的级联反应的实例。通过在atp和mgcl2存在下测量补充有isoprenol的澄清大肠杆菌细胞裂解物中的ipp形成来监测酶活性。
[0402]
图7显示了激酶1的筛选结果。通过在atp和mgcl2存在下测量补充有isoprenol的澄清大肠杆菌细胞裂解物中的ip形成来监测酶活性。
[0403]
图8显示了激酶2的筛选结果。通过在atp和mgcl2存在下测量补充有ip的澄清大肠杆菌细胞裂解物中的ipp形成来监测酶活性。
[0404]
图9显示了ip随时间的细胞(体内)产生。描绘了归一化至培养物的od600的ip浓度。值是三次独立测量的结果，且误差条表示标准偏差。
[0405]
图10显示了ipp随时间的细胞(体内)产生。描绘了归一化至培养物的od600的ipp浓度。值是三次独立测量的结果，且误差条表示标准偏差。
实施例
[0406]
化学品和常用方法
[0407]
除非另有说明，出于本发明的目的进行的克隆程序，包括限制性消化、琼脂糖凝胶电泳、核酸纯化、核酸连接、转化、细菌细胞的选择和培养，如所描述的进行(sambrook等，1989)。重组dna的序列分析用激光荧光dna测序仪(applied biosystems，foster city，ca，applied biosystems)使用sanger技术进行。除非另有说明，否则化学品和试剂获自sigma aldrich(sigma aldrich，st.louis，usa)、promega(madison，wi，usa)、duchefa(haarlem，荷兰)或invitrogen(carlsbad，1977)。限制性内切核酸酶来自new england biolabs(ipswich，ma，usa)或roche diagnostics gmbh(penzberg，德国)。寡核苷酸由eurofins eurofins genomics(ebersberg，德国)或integrated dna technologies(coralville，ia，usa)合成。
[0408]
实施例1激酶的克隆
[0409]
从公共数据库鉴定激酶的氨基酸序列。使用大肠杆菌的标准密码子使用衍生各自的dna序列。合成dna序列(biocat gmbh)并克隆到质粒pdhe19.2(ress-lo-eschke，m.等，de 19848129，1998，(basf ag))中。所得质粒用于转化感受态细胞(chung，c.t.等，proc natl acad sci u s a，1989，86，2172)，所述感受态细胞属于大肠杆菌菌株tg10、pagro、phsg575
(大肠杆菌tg10(kesseler，m.等，wo2004050877a1，2004，(basf ag))：rhaa——大肠杆菌tg1(dsmz 6056)用phsg575(takeshita，s.等，gene，1987，61，63)和pagro4(tomoyasu，t.等，mol.cell.biol.，2001，40，397中的pbb541)转化的衍生物
[0410]
实施例2激酶的重组生产
[0411]
将携带激酶的重组质粒的大肠杆菌tg10用于接种100ml带挡板的锥形瓶中的25ml lb培养基(bertani，g.，j bacteriol，1951，62，293)，所述培养基补充有100μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml壮观霉素、20μg/ml氯霉素、0.1mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷和0.5μg/ml鼠李糖。将培养物在37℃下在振荡条件下温育18小时。随后，通过以5000
×
g离心10分钟收获生物质。将细胞在缓冲液(50mm tris*hcl，1mm mgcl2，ph 7.0)中洗涤，然后重悬于1ml相同的缓冲液中。
[0412]
通过在均质器(peqlab precellys24，vwr)中用0.7ml石英珠(φ0.1mm)破碎300mg生物质两个30秒循环来制备无细胞的澄清的原始裂解物。在循环之间，将样品在冰上冷却。通过在10℃下20817
×
g离心澄清所得的无细胞裂解物。分离上清液(＝澄清的细胞裂解物)，并且其通常含有10至15mg/ml的蛋白质。
[0413]
实施例3酶筛选
[0414]
激酶1，isoprenol转化为异戊烯磷酸(ip)
[0415]
在筛选测定中评估酶活性。在这方面，缓冲液(50mm nh4hco3，ph 7.5)补充有5mm isoprenol(basf生产)、15mm atp、20mm mgcl2。通过加入20体积％(最终)的澄清细胞裂解物引发反应。随后，将反应在恒温混合器(eppendorf)中在37℃、300rpm下温育24小时，然后通过用乙腈1:5稀释并剧烈混合淬灭。通过在室温下以14,100
×
g离心5min来澄清淬灭的反应，并将所得上清液用于通过与质谱联用的液相色谱(lc-ms)来定量ip和异戊烯焦磷酸(ipp)的水平。
[0416]
激酶2，ip转化为异戊烯焦磷酸(ipp)
[0417]
在此，将50mm nh4hco
3 ph7.5的缓冲液补充5mm ip二锂盐(sigma-aldrich)、15mm atp、20mm mgcl2。通过加入20体积％(最终)的澄清的细胞裂解物引发反应。如前一段所述处理和分析反应。
[0418]
实施例4体外级联反应激酶1和激酶2，isoprenol转化为ipp
[0419]
为了评估用激酶1和激酶2的组合将isoprenol转化为ipp的潜力，在体外进行级联反应。在这方面，将ph 7.5的50mm nh4hco3缓冲液补充5mm isoprenol、30mm atp和20mm mgcl2。通过加入20体积％的激酶1和激酶2蛋白质产物的澄清细胞裂解物(总共40体积％)来启动反应。如上所述处理和分析反应。lc-ms定量指明ipp和/或dmapp的成功合成
[0420]
实施例5体内级联反应激酶1和激酶2，isoprenol转化为ipp
[0421]
按照逻辑pcdfduet1_激酶2_激酶1(例如seq id no 486)将在体外筛选中鉴定为命中的激酶基因重新克隆(biocat gmbh)到市售的pcdfduet1-质粒系统(novagen)中。所得质粒用于转化大肠杆菌bl21-gold(de3)(agilent)。将转化体的单菌落转移到含有补充有100μg/ml壮观霉素二盐酸盐(sigma aldrich)的4ml lb培养基的12ml反应管中，并在37℃下在200rpm的搅拌下温育过夜。
[0422]
将过夜培养物用于接种100ml neidhardt补充培养基(clomburg，j.m.等，proc natl acad sci u s a，2019，116(26))。将含有100μg/ml壮观霉素二盐酸盐的12810装入
500ml带挡板的锥形瓶中至600nm处的最终光密度(od600)为0.1。随后，将培养物在37℃和200rpm下温育3小时，然后将温度降低至30℃，并通过加入1mm iptg诱导基因表达。以26.9mm的终浓度加入isoprenol，并在温育0小时(在加入isoprenol前)、1、2.5、5、22和28小时后取出5ml样品。
[0423]
测量样品的od600，并通过快速过滤直接进一步处理(castano-cerezo，s.等，metabolomics，2019，15，115)。简言之，将样品在减压下通过安装在1l过滤装置(sartorius)上的直径为5cm的0.45μm聚酰胺滤膜(sartorius)过滤。将滤饼和过滤器转移到15ml锥形管中并立即在液氮中冷冻。将过滤器储存在-80℃直至进一步处理。在这方面，将过滤器浸没在预热至70℃的ph 7.5的异丙醇和50mm nh4hco3水溶液的1:1混合物中。随后将悬浮液在热混合器上在70℃和1000rpm搅拌下温育20min，然后置于冰上并超声处理3min(branson sonifier 250，70％，输出7)。通过在4℃下离心除去所有碎片，并将1ml所得上清液转移到新的1.5ml反应管中。使用speedvac真空浓缩器(thermo fisher，savant，spd131dda)在45℃下过夜从样品中完全除去所有溶剂。将残余物溶于200μl的甲醇与50mm ph7.5的nh4hco3水溶液的1:1混合物中。ip/dmap和ipp/dmapp通过与质谱联用的液相色谱来定量。将ip/dmap和ipp/dmapp浓度的报告结果标准化为样品的相应od600。未诱导基因表达且未加入isoprenol的培养物用作阴性对照。报告的值显示三次独立测量的平均值。
[0424]
实施例6lc-ms定量
[0425]
体外测定
[0426]
在与具有电子喷雾电离的单四极质谱仪(isq-ec，thermo-fisher)偶联的超高压液相色谱(uplc)系统(vanquish，thermo-fisher)上定量反应物。uplc系统以离子配对色谱模式运行。其配备有肽c-18柱(waters，acquity peptide beh，孔径粒度1.7μm，内径
×
长度2.1
×
50mm)，其在溶剂成分不变的条件下用25vol-％洗脱液a(含有10mm三丁胺和15mm乙酸的缓冲液)和75vol-％洗脱液b(乙腈)洗脱。该方法以0.5ml/min的流速运行2.5min，并将柱加热至40℃。通过质谱法检测和定量分析物。在这方面，将仪器设定为负离子化模式，碰撞诱导解离电压设定为40v，蒸发器温度为282℃，且离子传输管的温度为300℃。吹扫、护套和辅助气体压力分别设定为0.5psig、49.9psig和57psig。ip在0.6min洗脱并且其出现可以以质荷比(m/z)165跟踪，而ipp在1.3min洗脱并且其出现可以以m/z 245跟踪。定量基于通过分析ip二锂盐和ipp三铵盐(sigma-aldrich)的真实标准品制备的标准曲线。相对于反应中使用的相应底物的量报告反应产率。
[0427]
体内测定
[0428]
所有测量均在thermo vanquish flex uhplc系统上使用acquity premier beh c18，50
×
2.1mm，1.7μm dp柱(waters，germany)进行。通过从(a)h2o中10mm amfo(甲酸铵) 10mm dba(二丁胺)至(b)h2o/acn(1:9)中10mm amfo 10mm dba的多步梯度，以600μl/min的流速和45℃实现2.5μl样品的分离。梯度通过在2％b下0.5分钟等度步骤开始，然后在5.5min内增加至60％b，然后在0.5min内增加至100％b，以在100％b下1分钟步骤结束，然后在初始条件下再平衡。通过dad(二极管阵列检测器)在200至600nm范围内记录uv光谱。在进入maxis ii hr-tof质谱仪(bruker daltonics，德国)前，以负模式使用apollo esi源，将lc流分流成大约75μl/min。在源区域中，温度设定为200℃，毛细管电压为3200v，干燥气体流量为5.0l/min，并且雾化器设定为1.0巴。为了转移所产生的离子，漏斗1rf设定为
400vpp，并且多极rf设定为350vpp。然后，离子以110m/z的低截留和3.0ev的离子能量通过四极，在进入tof管前前进到以步进模式操作的碰撞室中(碰撞能量＝8.0ev，预脉冲存储＝5.0μs；碰撞rf＝200-800vpp；转移时间＝75-120ps；定时＝30-70％)。质谱以2.5hz扫描速率在50-650m/z范围内以聚焦模式获得。定量是基于通过分析ip二锂盐和ipp三铵盐的真实标准品制备的标准曲线。