用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠及其制备方法与流程

1.本发明专利涉及一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠及其制备方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.细胞是生命活动的基本结构和功能单位。对于多细胞生物而言，其不同细胞之间也是有差异的，这种差异不仅体现在形态上，也体现在细胞的遗传信息上，包括基因组的信息和基因的表达水平差异。细胞之间的这种遗传信息的差异在肿瘤细胞中尤为明显，同一肿瘤组织中的不同肿瘤细胞可以存在很多不同的基因型或者亚型，即肿瘤细胞的异质性，解析肿瘤细胞的异质性对于研究肿瘤的发生机制和诊断治疗具有十分重要的指导意义。
3.在人类基因组计划完成后，随着dna测序技术尤其是高通量测序技术的发展，基因测序的成本逐渐降低，通过大规模的dna并行测序，人们对基因组变异/基因表达差异与表型之间关系的理解认识越来越深刻。然而，传统的bulk测序针对的是对大量细胞的集合/组织进行测序，所得到的信息是大量细胞平均化后的结果，掩盖了单个细胞的遗传异质性信息。为了解决这一问题，单细胞测序应运而生。单细胞测序是指在单个细胞水平上对细胞的基因表达等信息进行检测，包括单细胞dna测序和单细胞rna测序。2009年汤富酬教授首次将单细胞rna扩增和高通量测序技术结合起来，成功的对单个细胞的转录组进行测序。
4.目前实现单细胞测序主要有两种策略方法。第一种是直接将单个细胞分离出来，分别独立构建测序文库进行测序，可通过流式细胞分选和激光捕获显微切割来实现单个细胞的分离，前者主要用于细胞样品，后者主要用于组织样品。这种方法的局限性很明显，就是单个细胞直接建库的成本非常高，通量也很低，能研究的细胞数量很有限，而随着研究深入的需要，待测细胞的数量快速增长，成本也越来越高，基于单个细胞测序的方法无法满足研究的需要。另外一种策略基于标签(barcode)的单个细胞识别，即给每个细胞的核酸序列加上独一无二的标签，通过一次建库可以同时测定成千上万个细胞信息，在分析测序结果时把携带有相同标签的序列视为来自同一个细胞。这种策略很适合大规模的高通量单细胞分析，其关键在于细胞的捕获技术，目前最常见的有三种捕获技术：微孔(microwell)、微液流(microfluidic)和微液滴(droplet)。
5.2015年两篇几乎同时发表在cell上的文章，首创基于微流控的微液滴技术应用于单细胞转录组测序，两篇文章各自把自己的技术命名为“drop-seq”和“indrop”，两者均通过合成带有特定cell barcode序列的微珠，与细胞一起包裹在微液滴里，然后细胞裂解释放mrna，在液滴里完成反转录并加上barcode，用于区分每个细胞。另外一种细胞捕获方式基于微孔的方法，主要原理是通过光刻的方式来制备含有数万微孔的微孔板，然后将细胞悬液加载到微孔板上，细胞由于重力作用会落入到微孔中，一般每个微孔只能容纳1个细胞，然后再加入含有特定barcode的捕获磁珠来标记每个细胞的mrna。目前基于droplet和microwell技术商业化最成功的例子是10x genomics和bd rhapsody平台，但前者技术更为
成熟，捕获通量相对更高，可扩展性更高，逐渐成为目前主流的高通量单细胞测序方式。但是基于droplet技术的单细胞测序目前依然存在着诸多问题，比如用于单细胞测序最核心的微球制备成本居高不下，且制备工艺复杂，批次间不稳定，难以量产；液滴微流控技术对微球和细胞的包裹效率太低，空包率过高，这些均会对后面的单细胞测序数据结果造成很大影响，严重制约了单细胞测序技术的广泛应用。
6.为了解决这些问题，我们重新开发了一种软质富有弹性且体积适中的聚丙烯酰胺凝胶微珠用于单细胞测序，并通过独特的生化合成手段在每个凝胶珠上均偶联了数百万到数千万个寡核苷酸用于捕获细胞内的转录本，并且保证每种凝胶珠上均携带有独特的标签序列用于区分单个细胞的转录本。此外这种凝胶珠可以在有还原剂的存在条件下自行降解，不会干扰后续的微液滴内的反转录反应，而且凝胶珠上的寡核苷酸在还原剂的存在条件下也会释放出来，提高了对细胞内转录本的捕获效率。我们的凝胶珠制备工艺操作简单，成本低廉，寡核苷酸偶联效率高，批间差异小，适合大规模量产。制备的功能化凝胶珠可广泛应用于单细胞转录组学、表观遗传学、crispr筛选以及单细胞多组学等应用领域。


技术实现要素：

7.1、一种用于分析单个细胞内核酸样本的功能化凝胶微珠，其特征在于：在聚丙烯酰胺凝胶微珠的表面修饰有通用引物、细胞标签，其中
8.通用引物uni-primer的序列为/5`acryd//ithiomc6-d/ctacacgacgctctt；
9.细胞标签包括bc1、bc2和bc3，以及对应的辅助夹板序列bc1-rc、bc2-rc、bc3-rc；
10.所述bc1的序列为(x1)；
11.bc2的序列为gt(x2)；
12.bc3的序列为tg(x3)(n)
8-12
ttttttttttttttttttttttttttttttvn；
13.bc1-rc的序列为ac(x1`)agatcggaagagcg；
14.bc2-rc的序列为ca(x2`)；
15.bc3-rc的序列为(x3`)；
16.其中x1与x1`、x2与x2`、x3与x3`互为反向互补序列，代表4-8bp预先设计好的序列，设计方法为每条序列之间至少有2个碱基的差异，每条序列内部没有超过连续4个重复碱基的序列，每条序列中至少有一个嘌呤和一个嘧啶。x1、x2、x3通常各设计96条以上，最好是96的倍数。
17.优选的，所述通用引物序列、细胞标签修饰到聚丙烯酰胺凝胶微珠表面后进行单链化处理。
18.优选的，所述聚丙烯酰胺凝胶微珠为可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠。
19.优选的，所述可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠在光照刺激、还原剂刺激或热刺激条件下降解。
20.优选的，所述聚丙烯酰胺凝胶微珠粒径在40-70μm之间。
21.其中，bc3末端的poly(t)30vn为功能捕获核酸。
22.本发明还公开了一种用于单细胞测序的功能化凝胶微珠的制备方法，其特征在于步骤包括：
23.(1)分别合成bc1、bc2、bc3、bc1-rc、bc2-rc、bc3-rc，以及通用引物；
24.(2)合成聚丙烯酰胺凝胶微珠，合成的同时加入通用引物，使通用引物偶联到聚丙烯酰胺凝胶微珠上；
25.(3)将bc1、bc1-rc退火，形成双链dna，退火后的bc1/bc1-rc双链dna通过dna连接酶连接到步骤(2)获得的聚丙烯酰胺凝胶微珠上；
26.(4)重复步骤(3)，依次将bc2/bc2-rc双链dna以及bc3/bc3-rc双链dna连接到聚丙烯酰胺凝胶微珠上；
27.(5)将步骤(4)获得的双链dna连结产物进行单链化处理，获得用于单细胞测序的功能化凝胶微珠。
28.优选的，步骤(2)中将丙烯酰胺、n,n'双(丙烯酰)胱胺、引发剂、通用引物和功能捕获核酸加入水中作为水相，包裹油、temed混合后作为油相，两者分别装入注射器中，与微流控芯片对应的入口端通道相连，通过控制水相和油相的流速来控制液滴生成的速率和尺寸，在微流控芯片的出口端收集生成的液滴乳浊液，在液滴乳浊液液面上覆盖矿物油，加热条件下放置8小时以上，加入pfo(全氟己基乙基醇)破坏液滴，释放聚合好的聚丙烯酰胺凝胶微珠。
29.优选的，步骤(5)中用150mm naoh、0.5％ brij-35的变性缓冲液处理双链dna连结产物，以使双链dna连结产物中的双链变性为单链。
30.本发明的有益效果如下：1.本发明的聚丙烯酰胺凝胶微珠软质富有弹性且体积适中，适用于市面上常用的微流控芯片通道尺寸，凝胶微珠可单独占满一条通道且整齐排列，不容易发生通道的堵塞；2.相比传统硬质微珠，能显著提高微液滴包裹单个微球和细胞的效率，更加适合用于基于液滴微流控技术的单细胞测序。3.通过独特的生化合成手段在每个凝胶微珠上均偶联了数百万到数千万个寡核苷酸用于捕获细胞内的转录本，并且合成的每个凝胶微珠上均携带有独特的细胞标签序列用于区分单个细胞的转录本；4.这种凝胶微珠可以在有还原剂的存在条件下自行降解，不会干扰后续的微液滴内的反转录反应，而且凝胶珠上的寡核苷酸在还原剂的存在条件下也会释放出来，提高了对细胞内转录本的捕获效率。5.本发明的凝胶珠制备工艺操作简单，成本低廉，寡核苷酸偶联效率高，批间差异小，适合大规模量产。6.可根据自己的需求定制具有不同功能的凝胶珠，广泛应用于单细胞转录组学、表观遗传学、crispr筛选以及单细胞多组学等应用领域。
附图说明
31.图1聚丙烯酰胺凝胶微珠实物显微镜照片。
32.图2可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠尺寸分布直方图。
33.图3连结完整细胞标签序列聚丙烯酰胺凝胶微珠降解后毛细管电泳图。
34.图4连结完整细胞标签序列聚丙烯酰胺凝胶微珠变性为单链降解后毛细管电泳图。
35.图5连结完整细胞标签序列聚丙烯酰胺凝胶微珠荧光探针显微镜照片，用荧光基团标记的dna探针与凝胶微珠杂交，偶联有完整细胞标签序列的微珠可发出荧光，其他微珠则没有荧光。
36.图6为实施例3的聚丙烯酰胺凝胶微珠照片。
具体实施方式
37.通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例中未特别标注的浓度均为质量/体积比。
38.实施例1：可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠的制备。
39.在本实施例中，详细介绍了可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠的制备过程，具体实施方式如下：
40.表1试剂和材料
[0041][0042][0043][0044]
按照如下反应体系，配制丙烯酰胺和引物混合物溶液
[0045]
表2反应体系
[0046][0047]
然后将丙烯酰胺和引物混合物溶液装入3-ml注射器中，然后与微流控芯片对应的入口端通道连接。
[0048]
将2.5ml包裹油和10μl temed混合，来制备2.5ml包裹油-temed混合物，充分涡旋混合物，然后将混合物溶液装入3-ml注射器中，然后与微流控芯片对应的入口端通道连接。
[0049]
通过控制水相和油相的流速来控珠液滴生成的速率和尺寸，最后在微流控芯片的
出口端来搜集生成的液滴乳浊液。
[0050]
在液滴乳浊液液面上覆盖200μl矿物油，65℃条件下放置过夜(8小时以上)。
[0051]
弃去包裹油相和矿物油相，然后使用20％(vol/vol)pfo(in hfe 7500oil)破坏液滴，释放聚合好的聚丙烯酰胺凝胶珠。
[0052]
使用1％(vol/vol)span-80(in hexane)洗涤胶珠2次，然后再使用tbset buffer洗涤胶珠3次，最后使用70-μm细胞网筛过滤掉孔径较大的胶珠。制备好的胶珠储存在tet buffer(10mm tris-hcl(ph 8.0)，10mm edta，0.1％(vol/vol)tween-20)中，4℃条件下保存。制备好的胶珠在显微镜下进行镜检，并统计胶珠粒径大小，如图1和图2所示，制备好的胶珠大小均一，粒径集中在48μm左右。
[0053]
实施例2：可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠与特定寡核苷酸的连接
[0054]
在本实施例中，详细介绍了可降解聚丙烯酰胺凝胶微珠与特定寡核苷酸的连接过程，具体实施方式如下：
[0055]
合成表3中所示的核酸，冻存备用。
[0056]
表3所用到的核酸序列
[0057][0058]
其中x与x`、y与y`、z与z`互为反向互补序列，代表4-8bp预先设计好的序列。
[0059]
ithiomc6-d是指合成引物时的中间修饰基团之一，即int hs-sh c6。
[0060]
n为a、t、c、g任意四种碱基之一；b为c、g、t三种碱基之一，v为a、c、g三种碱基之一。
[0061]
细胞标签序列是barcode 1oligo，barcode 2oligo，barcode 3oligo的x3部分；数字分子标签序列是barcode 3oligo的(n)12部分；功能捕获序列是ttttttttttttttttttttttttttttttvn；通用引物序列是uni-primer：/5`acryd//ithiomc6-d/ctacacgacgctctt；通过将细胞标签序列拆分成三段进行连结，通过随机组合的方式可实现数百万胶珠上偶联有特定的barcode，例如，各设计96条barcode1，barcode2，barcode3，即可实现96x 96x 96＝884,736种barcode；每个微珠上的数字分子标签序列不一样是因为数字分子标签序列是在合成的时候随机生成的，长度为12个碱基，理论上是有4
12
种，并且是在第三轮连接的时候引入的，由于其种类多，可保证每个微珠上的数字分子标签序列都不一样。
[0062]
由于uni-primer 5’带有acrydite(亚磷酸丙烯酰胺基团)修饰，其可以与丙烯酰胺单体一起在交联剂和引发剂的作用下发生共聚合作用，然后再通过微流控装置形成聚丙烯酰胺凝胶微珠。fam-nba30 probe是一个单链的寡核苷酸探针，可以与制备好的功能化凝胶珠的末端序列互补，由于其带有荧光修饰，可以通过微珠的荧光信号强度来质控连结的功能捕获序列的完整性好坏。
[0063]
下面列举了96条可用序列。
[0064][0065][0066]
表4试剂和材料
[0067][0068][0069]
(1)第一轮barcode1连接反应：
[0070]
在室温下解冻含有barcode 1和barcode 1
‑‑
rc的离心管，分别吸取各个编号一一对应的离心管(每管均已稀释成100μm)等体积混合均匀(混合后每条oligo的浓度为50μm)，然后按顺序分别加入到相应的96孔板内，做好标记，加上封膜,放入pcr仪中，进行退火,合成双链dsbc1，再使用多通道移液器分别从每管中吸取5μl到新的96孔板中。
[0071]
吸取1ml制备好的聚丙烯酰胺凝胶珠，分别用hbw buffer(10mm tris-hcl(ph 8.0)，0.1mm edta，0.1％(vol/vol)tween-20)和pre-ligation buffer(30mm nacl，10mm tris-hcl(ph 8.0)，0.1％(vol/vol)tween-20，1mm mgcl2)清洗三次，最后用pre-ligation buffer重悬，然后按下表配制反应体系：
[0072]
表5反应体系
[0073][0074]
使用多通道移液器吸取55μl上述hydrogel bead suspension到含有dsbc1的96孔板中，混合均匀。
[0075]
在15ml离心管中按下表配制以下试剂组分：
[0076]
表6反应体系
[0077][0078]
使用多通道移液器吸取40μl上述ligation mix到含有dsbc1的96孔板中，混合均匀。
[0079]
密封反应板并将其转移到恒温振荡仪上，在20℃下孵育1h，完成第一步连接反应。
[0080]
将反应板置于冰上冷却1分钟，去除密封膜。用移液器将96孔板每个孔中的反应液全部转移到同一个15-ml离心管中，并用40μl hbw buffer清洗每个孔，清洗液全部合并到15-ml离心管中，重复上述步骤，进行后续的第二轮barcode 2和第三轮barcode3连接反应。
[0081]
完成上述三轮连接反应后，将双链dna连结产物进行单链化，具体步骤如下：
[0082]
(1)将经过三轮barcode连结的聚丙烯酰胺凝胶珠合并到一起，1000g，4℃离心3min，弃上清，用denaturation buffer(150mm naoh,0.5％(vol/vol)brij-35)重悬，300g室温离心3min，再用denaturation buffer重悬，并在混匀仪上室温下孵育10min。用denaturation buffer洗涤3次，离心条件300g室温离心3min。
[0083]
2.然后在neutralization buffer(100mm tris-hcl ph 8.0，10mm edta ph 8.0，0.1％(vol/vol)tween-20，100mm nacl)中洗涤2次，离心条件300g室温离心3min，防止胶珠结块。
[0084]
最后在tet buffer中洗涤3次，离心条件1000g室温离心3min。变性好的含有单链化的寡核苷酸凝胶珠可储存在bead freezing buffer(150mm nacl,125mm tris-hcl ph 7.0,10mm mgcl2,4％(vol/vol)tween-20,0.75％(vol/vol)triton x-100,30％(vol/vol)glycerol,0.3％bsa)中于-80℃条件下长期保存。
[0085]
如图3、图4、图5所示，制备好的具有特定寡核苷酸序列的功能化凝胶珠在降解后进行毛细管电泳，显示的完整细胞标签序列的条带信号表面连结效率很高，同时荧光探针的显微镜照片表明荧光信号很强，且强度很均一，只有个别胶珠荧光信号很弱。
[0086]
实施例3：在还原剂存在条件下降解聚丙烯酰胺凝胶微珠
[0087]
在本实施例中，详细介绍了在还原剂存在条件下降解聚丙烯酰胺凝胶微珠的过程，具体实施方式如下：
[0088]
取制备好的聚丙烯酰胺凝胶微珠49μl，加入1μl 50mm二硫苏糖醇(终浓度为1mm)，枪头吹打混匀，然后吸取10μl于血球计数板上，立即置于显微镜下，计时并观察凝胶微珠溶解的过程，并且间隔一段时间进行拍摄，如图6所示，随着时间的进行，凝胶微珠逐渐溶解，到180s时，凝胶微珠基本不可见。
[0089]
综上，本发明开发了一种软质富有弹性且体积适中的功能化聚丙烯酰胺凝胶微珠用于单细胞测序，适用于市面上常用的微流控芯片通道尺寸，凝胶微珠可单独占满一条通道且整齐排列，不容易发生通道的堵塞；凝胶微珠的制备工艺操作简单，成本低廉，寡核苷酸偶联效率高，批间差异小，适合大规模量产。制备的凝胶微珠可广泛应用于单细胞转录组学、表观遗传学、crispr筛选以及单细胞多组学等应用领域。